麝香百合热激转录因子基因LlHsfA1的克隆与表达分析

园艺学报2014，41（7）：1400–1408 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@https://www.360docs.net/doc/836359703.html, 麝香百合热激转录因子基因LlHsfA1的克隆与表达分析

宫本贺1，易瑾1,2，隋娟娟1,3，吴健1，吴泽1，程运河1，吴晨雨1，

刘晨1，义鸣放1,*

（1中国农业大学观赏园艺与园林系，北京100193；2北京师范大学附属中学平谷第一分校，北京101204；3阜阳师

范学院生命科学学院，安徽阜阳236037）

摘要：利用RACE的方法从麝香百合?白天堂‘叶片中克隆出热激转录因子（Heat shock transcription factor，Hsf）A1家族中一个成员的cDNA 全长序列。该基因编码序列长为1 587 bp，编码528个氨基酸，

蛋白质分子量为59.056 kD。序列和进化树分析表明，该基因具有A1类Hsf的5个关键功能域和调控基

序，与水稻的OsHsfA1a氨基酸序列同源性最高，说明该基因为HsfA1家族的新成员，将其命名为L lHsfA1。

利用荧光定量PCR的方法分析LlHsfA1表达模式，结果表明常温下其可在根、鳞茎和叶片中表达，说明

该基因为组成型表达；42 ℃热激处理1 ~ 12 h，该基因的表达量在叶片中呈现―上升—下降‖交替变化的

趋势。亚细胞定位表明，LlHsfA1定位在细胞核和细胞质中。

关键词：麝香百合；热激转录因子；基因表达；亚细胞定位

中图分类号：S 682.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1400-09 Cloning and Expression Analysis of LlHsfA1from Lilium longiforum

GONG Ben-he1，YI Jin1,2，SUI Juan-juan1,3，WU Jian1，WU Ze1，CHENG Yun-he1，WU Chen-yu1，LIU Chen1，and YI Ming-fang1,*

（1 Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，C hina Agricultural University，B eijing100193，China；2 The High School Affiliated to Beijing Normal University，Pinggu First Branch，B eijing 101204，C hina；3 College

of Biology，F uyang Normal College，F uyang，A nhui236037，China）

Abstract：A novel member of class A1 heat shock transcription factors（Hsfs）in full length with 1 587 bp coding sequence encoding a protein of 528 amino acid residues with a molecular weight of 59.056 kD

was isolated from the leaves of Lilium longiforum?White Heaven‘via RACE method. Deduc ed amino acid sequence analysis and phylogenic tree showed the gene named LlHsfA1that had five critical domains and motifs，belonging to HsfA1 family and most closed to OsHsfA1a，was obviously different from each

HsfA1 from other species. Moreover，it was constitutively expressed in roots，bulbs and leaves by

qRT-PCR analysis under normal conditions. After 42 ℃heat shock，LlHsfA1 expression level showed an alternate trend of?rising and falling‘，remarkably up-regulated by heat. The LlHsfA1-GFP fusion proteins

收稿日期：2014–01–06；修回日期：2014–05–08

基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（200903020）；农业部?948‘引进项目（2011-G17）

* 通信作者Author for correspondence（E-mail：ymfang@https://www.360docs.net/doc/836359703.html,）

7期宫本贺等：麝香百合热激转录因子基因LlHsfA1的克隆与表达分析1401

were observed to be located in the nucleus and cytoplasm.

Key words：L ilium longiforum；heat shock transcription factor；gene expression；subcellular location

百合（L ilium）品种繁多，喜冷凉湿润气候，但耐热性较差。夏季的高温常导致百合植株瘦弱、败育、病虫害严重等，不仅影响切花品质，而且引起种球退化（易瑾等，2012）。

植物在高温条件下，热激相关基因的表达量提高，其中的热激转录因子（heat shock transcription factor，Hsf）在热信号转导网络中起着主要的调节作用，它可以诱导热激蛋白（heat shock protein，Hsp）和其他热激相关基因的表达。热激蛋白的积累是热激反应的主要特征，它可以作为分子伴侣

协助其它相关蛋白重新折叠、积累、分配和降解，使得细胞免受热激的伤害（Al-Whaibi，2011）。根据Hsf寡聚域（HR-A/B）结构的不同可将其分为3类：HsfA、HsfB和HsfC（Nover et al.，2001；Baniwal et al.，2004）。目前功能较为明确的是A类Hsf，其C末端具有激活域（AHA），所以具备

转录功能，可诱导下游的热激蛋白、其它热激转录因子和热激诱导相关的代谢酶类的表达（Busch et al.，2005；Scharf et al.，2012），而B类和C类缺少激活域而无转录激活活性。植物的Hsfs成员众

多（von Koskull-D?ring et al.，2007）。已有的研究表明拟南芥中存在21个Hsf，番茄含有27个，目

前发现最多的是大豆，至少存在52个成员（Scharf et al.，2012）。其中番茄的HsfA1为组成型表达，在热激反应过程中起主要的调控作用（Mishra et al.，2002）。利用拟南芥knockout突变体也证明了AtHsfA1在热激条件下是主要的正调控因子（Liu et al.，2011；Yoshida et al.，2011）。另外在持续热激或?热激—恢复‘交替循环的条件下，且在HsfA1的诱导和配合下，HsfA2可成为主要的调节因

子（Scharf et al.，1998；Chan-Schaminet et al.，2009；Li et al.，2010）。过表达HsfA1植株的耐热性

提高（Mishra et al.，2002；Zhu et al.，2006）。

目前对百合热激转录因子的研究尚处于初始阶段，主要集中在LlHsfA2和A1类Hsf成员之一

的LlHSF1上（Xin et al.，2010；易瑾等，2012）。由于百合的基因组庞大，预计其Hsf成员众多，其Hsf参与的热激信号转导途径也十分复杂，百合体内还存在很多尚未被研究的Hsf，所以本研究

将重点集中在百合A1类Hsf的另一个成员LlHsfA1上，通过分析其表达模式，研究它与百合耐热性的关系，扩大了百合Hsf的研究范围，为进一步完善百合Hsf参与的热信号转导网络和通过分子手

段培育耐热性强的百合新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为中国农业大学观赏植物栽培生理与生物技术实验室保存的麝香百合（Lilium longiforum）品种?白天堂‘（?White Heaven‘）组培苗。培养条件为22 ℃，光照时间为16 h · d-1。

亚细胞定位使用的材料为紫皮洋葱。试验时间为2012年9月至2013年9月。

克隆载体pMD18-T和反转录酶M-MLV购自TaKaRa公司，大肠杆菌DH5α菌株购自全式金公

司，DNA纯化回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自百泰克公司，荧光定量试剂盒SYBR FAST qPCR Universal Kit购自KAPA公司（美国），引物由生工公司合成，基因测序由北京六合华大公司完成。

1.2 RNA提取与反转录

将继代培养40 d左右的百合组培苗进行42 ℃，3 h的热激处理，然后取0.1 g叶片用液氮速冻

后保存于–70 ℃，作为提取RNA的材料。RNA的提取根据天根公司多糖多酚植物总RNA提取试

1402 园艺学报41卷

剂盒说明书进行。用NanoDrop 2000 Spectrophotometer（Thermo，USA）检测吸光值（A260/A230和

A260/A280），用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

反转录根据TaKaRa公司的M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行，所用反转录接头引物为

AP（表1）。

表1 PCR所使用的引物

Table 1 Primers used in PCR

引物Primer 序列Sequence

PF1 TGGGARTTYGCVAAYGARGGHTT

PR1 GAATGAMATCATYTGYTKCTGHCGT

GSP1 TCCCAAAATGCACCCAACCA

GSP2 GAGCTACAGAACTTAGTCCAACGA

GSP3 TTCACGATGTTGCGGTTGGTT

GSP4 TGGTTGGGTGCATTTTGGGA

GSP5 ATGGAAGACGCCGTTGTCGGG

GSP6 TCACATTCTCCTCTCCGATGTAAGCAG

Hin dⅢ_for. CCCAAGCTTATGGAAGACGCCGTTGT

PstⅠ_rev. AACTGCAGCATTCTCCTCTCCGATGTAA

AP GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT(18)

AP1 GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG

AP2 CGCTACGTAACGGCATGACAGTG

5′RACE outer primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG

5′RACE inner primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA

qF1 ATGGGAAGTGTCTATGTGGGG

qR1 CATTGATACTTGGCAGTTGTTGG

18S-qF2 AGTTGGTGGAGCGATTTGTCT

18S-qR2 CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC

1.3 基因全长的克隆

基因保守片段的克隆：将GenBank中其他植物HsfA1基因用DNAMAN进行序列比对，根据其

保守片段设计一对兼并引物PF1和PR1，以反转的cDNA第1链为模板进行目的基因保守片段的克

隆。反应程序为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，45 ℃30 s，72 ℃30 s，5个循环；94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，30个循环；72 ℃10 min。

基因3′端序列的克隆：以反转录产物为模板，根据已经克隆的目的基因保守片段设计两条正向

特异引物GSP1和GSP2，与两条反向的3′接头特异引物AP1和AP2进行巢式PCR扩增。第1轮

PCR扩增以GSP1和AP1为外轮引物，PCR反应程序为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃

1 min 30 s，33个循环；7

2 ℃10 min。取第1轮产物1 μL作为第2轮的模板，第2轮引物为GSP2

和AP2，PCR反应程序为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min 30 s，33个循环；72 ℃

10 min。

基因5′端序列的克隆：根据TaKaRa公司5′-Full RACE kit说明书进行，以Random 9 mers为引

物进行反转录。根据目的基因的保守片段设计两条反向特异引物GSP3和GSP4，与试剂盒自带的两

条5′端接头引物进行巢式PCR扩增。第1轮扩增以GSP3和5′RACE Outer primer为引物进行外轮

PCR反应，反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃50 s，20个循环；72 ℃10 min。然后取第1轮产物1 μL作为第2轮的模板，第2轮以GSP4和5′RACE Inner primer为引物进行PCR

反应，反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃50 s，33个循环；72 ℃10 min。

基因编码序列的校正：用DNAMAN软件对已经获得的目的基因5′片段、中间片段和3′片段进

行序列拼接，并在NCBI网站上预测其开放阅读框（ORF），根据ORF两端序列设计扩增编码区的

7期宫本贺等：麝香百合热激转录因子基因LlHsfA1的克隆与表达分析1403

上下游特异引物GPS5和GPS6。以cDNA反转的第1链为模板，以GPS5和GPS6为引物用扩增保

守性较高的PrimeSTAR? HS DNA Polymerase（TaKaRa）进行目的基因CDS序列的扩增。反应程序

为：98 ℃5 min；98 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min 40 s，33个循环；72 ℃10 min。

PCR扩增产物纯化回收后连接到克隆载体pMD18-T上，并转化至大肠杆菌DH5α中，提取质

粒后由北京六合华大公司进行测序。

1.4 蛋白序列与进化树分析

根据目的基因编码区全长序列，用Primer Premier 5软件对其编码的氨基酸序列进行翻译，然后

用在线工具ProtParam预测该蛋白的分子量和等电点，用InterPro分析蛋白的结构特征。用NCBI

的BLAST工具对该蛋白的序列进行比对分析，从结果中选出同源性较高的其他植物的HsfA1氨基

酸序列，用DNAMAN5.0软件进行多重比对，然后用MEGA5.0软件对这些植物的HsfA1进行系统

进化树分析。

1.5 L lHsfA1的表达分析

选择继代培养40 d左右生长良好且外观较为一致的百合组培苗作为基因表达分析的材料。

目的基因在不同组织中的表达：分别取常温（22 ℃）下百合组培苗的根、鳞茎和叶片各0.1 g

提取RNA。

目的基因在不同热激处理时间下的表达：用42 ℃热激百合的组培苗，在处理1、2、3、6、9

和12 h分别取叶片0.1 g提取RNA，同时以常温（22 ℃）为对照。

采用荧光定量PCR的方法研究目的基因的表达。根据已获得的基因全长序列设计一对特异引物

qF1和qR1，片段大小为130 bp。以18S基因作为内参（易瑾等，2012），参照KAPA SYBR FAST qPCR Universal Kit荧光定量试剂盒说明书，用Applied Biosystems Step One system荧光定量PCR仪，

对目的基因的表达进行检测。采用2-ΔΔCT方法（Schmittgen & Livak，2008）分析基因的相对表达量。每个样品进行3次生物学重复。

荧光定量PCR扩增条件为：95 ℃3 min；95 ℃3 s，56 ℃30 s，72 ℃20 s，40个循环。用Excel 软件对数据进行分析。

1.6 LlHsfA1的亚细胞定位

根据LlHsfA1的序列设计带有酶切位点的引物Hin dⅢ_for.和PstⅠ_rev.，对其编码序列进行扩增，然后将扩增产物插入pCAMBIA1300-GFP载体的Hin dⅢ/P stⅠ酶切位点之间，获得pCAMBIA1300- LlHsfA1-GFP重组表达载体。利用基因枪轰击法对洋葱表皮进行轰击（徐淑平和卫志明，1998），28 ℃孵育24 h后用共聚焦显微镜（Nikon Eclipse TE2000-E）进行观察和拍照，并用EZ-C1 software软件

对照片进行分析和处理。

2 结果与分析

2.1 百合LlHsfA1cDNA全长序列的克隆

从42 ℃热激3 h后的叶片中提取总RNA，经过反转录合成cDNA第一链，以该cDNA为模板，

根据其他植物HsfA1基因的保守序列设计兼并引物进行PCR扩增，得到目的基因的中间片段（312 bp），利用RACE方法获得该基因的3′序列（1 451 bp）和5′序列（520 bp），利用DNAMAN5.0进

行序列拼接得到其全长2 128 bp，其中编码区序列长为1 587 bp，编码528个氨基酸（图1）。

1404 园艺学报41卷

图1 百合LlHsfA1不同引物扩增片段的琼脂糖电泳检测

M：DL2000 marker；A：兼并引物PCR产物片段；B：3′RACE产物；C：5′RACE产物；D：编码序列产物。

Fig. 1 Detection by agarose gel electrophoresis of LlHsfA1amplified from lily with different primers M：DL2000 marker；A：Degenerated primers PCR product；B：3′RACE product；C：5′RACE product；D：Coding sequence product.

2.2 百合LlHsfA1蛋白序列与进化树分析

用InterPro和NCBI的Conserved Domains工具对其蛋白进行分析表明，它属于典型的Heat shock factor (HSF)-type家族，具有螺旋—转角—螺旋为特征的DNA-binding domain（DBD）。将LlHsfA1的蛋白序列与拟南芥、水稻等植物的蛋白序列进行多重比对（图2）表明，LlHsfA1具有A1类Hsf 5

图2 百合LlHsfA1与其他植物HsfA1氨基酸序列同源性分析

AtHsfA1a：拟南芥AT4G17750；AtHsfA1b：拟南芥AT5G16820；OsHsfA1a：水稻NP_001051938；

SlHsfA1a：番茄XP_004242136；LlHsfA1：百合KF870404。

Fig. 2 Alignment of the predicted amino acid sequences of LlHsfA1 and HsfA1s of other plants

AtHsfA1a：A rabidopsis thaliana AT4G17750；AtHsfA1b：Arabidopsis thaliana AT5G16820；

OsHsfA1a：O ryza sativa NP_001051938；SlHsfA1a：Solanum lycopersicum XP_004242136；

LlHsfA1：L ilium longiforum KF870404.

7期宫本贺等：麝香百合热激转录因子基因LlHsfA1的克隆与表达分析1405

个典型的功能域和调控基序，其中DNA结合域（DBD）高度保守，寡聚域（HR-A/B）次之，而核

定位信号（NLS）、激活域（AHA）和核输出信号（NES）则存在一定的变异性，因此初步判断该基因为HsfA1家族中的新成员。利用ProtParam在线工具预测LlHsfA1蛋白的分子量为59.056 kD，等

电点为4.89。

将百合LlHsfA1和其他植物的同源基因氨基酸序列，用MEGA5.0软件构建系统进化树，结果（图3）表明，百合HsfA1与水稻、高粱和大麦的同源基因属于同一进化分支，DNAMAN软件分

析表明它们之间同源性分别为45.92%、43.23%和38.76%，这与Blast结果相吻合。因此，判断所克

隆得到的基因为HsfA1家族的新成员，将其命名为LlHsfA1（登录号：KF870404）。

图3 百合LlHsfA1蛋白与其它植物HsfA1的进化树

Fig. 3 Phylogenetic tree of LlHsfA1 and other plants HsfA1s

2.3 百合LlHsfA1的表达模式分析

分别利用常温条件下和热激处理1 ~ 12 h条件下的百合组培苗，研究了LlHsfA1在不同器官中和同一热激条件下的表达量。

如图4所示，常温（22 ℃）条件下百合根、鳞茎和叶片中LlHsfA1均有表达，其中叶片中的表达量最高，根中次之，鳞茎中最少。据报道（易瑾等，2012）百合另一个A1类成员LlHSF1在根中的表达量最少，在叶片中最高。L lHsfA1在叶片中的表达量约为根中的3.1倍，约为鳞茎中的4.4倍。

用42 ℃进行热激处理后（图5），百合叶片中LlHsfA1的相对表达量总体上呈现出―上升—下降‖交替的趋势，但始终高于对照。其中热激处理1 ~ 2 h内表达量持续升高，2 h时达到高峰，约

为对照的4.3倍；热激2 ~ 6 h阶段表达量下降，随后上升，9 h时出现第2个高峰，约为对照的3.3

倍，随后又下降。这与LlHSF1在热激1 ~ 12 h内的表达模式完全不同，LlHSF1表现出持续增加的趋势（易瑾等，2012），这说明两个基因在热信号转导途径中的作用和调控模式可能存在差异。

1406 园 艺 学 报 41卷

图6 重组表达载体的双酶切检测 M ：DL2000 plus marker ；A ：重组质粒的双酶切检测。 Fig. 6 Detection of recombinant expression plasmid by double enzyme digestion M ：DL2000 plus marker ；A ：Detection of recombinant plasmid by restriction digestion.

2.4 百合LlHsfA1的亚细胞定位

将构建的重组质粒pCAMBIA1300-

LlHsfA1-GFP 进行双酶切检测（图6），所得条

带符合 LlHsfA1 编码区序列大小，表明载体构

建成功，可用于亚细胞定位试验。

利用基因枪法对洋葱表皮进行轰击，24 h

后用共聚焦显微镜观察LlHsfA1-GFP 融合蛋

白的瞬时表达情况。如图7所示，在洋葱表皮

细胞的细胞核和细胞质中均检测到GFP 荧光

信号，说明LlHsfA1定位在细胞核和细胞质

中。

图7 LlHsfA1蛋白的亚细胞定位

Fig. 7 Subcellular localization of LlHsfA1 protein

3 讨论

植物的热激转录因子是一个庞大且复杂的家族，每一个Hsf 都有其自身的功能，但在整个热信

图4 LlHsfA1 在不同组织中的表达量

Fig. 4 LlHsfA1 expression level in various tissues 图5 百合叶片不同热激时间 LlHsfA1 的表达量 Fig. 5 L

lHsfA1 expression level in leaves at different time at 42 ℃

7期宫本贺等：麝香百合热激转录因子基因LlHsfA1的克隆与表达分析1407

号转导网络中又相互配合、相互影响（Scharf et al.，2012）。已证明，番茄和拟南芥的HsfA1在热信号转导途径中起主要的调控作用，它可以诱导下游众多基因的表达，使植株产生耐热性（Mishra et al.，2002；Liu et al.，2011；Yoshida et al.，2011）。拟南芥的HsfA1含有4个成员，分别是HsfA1a、HsfA1b、HsfA1d和HsfA1e，这4个成员诱导靶基因表达的前提是必须形成同源或异源的三聚体，

才能结合在靶基因启动子的热激元件（Heat shock element，HSE）上（Li et al.，2010；Yoshida et al.，2011）。在持续热激或重复热激阶段，HsfA1与HsfA2可通过寡聚化形成超级激活复合体，从而增

强热激基因的表达（Scharf et al.，1998；Chan-Schaminet et al.，2009；Li et al.，2010）。百合的基因组庞大，其体内存在的Hsfs预计有数十个。目前已经克隆得到百合的LlHsfA2和A1类Hsfs的一个

成员LlHSF1（Xin et al.，2010；易瑾等，2012），它们均为A类Hsf但分属于两个亚家族。本试验

中所克隆的LlHsfA1基因，经过多重序列比对分析表明具有A1类Hsf的5个完整的功能域，而且与LlHSF1的核酸序列通过DNAMAN分析表明，二者只有23.67%的同源性，说明LlHsfA1是一个与LlHSF1不同的HsfA1家族新成员。但目前得到的百合的这两个HsfA1家族成员LlHsfA1和LlHSF1，能否像拟南芥HsfA1类成员间彼此可以形成同源或异源的三聚体，以及HsfA1与HsfA2间能否形成

超级激活复合体，还需要进一步验证。

对常温下不同器官中LlHsfA1的表达分析表明，该基因为组成型表达与L lHSF1一致（易瑾等，2012），符合HsfA1家族的特征，而LlHsfA2则为诱导表达（Xin et al.，2010）。LlHsfA1在百合不同

器官中均可以检测到其表达，但表达量不同，说明LlHsfA1在百合的这3种器官中均存在，但表达

量具有组织特异性，这一点与LlHSF1（易瑾等，2012）也是一致的；不同的是LlHsfA1在鳞茎中

表达量最少，而LlHSF1在根中最少。在连续热激处理1 ~ 12 h后，LlHsfA1的表达量被热激处理显

著上调，推测其在百合的热激胁迫过程中发挥重要的作用。但该基因的表达量表现出―上升—下降‖

交替的变化趋势，与LlHSF1在相同热激条件下表现出持续增加的表达模式（易瑾等，2012）不同。分析其可能的原因是，在热激初始LlHsfA1的表达上调激活下游与热激相关蛋白的表达，随着热激

时间延长，这些蛋白的表达达到一定丰度后可能对LlHsfA1具有反馈抑制作用，但随着热激胁迫程

度的进一步加深，这些被激活表达的蛋白又不断消耗，它们对LlHsfA1的反馈抑制作用随之减小，

所以LlHsfA1的表达量又得以回升，而且不同的HsfA1成员在热激胁迫过程中所起的作用可能存在

差异，从而导致其表达模式不同。前人报道了玉米等植物的HsfA1类不同成员的表达模式也存在差

异（Lin et al.，2011；Giorno et al.，2012），可见这可能是植物HsfA1类成员普遍的特征。

与拟南芥的AtHsfA1b和AtHsfA1e（Yoshida et al.，2011）相似，百合LlHsfA1也定位在细胞

核和细胞质中，这得益于LlHsfA1功能域中同时有核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）的存在，使得其可以穿梭于细胞核和细胞质中。热激转录因子的分布与其功能的发挥密切相关，作为转

录因子，细胞核中的HsfA1可以与其他因子相互配合共同激活靶基因的表达，而细胞质中存在的

HsfA1可能处于钝化或活性较低的状态，不具备转录的功能或具有其他功能。

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