分子生物学简答题

1阐述操纵子（operon）学说：

A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、半乳糖苷透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因

B1 Z ,Y,A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码

2该mRNA分子的启动区位于阻遏基因和操纵基因之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达

3操纵区是DNA上的一小段序列，是阻遏物的结合位点

4遏物与操纵区结合时lacmRNA 的转录起始受到抑制

5诱导物与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵子区相结合，从而激发lacmRNA的合成。就是说诱导物存在时，操纵区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的转录

2、乳糖操纵子的作用机制？/简述乳糖操纵子的结构及其正、负调控机制

答：A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。C、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。D、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

3、基因调控的水平有哪些？基因调控的意义？

答：a、DNA水平的调控。b、转录水平上的调控。c、转录后的调控。d、翻译水平的调控。e、细胞质与基因调控。

意义：适应物理，化学等环境因素变化，调节代谢，维持细胞生长与分裂。

4、简述乳糖操纵子的结构及其正负调控机制。

答：结构：A、Y和Z，以及启动子、控制子和阻遏子。

正调控机制：CAP分解代谢产物激活蛋白质，直接作用于操纵子区上与cAMP结合形成CAP-cAMP复合物，转录进行。

负调控机制：a、无诱导物时结构基因不转录。b、有诱导物时与阻遏基因相结合，形成无活性阻遏物，RNA聚合酶可与启动子区相结合，起始基因转录。

5、基因调控的水平有哪些？基因调控的意义？

答：a、DNA水平的调控。b、转录水平上的调控。c、转录后的调控。d、翻译水平的调控。e、细胞质与基因调控。

意义：适应物理，化学等环境因素变化，调节代谢，维持细胞生长与分裂。

6、简述乳糖操纵子的结构及其正负调控机制。

答：结构：A、Y和Z，以及启动子、控制子和阻遏子。

正调控机制：CAP分解代谢产物激活蛋白质，直接作用于操纵子区上与cAMP结合形成CAP-cAMP复合物，转录进行。

负调控机制：a、无诱导物时结构基因不转录。b、有诱导物时与阻遏基因相结合，形成无活性阻遏物，RNA聚合酶可与启动子区相结合，起始基因转录。

7、简述操纵子学说。

答：是关于原核生物基因结构及其表达调控的学说，以乳糖操纵子为例，其主要内容为：

a、Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。

b、该mRNA分子的启动区位于阻遏基因与操纵区之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效建立。

c、操纵区是DNA上的一小段序列，是阻遏物的结合位点。

d、当阻遏物与操纵区相结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。

e、诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵区相结合，从而激发lacmRNA的合成。即有诱导物存在时，操纵区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA转录。

8简述Trp操纵子的结构及其调控机制。

答：Trp操纵子由5个结构基因TrpE、TrpD、TrpC、TrpB、TrpA组成一个多顺因子的基因簇，在5'端是启动子、操纵子、前导顺序和弱化子区域。

机制：a、辅阻蛋白参与的负调控阻遏调节。/、trp诱导物含量高，与游离的辅阻遏蛋白相结合，形成有活性阻遏物，与操纵子区DNA紧密结合，进行转录。//、trp诱导物含量低，不能与辅阻遏物结合，辅阻遏物从O区上解离，trp操纵子阻遏转录进行。

b、弱化作用。/、trp浓度高时，2-3不配对，3、4区自由配对形成茎环状终止结构，转录停止。//、trp浓度低时，2,3配对，4区片段无配对，结构基因转录。

9细菌的trp操纵子为什么除需要阻遏体系外还需要弱化系统。

答：细菌的trp操纵子通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，而对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来，阻遏作用的信号是细胞内trp的多少，弱化作用的信号是细胞内载有trp的tRNA的多少，两种作用相辅相成，体现周密的调控作用。

10、简述原核生物转录后调控的机制。

答：a、mRNA自身结构元件对翻译起始的调节。b、mRNA稳定性对转录水平的影响。c、调节蛋白的调控作用。d、反义RNA的调节作用。e、稀有密码子对翻译的影响。f、重叠基因对翻译的影响。g、翻译的阻遏。h、魔斑核苷酸水平对翻译的影响。

11、简要概括真核生物基因表达调控的7个层次

答：a、转录水平的调控，包括基因的开与关和转录效率的高与低。

b、DNA水平上的表达调控，包括基因丢失、扩增、交换、重排、DNA甲基化。

c、转录水平的调控，顺式作用元件与特异转录因子结合影响转录，反式作用因子能识别结合于顺式作用元件上，参与调控。

d、反式作用因子的DNA识别域或结合域。

e、蛋白质修饰、磷酸化和去磷酸化。

f、转录后水平的调控。

g、翻译水平的调控mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成起始mRNA5'端帽子结构及polyA尾巴，mRNA稳定性与基因表达调控，蛋白质的修饰。

12、真核基因表达调控与原核生物有什么异同点。

答：同：a、都有转录水平上调控和转录水平后调控，并且都以转录水平上的调控为重要。

b、在结构基因的上下游都存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否，调控基因的转录。

异: a、真核基因表达调控环节多，位点多，区域大，位置多样化。

b、真核基因的转录与染色质的结构变化相关。

c、无操纵子和衰减子。

d、受环境影响小。

e、以正性调控为主。

f、调控的基因组很大，而原核基因组小。

13、简述DNA水平对真核基因表达的调控。

答：DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，包括基因丢失，扩增，重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。

主要有：a、染色质状态对基因表达调控。b、修饰作用（乙酰化甲基化）与染色质状态的关系。c、基因丢失，扩增，重排，交换。

14、真核基因顺式作用元件及各自的特点。

答：a、启动子，位于转录起始点附近且为转录起始所必需的DNA序列。/、核心启动子，指保证RNA聚合酶2转录正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括转录起始位点及位点上游-30-负25bp处的TATA区。//、上游启动子元件，包括通常位于-70bp附近的CAA T区和GC区等能通过TF2D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。

b、增强子，指能使与之连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，位于离转录起始点较远位置上，具有参与激活和增强起始功能的序列元件。

c、绝缘子，负调控作用元件（与增强子作用相反）。

15、反式作用因子的DNA结合域有哪几种？各自的结构特点？

答：a、螺旋-转折-螺旋结构（HTH）。这类蛋白质分子中有至少两个α螺旋，中间由短侧连氨基酸残基形成“转折”，近羧基端的α螺旋中AA残基的替换会影响该蛋白在DNA双螺旋大沟中的结合。

b、锌指结构。由小组保守的AA和锌离子结合，在蛋白中形成了相对独立的功能域，像一根根收支伸向DNA大沟。

c、碱性-亮氨酸拉链。C/EBP家族蛋白的羧基端35个AA残基具有能形成α螺旋的特点，其中每隔6个AA就有一个亮AA拉链，导致第七个亮AA残基都在螺旋的同一方向出现，这类蛋白都以2聚体形式与DNA结合，两个蛋白α螺旋上的亮AA-侧基形成拉链型2聚体的基础。

d、碱性-螺旋-环-螺旋，（BHLH结构）。羧基端100-200个AA残基可形成两个双性α螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开，蛋白质的氨基端则是碱性区，其DNA结合特性与亮AA拉链类蛋白相似。

e、同源域蛋白。同源域是指编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，广泛存在真核生物基因组内，该遗传位点的基因产物决定了躯体发育。

16、真核基因转录调控的主要模式

答：启动子、转录模板、RNA聚合酶2、RNA聚合酶2基础转录所需的蛋白质因子、增强子及绝缘子对转录的影响、反式作用因子对转录的影响。

17、简述DNA加工水平对基因表达的调控

答：RNA加工水平：a、rRNA加工成熟，包括分子内的切割和化学修饰（主要是核糖甲基化）。b、mRNA加工成熟，包括mRNA5’末端加“帽子”，3’端加上polyA尾巴。c、tRNA的3 ’末端CCA-OH，5’端加上甲基鸟苷酸。

翻译水平：a、真核生物mRNA“扫描模式”与蛋白质合成的起始。b、mRNA的稳定性与基因表达的调控。c、mRNA5'端帽子结构的识别与蛋白质的合成。d、可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控

14、简述Trp操纵子的结构及其调控机制。

答：Trp操纵子由5个结构基因TrpE、TrpD、TrpC、TrpB、TrpA组成一个多顺因子的基因簇，在5'端是启动子、操纵子、前导顺序和弱化子区域。

机制：

a、辅阻蛋白参与的负调控阻遏调节。/、trp诱导物含量高，与游离的辅阻遏蛋白相结合，形成有活性阻遏物，与操纵子区DNA紧密结合，进行转录。//、trp诱导物含量低，不能与辅阻遏物结合，辅阻遏物从O区上解离，trp操纵子阻遏转录进行。

b、弱化作用。/、trp浓度高时，2-3不配对，3、4区自由配对形成茎环状终止结构，转录停止。//、trp浓度低时，2,3配对，4区片段无配对，结构基因转录。

15、细菌的trp操纵子为什么除需要阻遏体系外还需要弱化系统。

答：细菌的trp操纵子通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，而对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来，阻遏作用的信号是细胞内trp的多少，弱化作用的信号是细胞内载有trp的tRNA的多少，两种作用相辅相成，体现周密的调控作用。

16、简述原核生物转录后调控的机制。

答：a、mRNA自身结构元件对翻译起始的调节。b、mRNA稳定性对转录水平的影响。c、调节蛋白的调控作用。d、反义RNA的调节作用。e、稀有密码子对翻译的影响。f、重叠基因对翻译的影响。g、翻译的阻遏。h、魔斑核苷酸水平对翻译的影响。

17、简要概括真核生物基因表达调控的7个层次

答：a、转录水平的调控，包括基因的开与关和转录效率的高与低。b、DNA水平上的表达调控，包括基因丢失、扩增、交换、重排、DNA甲基化。c、转录水平的调控，顺式作用元件与特异转录因子结合影响转录，反式作用因子能识别结合于顺式作用元件上，参与调控。d、反式作用因子的DNA识别域或结合域。e、蛋白质修饰、磷酸化和去磷酸化。f、转录后水平的调控。g、翻译水平的调控mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成起始mRNA5'端帽子结构及polyA尾巴，mRNA稳定性与基因表达调控，蛋白质的修饰。

18、真核基因表达调控与原核生物有什么异同点。

答：同：a、都有转录水平上调控和转录水平后调控，并且都以转录水平上的调控为重要。b、在结构基因的上下游都存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否，调控基因的转录。

异:a、真核基因表达调控环节多，位点多，区域大，位置多样化。b、真核基因的转录与染色质的结构变化相关。c、无操纵子和衰减子。d、受环境影响小。e、以正性调控为主。f、调控的基因组很大，而原核基因组小。

19、简述DNA水平对真核基因表达的调控。

答：DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，包括基因丢失，扩增，重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。

主要有：a、染色质状态对基因表达调控。b、修饰作用（乙酰化甲基化）与染色质状态的关系。c、基因丢失，扩增，重排，交换。

20、真核基因顺式作用元件及各自的特点。

答：a、启动子，位于转录起始点附近且为转录起始所必需的DNA序列。/、核心启动子，指保证RNA聚合酶2转录正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括转录起始位点及位点上游-30-负25bp处的TA TA区。//、上游启动子元件，包括通常位于-70bp附近的CAAT 区和GC区等能通过TF2D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。

b、增强子，指能使与之连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，位于离转录起始点较远位置上，具有参与激活和增强起始功能的序列元件。

c、绝缘子，负调控作用元件（与增强子作用相反）。

21、反式作用因子的DNA结合域有哪几种？各自的结构特点？

答：a、螺旋-转折-螺旋结构（HTH）。这类蛋白质分子中有至少两个α螺旋，中间由短侧连氨基酸残基形成“转折”，近羧基端的α螺旋中AA残基的替换会影响该蛋白在DNA双螺旋大沟中的结合。

b、锌指结构。由小组保守的AA和锌离子结合，在蛋白中形成了相对独立的功能域，像一根根收支伸向DNA大沟。

c、碱性-亮氨酸拉链。C/EBP家族蛋白的羧基端35个AA残基具有能形成α螺旋的特点，其中每隔6个AA就有一个亮AA拉链，导致第七个亮AA残基都在螺旋的同一方向出现，这类蛋白都以2聚体形式与DNA结合，两个蛋白α螺旋上的亮AA-侧基形成拉链型2聚体的基础。

d、碱性-螺旋-环-螺旋，（BHLH结构）。羧基端100-200个AA残基可形成两个双性α螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开，蛋白质

片段，广泛存在真核生物基因组内，该遗传位点的基因产物决定了躯体发育。

22、真核基因转录调控的主要模式

答：启动子、转录模板、RNA聚合酶2、RNA聚合酶2基础转录所需的蛋白质因子、增强子及绝缘子对转录的影响、反式作用因子对转录的影响。

23、简述DNA加工水平对基因表达的调控

答：RNA加工水平：a、rRNA加工成熟，包括分子内的切割和化学修饰（主要是核糖甲基化）。b、mRNA加工成熟，包括mRNA5’末端加“帽子”，3’端加上polyA尾巴。c、tRNA的3 ’末端CCA-OH，5’端加上甲基鸟苷酸。

翻译水平：a、真核生物mRNA“扫描模式”与蛋白质合成的起始。b、mRNA的稳定性与基因表达的调控。c、mRNA5'端帽子结构的识别与蛋白质的合成。d、可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控

24什么是有意义链、反义链？

意义链：与mRNA序列相同的那条DNA链，又叫编码链

反义链：另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链，又叫模板链

25生物体内主要有几种RNA？

m RNA：编码特定蛋白序列

r RNA：直接参与核糖体中蛋白质的合成

t RNA：能特异性解读m RNA中的遗传信息，将其转化成相应的氨基酸后加入多肽链中

Sn RNA：小核RNA，是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体的主要成分.

Hn RNA：指导RNA，核酶RNA

26转录包括哪几个基本过程？

1. 模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链互相作用与之相结合的过程

2. 转录起始：RNA链上第一个核苷酸链的产生

3. 转录延伸：RNA聚合酶释放σ因子离开启动子后，核心酶沿模板DNA链移动并使新生RNA链不断伸长

4. 转录终止：RNA—DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，RNA聚合酶和RNA链从模板上释放出来

27简述大肠杆菌RNA聚合酶的亚基组成及其主要功能

答：大肠杆菌主要由

2个α亚基：核心酶组装，启动子识别，

1个β’亚基，1个β亚基：两种亚基共同组成RNA合成的活性中心，受K酶抑制

（β’亚基与模板结合）

1个ω亚基：功能未知

1个σ亚基：识别不同的启动子，促进转录的起始

28简述真核细胞RNA聚合酶的细胞定位及其转录产物

答：RNA聚合酶Ⅰ，细胞内定位核仁，转录产物是除了5S rRNA的各种rRNA

RNA聚合酶Ⅱ，定位核质，产物hnRNA、mRNA

RNA聚合酶Ⅲ，定位核质，产物tRNA、5s RNA、Sn RNA

29什么是启动子？什么是转录单元？什么是增强子？

答：启动子：是DNA转录起始信号的一段序列，能指导全酶与模板正确结合，并活化酶，使之具有起始特异性转录形成

转录单元：一段可被RNA聚合酶转录成一条连续mRNA链的DNA，从启动子开始至终止子结束的DNA序列。

增强子：能强化转录起始的序列，也叫强化子。

30简述原核和真核生物启动子的结构特点

答：原核生物：启动子在两段由5个核苷酸组成的共同序列，即位于—10bp处的TA TA区（也叫pribnow区），和—35bp处的TTGACA 区，他们是RNA聚合酶与启动子结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力

真核生物：启动子在—30~~—25bp处的Hogness区，类似pribnow区，在—70~~—80bp区有CAAT区（与—35区序列相对应），在—110~~—80的GC区（GCCACACCC或GGGCGGG序列）

31什么是SD序列？

答：原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸的保守区，能与16s rRNA的3’端反向互补

32简述真核生物mRNA的结构与原核生物mRNA的结构的区别

答：①、真核生物mRNA具有前体，需要转录后加工成成熟RNA才能与蛋白质合成

②、原核生物mRNA以多顺反子形式存在，一个mRNA可编码几个多肽；真核生物mRNA最多只能编码一个多肽

③、原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的polyA；而真核生物mRNA的5’端存在帽子结构，绝大多数正所

④、原核生物mRNA起始密码子AUG上游有SD序列的保守区

⑤、起始密码子原核生物的有AUG(有时GUG,UUG),真核生物只有AUG

33转录终止有几种机制？各有何特点？

答：①、依赖ρ因子的终止：ρ因子是一个由6个相同亚基组成的六聚体，具有NTP酶和解螺旋酶活性，能水解各种核苷酸三磷酸，通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录

②、不依赖ρ因子的终止：没有任何其他因子的参与，核心酶也能在某些位点终止转录，因模板DNA上存在终止转录的特殊信号——终止子

1.终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构

2.在终止位点前有一段4~8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止

34抗终止的方式主要有哪几种？

答：①、破坏终止位点RNA的茎—环结构：当介质中氨基酸浓度较低时，缺乏相应的氨酰—tRNA，致使核糖体滞留在串联密码子上，mRNA不能形成特定的二级结构，末端的茎—环结构被破坏，因此转录仍能继续下去，出现转录的抗终止现象

②、依赖于蛋白质因子的转录抗终止：蛋白质识别终止子附近DNA位点的二重对称序列转录产生的茎—环结构并与之结合，改变聚合酶的构象，使之对终止信号不敏感，继续催化RNA链的合成

35内含子的分类及剪接机制(含剪接信号、转酯反应等），各类内含子剪接过程的异同。

答：内含子的分类：GU—AG，AU—AC，Ⅰ类内含子，Ⅱ类内含子，Ⅲ类内含子，双内含子，pre—tRNA中的内含子。

Ⅰ类内含子的剪接主要是转酯反应，即剪接反应实际上是发生了两次磷酸二酯键的转移；

Ⅱ类内含子切除体系中，转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷，而是由内含子本身的靠近3’短的腺苷酸2’—OH作为亲核基因攻击内含子5’端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链后形成套索环结构，再由上游外显子的自由3’—OH作为亲核基因攻击内含子3’端的磷酸二酯键，使内含子被完全切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键键相连。发生了两次转酯反应。

Ⅲ类内含子主要依靠Sn RNP发生2次转酯反应，在哺乳动物中，mRNA前体上的Sn RNP是从5’向下游“扫描”悬着在分支点富嘧啶区3’下游的第一个AG作为剪接的3’位点。

剪接机制：组成型剪接：需要外界能量和各种酶形成复合物剪接；

自我剪接：不需外源酶和能量，剪接特征由35s RNA自我催化完成；

选择性剪接：同一前体mRNA中的外显子通过不同组合形成不同的成熟mRNA分子

36.RNA编辑的种类及意

答：种类：位点特异性脱氨基作用和引导DNA指导的尿嘧啶的插入或删除

意义：1、能够改变和补充遗传信息

2、增加基因产物的多样性

3、与生物细胞发育与分化有关

4、校正作用

5、翻译调控

37）简述遗传密码的基本特性

答：共有64个密码子，其中有1个起始密码子（AUG）和3个终止密码子（UAG,UAA,UGA）；具有通用性，即不论病毒、原核生物密码子的含义都是相同的；具有方向性，从N端到C端；两种密码子之间无任何核苷酸或其他成分加以分离，即密码子无逗号；具有简并性，即由一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象；每个密码子三联体决定一个氨基酸。

38）简述遗传密码的简并性及其生物学意义，遗传密码的通用性和特殊性。

答：1、简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并性。其意义：

①、可以减少有害突变；②、使物种较为稳定；③、密码子中的碱基被改变，任然能编码原来氨基酸的可能性大为提高。

2、通用性：遗传密码无论是体内还是体外，也无论是对病毒还是细菌、动物、植物而言，都是通用的。其意义：

①、有助于研究生物进化；②、通用性在遗传工程中得到充分运用

3、特殊性：虽然密码子是通用的，但也发现极少数的例外，如线粒体密码子，线粒体中的UGA不代表终止密码，而是编码Trp，由AUG和AUA两个密码编码甲硫氨酸，AGA和AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子

39）核糖体的组成结构及功能

答：组成结构：由大、小两个亚基，许多不同的核糖体蛋白质子和核糖体RNA共同组成，有3个tRNA的结合位点（A、P、E位点）功能：①、在多肽合成过程中，不同的tRNA将相应的氨基酸带到蛋白质合成部位，并与mRNA进行专一性的相互作用，以选择对信息专一的氨基酸—tRNA

②、核糖体容纳另一种携带肽链的tRNA，即肽酰—tRNA，并使之处于肽链容易生成的位置上。

③、核糖体小亚基负责对mRNA进行序列特异性识别；大亚基负责携带氨基酸以及tRNA的功能，包括肽键的形成，氨基酸—tRNA，

40）蛋白质前体的加工主要内容

答：1、N端f Met或Met的切除：N端的甲硫氨酸往往在多肽合成完毕之前被切除

2、二硫键的形成：蛋白质的二硫键是蛋白质合成后，通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的，密码子中没有胱氨酸的密码子。

3、特定氨基酸的修饰：氨基酸侧链的修饰包括磷酸化、糖基化、甲基化、已基化、羟基化和羧基化等。

4、切除新生肽链中的非功能片段：不少肽类激素和酶的前体都要经过加工才能变成活性分子

41）蛋白质转运的主要机制

答：1、翻译—转运同步机制：由信号肽介导协助转运。蛋白质其实首先合成信号肽——SRP与信号肽结合，翻译暂停——SRP与SRP 受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始——信号肽进入膜结构——蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行——蛋白质完全过膜，核糖体解离并回复翻译起始前状态。

2、翻译后转运机制：由前导肽介导协助转运，线粒体和叶绿体中的蛋白质。蛋白质由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与分子伴侣相结合形成转运多肽，通Tom和Tim组成的膜通道进入内腔——蛋白酶水解前导肽。

3、核定位蛋白的转运机制：细胞质中的蛋白质通过核孔到达细胞核（装配）——运回细胞质——进行转运。如：RNA，DNA聚合酶，组蛋白，拓扑异构酶等

42）信号肽的结构特征及功能

答：结构特征1、一般带有10~15个疏水氨基酸，位于蛋白质的N端；2、在靠近N端有一个或数个带正电荷的氨基酸；3、C端有一个能被信号肽识别的位点；4、没有严格的专一性；5、信号肽可能是一种环状结构，而非是以一种直线通过双脂层膜；（6、在C端靠近蛋白酶切点处常有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链；7、广义上的信号肽是初生蛋白质穿过膜必须的疏水性肽段，它位于蛋白质各部位。）

功能：1、保证蛋白质顺利转运；2、延伸功能；3、能和新生的分泌蛋白的信号肽相结合；4、能和位于膜上的蛋白受体相结合。

43）蛋白质合成的过程，参与因子等

答：【原核】1、氨基酸的活化：氨基酸+ATP+tRNA —（氨酰—tRNA合成酶）→AMP+PPi+AA—t RNA。起始氨基酸：fMet

2、翻译的起始：7种成分：30s小亚基，模板mRNA、fMet—tRNAfMet、起始因子IF-1、IF-2、IF-

3、GTP、50s大亚基、Mg2+。

三个步骤：①、30s小亚基+ IF-1，IF-3—（SD序列）→mRNA模板结合

②、fMet—tRNAfMet—（IF-2，GTP）→进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对

③、小亚基复合物（tRNA，mRNA，起始因子）+ 50s大亚基—（GTP水解）→释放起始因子。

3、肽链的延伸：第一个氨基酸fMet—tRNA与核糖体结合后就沿肽链延伸，包括后续AA—tRNA与核糖体结合，太贱的生成，移位。

4、肽链的终止：终止密码子出现在核糖体的A位时，没有相应的AA—tRNA能与之结合，释放因子能识别，并催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。

5、蛋白前体的加工：N端fMet或Met的切除，二硫键的形成，特定AA的修饰，切除新生肽键中的非功能片段

6、蛋白质的折叠

44）原核与真核生物蛋白质合成起始的差别

答：1、原核生物的起始tRNA是fMet—tRNAfMet，真核生物是Met—tRNAMet。

2、原核生物中30s小亚基先与mRNA模板相结合，最后与50s大亚基结合；而在真核生物中，40s小亚基首先与Met—tRNAfMet结合，再与模板mRNA结合，最后与60s大亚基结合生成80s?mRNA?Met—tRNAfMet起始复合物。

1、影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？

答：1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、

mRNA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。

2、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？

答：A、要求外源基因的编码区不能含有内含子；B、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动

子的下游，并形成正确的阅读框架；C、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16S rRNA3，末

端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。D、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内

蛋白酶快速降解，且对宿主无害。

4、正调控和负调控的主要不同是什么？

答：负调控时，调节基因的蛋白质产物是基因活性的一种阻遏物，而在正调控时，调节基

因的产物是一种激活物。

5、区别(1)启动子增效突变与启动子减效突变；(2)上游序列和下游序列。

答：(1)启动子内部的突变会增强或降低转录水平。(2)同启动子有关，下游序列同转录．

的方向一致；上游序列同转录方向相反。

6、解释为什么操纵子和启动子是反式隐性、顺式显性的，而编码阻碍蛋白的基因既是反式

答：操纵基因和启动子突变只影响顺式基因的表达(反式隐性的)，这是因为它们是调控序

列，仅仅调节相同DNA分子上的相邻基因的表达。阻遏物基因编码可以扩散的基因产物，

因此既能影响顺式又能影响反式基因的表达。

7、哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?

答：-35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA荣合酶起始位点)启动子序列和终止子

9、什么是安慰诱导物?

答：安慰诱导物是一种与天然诱导物结构相似的化合物，它虽然能诱导操纵子表达，但是它不能被操纵子基因产生的酶分解。在lac 操纵子中异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是乳糖的类似物能代替异乳糖作为诱导物，但不能作为β-半乳糖苷酶的底物进入代谢途径。

10、葡萄糖是如何影响涉及糖代谢的操纵子(葡萄糖敏感型操纵子)的表达?

答：在缺乏葡萄糖时，cAMP的水平升高，CAP蛋白同每一个葡萄糖敏感操纵子中启动子内的CAP位点结合，转录作用协同起始。如果有葡萄糖，cAMP的．水平下降，CAP蛋白不再结合，转录的速率协同下降。

12、讨论原核生物基因表达的聚合作用反应定向的重要性。假如核糖体从3’端到5’端读它的

模板mRNA的话，那么将会发生什么情况?

答：原核基因表达在空间和时间上是复杂和高度精细的过程。为了保持反应的自由碰撞，

转录和翻坪的定向是相当重要的。同时发生在两条链的5’→3’方向的环状DNA的复制开始

减慢，最后停止在特殊的终止序列上。翻译过程中，核糖体总是追赶着RNA聚合酶。由于

mRNA是单链分子而且容易被降解，因此翻译不可能发生在3'→5’的方向。

13、概括细菌细胞内的转录过程。

答：转录是通过RNA聚合酶(RP)的作用，以一条DNA链为模板产生一条单链RNA的过程。步骤如下：(1)与RP全酶的结合：一个RP全酶分子与待转录的DNA编码序列上游的启动子序列松弛地结合。(2)起始：RP往下游移动了几个核苷酸到达启动子的另一段短序列———Pribnow 框，紧密地与DNA结合。DNA上的启动子区域解链，RNA便从Pribnow框下游的几个核苷酸处开始合成，通常是DNA的反义链作为模板。合成几个核苷酸后，σ因子被释放并被循环使用，以下的步骤不再需要σ因子(3)延伸：四核心酶沿着DNA模板移动，使DNA解链，与DNA模板的下一碱基互补的核苷三磷酸聚合到链上。RP继续在DNA上移动，RNA链从模板链被释放出来，DNA双螺旋重新形成(4)终止：当所有编码序列被转录后，RP移到一个终止序列，即终止子。转录复合体解体，RP和新合成的RNA从DNA模板脱落下来。

1、阐述原核生物的转录终止。(1)转录终止的两种主要的机制是什么? (2)描述翻译怎样能调节转录终止。(3)为什么在细菌转录终止中很少涉及到Rho因子? (4)怎样能阻止转录的终止?

答：原核生物中的转录终止作用概要如下：(1)原核生物中两种不同的转录终止机制：①在某一位点不需要其他因子协助仅依赖于内在终止子的终止机制；②依赖于肋σ因子的终止机制。(2)翻译可通过弱化作用调节转录终止，例如发生在氨基酸生物合成基因的表达中。前导肽的翻译可以调节结构基因下游的转录。这种调节的重要性充分体现在氨基酸的生物合成中(例如色氨酸)。原核细胞中转录和翻译是同时发生的，正在翻译的核糖体就像在追赶正在转录的RNA聚合酶。具有所需氨酰tRNA时，核糖体可将前导序列翻译成前导肽，而在前导开放读码框的终止密码子处终止翻译。新生的mRNA自由形成3-4茎环(完全配对)终止结构，所以阻碍了DNA指导的RNA聚合酶的前进，结构基因的下游转录终止，即发生弱化现象。若某种氨基酸短缺，则会导致相应的氨酰tRNA短缺，核糖体终止在前导可读框中所短缺的氨基酸密码子上。2-3茎环形成抗终止子，这一茎环不是聚合酶的终止信号，它可以防止3-4茎环的形成，使结构基因的转录进行下去。(3)在原核生物中、转录与翻译是同时进行的，意味着核糖体追赶着DNA指导的RNA聚合酶。Rho因子是一个依赖于RNA的ATP水解酶，能够在转录过程中将在转录泡中的RNA-DNA杂合体分开。因此它顺着转录的方向(5’→3’)追赶DNA指导的RNA聚合酶。若核糖体正好妨碍了它的前进，则依赖于肋σ因子的终止反应不会发生。（4)最为常见的机制是抗终止(参见噬菌体遗传学)。抗终止于是一种能识别终止序列上游抗终止序列(例如λ噬菌体的nut位点)的蛋白质，它帮助抗终止子所利用的底物(如λ噬菌体基因表达中的Nus蛋白)与依赖DNA的RNA聚合酶的相互作用，通读下游的终止子序列。

3、区别可诱导和可阻遏的基因调控。

答：在可诱导的系统中，操纵子只有在诱导物存在时才开放，没有诱导物时阻碍物结合在操纵子上阻止结构基因的转录。存在诱导物时，它与阻遏物结合，使之变构不再与操纵子结合，打开操纵子。酶的诱导是分解途径特有的，诱导物就是酶的底物或者底物的类似物。在可阻碍系统中操纵子被终产物所关闭。不存在终产物时，阻碍物不能结合到操纵子上，因此操纵子开放；存在终产物时，它结合到阻碍物上，改变后者的构象，使其能结合到操纵子上，关闭操纵子。酶阻碍是合成代谢的特点。

1、真核细胞表达外源基因的条件？

答：首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；其次注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；最后要注意选择适当的选择标记。

2、简述真核生物转录水平的调控机制？

答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结

形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过程为：TFⅡD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFⅡD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFⅡD与TA TA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFⅡD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。B、反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用。3、转录起始的调控：⑴反式作用因子的活性调节：A.表达式调节——反式作用因子合成出来就具有活性；B.共价修饰——磷酸化和去磷酸化，糖基化；C.配体结合——许多激素受体是反式作用因子；D.蛋白质与蛋白质相互作用——蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。⑵反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。⑶反式作用因子的作用方式——成环、扭曲、滑动、Oozing。⑷反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。

3、简述真核生物转录后水平的调控机制？

答：（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的调控意义：5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。

（2）、mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用

（3）、mRNA运输的控制

4、受体的特点？

答：1、高度专一性；2、高度亲和性；3、可逆性；4、可饱和性；5、特定的作用模式

5、表皮生长因子介导的信号传导途径？

答：表皮生长因子受体是一个典型的蛋白酪氨酸激酶受体，这个信号转导途径的主要步骤是：

A、受体二聚化的形成及其磷酸化：表皮生长因子与受体的结合使受体发生二聚化，从而改变受体构象，使蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的几个蛋白酪氨酸残基在激酶的作用下发生磷酸化。

B、募集接头蛋白Grb2：表皮生长因子受体自身被磷酸化后，不仅其激酶活性增强，而且其构象发生变化，从而适合与含SH2结构域的蛋白分子相结合。Grb2是作为接头蛋白结合到受体上。

C、调控分子SOS的活化：SOS含有可与SH3结构域相结合的富含脯氨酸基序，当Grb2结合到磷酸化的表皮生长因子受体后，它的两个SH3结构域即可结合SOS，使之活化。

D、低分子量G蛋白Ras的活化：SOS可促进Ras释放GDP，结合GTP的反应，使Ras激活。活化的Ras作用其下游分子Raf，使之活化。Raf是MAPK级联反应的第一个分子，由此启动了MAPK的三级激活过程。

E、MAPK的级联激活：Raf是一种MAPKKK，它作用于MEK，使之磷酸化而激活，活化的MEK在作用于MAPK家族的ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三级激活。

F、转录因子的磷酸化及转录调控作用：活化的ERK可以转至细胞核内，使某些转录调控因子发生磷酸化，从而影响基因的转录。

6、cAMP信号转导途径？

答：1、组成：胞外信息分子（主要是胰高血糖素、肾上腺素和促肾上腺皮质激素），受体，G蛋白，AC，cAMP , PKA。

2、途径：

? 信号分子与受体结合，引起受体构象变化

? 受体活化G蛋白

? 活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶（AC）

? AC催化ATP生成cAMP

? cAMP活化PKA，PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达

7、简述IP3-Ca2+信号途径：

答案要点：信号分子与受体结合，引起受体构象变化，受体活化G蛋白，活化后的G蛋白激活PLC，PLC水解PIP2生成IP3 和DG，IP3 使钙通道打开，细胞内Ca2+升高，Ca2+与CaM结合，激活Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶，Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶使目标蛋白磷酸化。

8、原核生物与真核生物启动子的主要差别？

原核生物

TTGACA --- TATAAT------起始位点

-35 -10

真核生物

增强子---GC ---CAAT----TATAA—5mGpp—起始位点

9、比较原核生物与真核生物基因组结构的异同，并指出真核生物细胞的RNA内含子剪接的主要方式。

答案要点：主要从重复序列情况，有无内含子外显子方面论述，剪接的主要方式指GU-AG和AU-AC类内含子的间接以及I、II类内含子的间接方式。

10、比较原核生物与真核生物基因表达调控的异同点。

答案要点：共同点是两者主要是在转录水平进行调控；不同点是原核生物转录与翻译偶联，以操纵子调控的现象普遍；真核生物基因表达复杂，转录和翻译是分开的，转录后从细胞核进入细胞质，调控因此也比较复杂，在DNA水平、转录水平和翻译水平均存在。

1. 基因敲除的基本程序？

1. 答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。

A、打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。

B、胚胎干细胞的体外培养

C、打靶载体导入胚胎干细胞

D、同源重组胚胎干细胞的筛选

E、基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡

F、胚泡植入假孕小鼠的子宫中

G、杂交育种获得纯合的基因敲除动物

2、DNA芯片的原理？

答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。

3、PCR的反应条件？

答：A、PCR反应的缓冲液：

? Tris-HCl缓冲液

? KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。

? 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。

? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异

B、镁离子浓度一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。

C、底物浓度工作浓度20-200umol/L，dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。

D、Taq DNA聚合酶75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。

E、引物0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm 值有关，引物Tm值在55-80 ℃范围较为理想。

F、反应温度和循环次数

4、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？

答：（1）、常用的工具酶

A、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。

B、DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。

C、DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。

D、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。

E、末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。

F、碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。

G、依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。

（2）、良好载体的条件

A、必须有自身的复制子；

B、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；

C、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；

E、可通过特定的方法导入细胞；

F、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。

5、蓝-白筛选的原理？

答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠

杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克

隆的区分一目了然

7、核酸分子杂交的原理？

答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。

8、影响杂交的因素？

答：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。

2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。

3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。

4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。

5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性

9、探针的种类和优缺点？

答；1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。

2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。

3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。

4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。

10、探针的标记法？

答：1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。

2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4

种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。

3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。

4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。

11、PCR的基本原理？

、答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然

后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 ℃左右，Taq DNA聚合酶以4种dNTP为原料，以目的DNA 为模板，催化以引物3’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。

12、PCR引物设计的基本要求？

答：1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。

2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C

3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。

7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。

8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。

13.对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？

答：天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：

a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。

b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。

d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。

e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件

14.基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程

答：抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选或PCR筛选、差式筛选、DNA探针过程：多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌

株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色

1．参与蛋白质生物合成体系的组分有哪些?它们具有什么功能?

1答．A.mRNA：蛋白质合成的模板；B.tRNA：蛋白质合成的氨基酸运载工具；C.核糖体：蛋白质合成的场所；D.辅助因子：(a)起始因子—--参与蛋白质合成起始复合物形成；(b)延长因子—--肽链的延伸作用；(c)释放因子一--终止肽链合成并从核糖体上释放出来。2．遗传密码是如何破译的?

答(1)体外翻译系统的建立；(2)核糖体结合技术；(3)核酸的人工合成。

3．遗传密码有什么特点?

答(1)密码无标点：从起始密码始到终止密码止，需连续阅读，不可中断。增加或删除某个核苷酸会发生移码突变。

(2)密码不重叠：组成一个密码的三个核苷酸只代表一个氨基酸，只使用一次，不重叠使用。

(3)密码的简并性：在密码子表中，除Met、Trp各对应一个密码外，其余氨基酸均有两个以上的密码，对保持生物遗传的稳定性具有重要意义。

(4)变偶假说：密码的专一性主要由头两位碱基决定，第三位碱基重要性不大，因此在与反密码子的相互作用中具有一定的灵活性。

(5)通用性及例外：地球上的一切生物都使用同一套遗传密码，但近年来已发现某些个别例外现象，如某些哺乳动物线粒体中的UGA不是终止密码而是色氨酸密码子。

(6)起始密码子AUG，同时也代表Met，终止密码子UAA、UAG、UGA使用频率不同。

4．简述三种RNA在蛋白质生物合成中的作用。

答(1)mRNA：DNA的遗传信息通过转录作用传递给mRNA，mRNA作为蛋白质合成模板，传递遗传信息，指导蛋白质合成。

(2)tRNA：蛋白质合成中氨基酸运载工具，tRNA的反密码子与mRNA上的密码子相互作用，使分子中的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸顺序是遗传信息的转换器。

(3)rRNA 核糖体的组分，在形成核糖体的结构和功能上起重要作用，它与核糖体中蛋白质以及其它辅助因子一起提供了翻译过程所需的全部酶活性。

6．氨基酸在蛋白质合成过程中是怎样被活化的?

答催化氨基酸活化的酶称氨酰-tRNA合成酶，形成氨酰-tRNA，反应分两步进行：

(1)活化需Mg2+和Mn2+，由ATP供能，由合成酶催化，生成氨基酸-AMP-酶复合物。

(2)转移在合成酶催化下将氨基酸从氨基酸—AMP—酶复合物上转移到相应的tRNA上，形成氨酰-tRNA。

7．简述蛋白质生物合成过程。

答蛋白质合成可分四个步骤，以大肠杆菌为例：

(1)氨基酸的活化：游离的氨基酸必须经过活化以获得能量才能参与蛋白质合成，由氨酰-tRNA合成酶催化，消耗1分子A TP，形成氨酰-tRNA。

整个过程需GTP水解提供能量。

(3)肽链的延长：起始复合物形成后肽链即开始延长。首先氨酰-tRNA结合到核糖体的A位，然后，由肽酰转移酶催化与P位的起始氨基酸或肽酰基形成肽键，tRNAf或空载tRNA仍留在P位．最后核糖体沿mRNA5’→3’方向移动一个密码子距离，A位上的延长一个氨基酸单位的肽酰-tRNA转移到P位，全部过程需延伸因子EF-Tu、EF-Ts，能量由GTP提供。

(4)肽链合成终止，当核糖体移至终止密码UAA、UAG或UGA时，终止因子RF-

1、RF-2识别终止密码，并使肽酰转移酶活性转为水解作用，将P位肽酰-tRNA水解，释放肽链，合成终止。

8．蛋白质合成中如何保证其翻译的正确性?

答：(1)氨基酸与tRNA的专一结合，保证了tRNA携带正确的氨基酸；

(2)携带氨基酸的tRNA对mRNA的识别，mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子的相互识别，保证了遗传信息准确无误地转译；

(3)起始因子及延长因子的作用，起始因子保证了只有起始氨酰-tRNA能进入核糖体P位与起始密码子结合，延伸因子的高度专一性，保证了起始tRNA携带的fMet不进入肽链内部；

(4)核糖体三位点模型的E位与A位的相互影响，可以防止不正确的氨酰-tRNA进入A位，从而提高翻译的正确性；

(5)校正作用：氨酰-tRNA合成酶和tRNA的校正作用；对占据核糖体A位的氨酰-tRNA的校对；变异校对即基因内校对与基因间校对等多种校正作用可以保证翻译的正确。

9．原核细胞和真核细胞在合成蛋白质的起始过程有什么区别。

答1)起始因子不同：原核为IF-1，IF-2，IF-2，真核起始因子达十几种。

(2)起始氨酰-tRNA不同：原核为fMet-tRNAf，真核Met-tRNAi

(3)核糖体不同：原核为70S核粒体，可分为30S和50S两种亚基，真核为80S核糖体，分40S和60S两种亚基

10．蛋白质合成后的加工修饰有哪些内容?

答：(1)水解修饰；(2)肽键中氨基酸残基侧链的修饰；(3)二硫键的形成；(4)辅基的连接及亚基的聚合。

12．真核细胞与原核细胞核糖体组成有什么不同?如何证明核糖体是蛋白质的合成场所?

答原核细胞：70S核糖体由30S和50S两个亚基组成；

真核细胞：80S核糖体由40S和60S两个亚基组成。利用放射性同位素标记法，通过核糖体的分离证明之。

15.原核生物与真核生物的翻译比较如下：仅述真核生物的，原核生物与此相反。

（1）.起始Met不需甲酰化；

（2）.无SD序列，但需要一个扫描过程；

（3）.tRNA先于mRNA与核糖体小亚基结合；

（4）.起始因子比较多；

（5）.只一个终止释放因子。

简述转录的基本过程?

答案要点：转录的基本过程包括：模板的识别；转录起始；通过启动子；转录的延伸和终止。。

2.简述原核和真核细胞在蛋白质翻译过程中的差异.

答案要点：1、起始因子不同；

3、翻译过程（肽链延伸）因子不同；

4、终止因子不同

3试比较原核和真核细胞的mRNA的异同.

答案要点：A.真核生物5‘端有帽子结构大部分成熟没mRNA 还同时具有3’多聚A尾巴，原核一般没有；

B.原核的没mRNA 可以编码几个多肽真核只能编码一个。

C.原核生物以AUG作为起始密码有时以GUG，UUG作为起始密码，真核几乎永远以AUG作为起始密码。

D.原核生物mRNA半衰期短，真核长。

E.原核生物以多顺反子的形式存在，真核以单顺反子形式存在。

4.分别说出5种以上RNA的功能？

转运RNA tRNA 转运氨基酸

核蛋白体RNA rRNA 核蛋白体组成成

信使RNA mRNA 蛋白质合成模板

不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体

小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接

小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分

反义RNA anRNA/micRNA 对基因的表达起调节作用

核酶Ribozyme RNA 有酶活性的RNA

6简述tRNA的二级结构特征并指明作用与作用机制。

答案要点：1. tRNA携带AA，是一种酶促反应，也称AA的活化

2、氨基酰是tRNA 是AA参与蛋白合成的活化形式。AA的活化：氨基酸+ATP-E 氨基酸-AMP-E+PPi

3、每活化一分子AA需消耗ATP的2个高能磷酸键。AA的转移：氨基酸+ AMP-E+ tRNA 氨基酸-tRNA+AMP+E

4、氨基酰tRNA合成酶是高度专一性，既能高度特异性识别AA，又能高度特异性识别相应，这两点是保证翻译准确进行的基本条件之一。

5.氨基酰AMP-E复合体：作为中间产物，利于酶分别对AA和tRNA两种底物特异辨认，如有错配，合成酶有校正活性，水解磷酸酯键，与正确底物结合

7. 增强子的作用特点

答案要点：①增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用(1－4kb、30kb)，在基因的上游或下游都能起作用。

②增强子作用与其序列的正反方向无关。

③增强子与启动子在结构、功能上密切联系，要有启动子才能发挥作用,但对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。

④增强子的作用机理虽然还不明确，但必须与特定的蛋白质因结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。

8. 列举一个已知的DNA序列编码一种以上蛋白质的三种方法。

答案：给定的一段DNA序列可以以下述方式编码两种或两种以上的蛋白质：

(1)可读框中在核糖体结合位点之后含有多重起始位点；

(2)以一两个碱基的移码方式出现重叠的可读框；

(3)不同的剪接方式，例如，选择不同的外显子组合成不同的mRNA。

15.列举4种天然存在的具有催化活性的RNA。

答：I型内含子、II型内含子、RnaseP、锤头型核酶。

19.哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?

答：-35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA荣合酶起始位点)启动子序列和终止子；

22.(1)如何区分由启动子起始转录的RNA片段与5’端被加工过的RNA片段；

答：(1)转录中，5’核苷三磷酸聚合到RNA链的3’-0H端，这过程包括释放焦磷酸（即两个磷酸基)和形成磷酸二酯键。因此，只有5’端第一个核苷酸会有三磷酸基团。若RNA被加工，则5’端的核苷酸会被取代，剩下核苷单磷酸末端。