细胞色素C的提取
细胞色素C的提取
一、实验目的
1、掌握提取细胞色素C的原理。
2、学习提取细胞色素C的操作技术。
3、了解吸附法的原理和方法。
二、实验原理
细胞色素C是一种含有铁卟啉基团的蛋白质，是细胞色素的一种，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，是呼吸链的一个重要组成成分。细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。
细胞色素C溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，制品可分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。
吸附法指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。
由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C。
三、实验试剂和器材
试剂
1、2mol/L硫酸溶液
2、1mol/L氨水溶液
3、0.2%氯化钠溶液
4、25%硫酸铵溶液
5、20%三氯乙酸溶液
6、人造沸石
7、猪心
器材
磁力搅拌器、组织匀浆机、层析柱、恒流泵
四、实验步骤
1、材料处理
取新鲜或冷冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心搅成小块。
2、提取
称取碎猪心肌肉100g，放入500ml烧杯中，加蒸馏水200ml，搅匀，用硫酸调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取0.5h。提取完毕，用氨水调pH至6.0，搅拌均匀，停止搅拌。用八层普通纱布挤压过滤；滤渣加入750ml蒸馏水，再按上述条件提取0.5h，两次提取液合并。
3、中和
用氨水调上述提取液至pH7.2（此时，等电点接近pH7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），静置30—40min后过滤，所得滤
液准备通过人造沸石柱进行吸附。
4、吸附与洗脱
人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25%的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂质蛋白分开。具体操作如下：（1）人造沸石的预处理：称取人造沸石15g，放入500ml烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12s内不下沉的过细颗粒。
（2）吸附：采用静态吸附法，搅拌吸附细胞色素C，使人造沸石逐渐由白色变为红色。
（3）装柱：连接洗净的层析玻璃柱，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入2cm左右蒸馏水，保持柱垂直，然后将已吸附细胞色素C的人造沸石带水装入柱中（吸附有细胞色素C的人造沸石先用自来水清洗，再用蒸馏水清洗至清，再用氯化钠溶液清洗3次，再用蒸馏水清洗至水清），避免柱内出现气泡。
（4）洗脱：柱装好后，打开夹子放水（柱内沸石面上应保留一薄层水）将准备好的洗脱液（硫酸铵溶液）利用恒流泵将其泵入层析柱上口，使其通过人造沸石柱进行吸附。保持柱下端流速约2ml/min，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色消失时，即洗脱完毕。
5、盐析
为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵（按每100ml洗脱液加入20g固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45%）边加边搅拌，放置15～30min后，杂蛋白便从溶
液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸（或离心）除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。
6、三氯乙酸沉淀
在搅拌情况下向所得透亮溶液加入20%三氯乙酸，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性），立即收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解，观察现象。
五、思考题
总结该实验过程中的关键步骤。
细胞组织裂解(提蛋白)方法
第一种方法 蛋白匀浆缓冲液： 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF 操作步骤 直接用这个进行组织匀浆 然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清 作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。 将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离 第二种方法 裂解液配方： 尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤： 取300mg样品在液氮环境下研磨， 加入1ml裂解液混匀， 室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻）， 15000g离心1小时， 取上清测定蛋白质浓度。 在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以
除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？ （可以的，最后上胶条的时候可以再加） 不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好） 第三种方法 建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热 做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul 测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。 培养细胞 细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫
组织中巨噬细胞的分离
组织中巨噬细胞的分离 一取材 （1）无菌采集胃肠组织40g，用4℃生理盐水彻底冲洗组织块的血液，放入适量4 ℃DMEM 培养液中，带至细胞培养实验室。 （2）在超净工作台内，用无菌剪刀剔除可见的血管、结缔组织，将组织块剪成1～3㎜3大小 二组织消化 （1）将剪碎的组织块置于消化瓶中，加入预热至37℃含有0.125%的胰酶、10 U/ ml的DNase I的D-Hanks′液100 ml，置37℃孵箱中，10 min。 （2）消化产物加入50 ml离心管（预先加4.5 ml胎牛血清终止反应）。以800 rmp/min，5 min，离心，将细胞沉淀用3 ml 20%胎牛血清DMEM-H-G液。如果消化后上清液粘稠，可加入DNase I 消化5 min，用5 ml的胎牛血清终止反应，再800 rmp/min，5 min，离心，用20%胎牛血清DMEM-H-G培养液重悬细胞沉淀，暂放入37 ℃孵箱中。 （3）分别用80 ml、70 ml含胰酶对剩余的组织块消化，并重复（2）的步骤。 （4）将3份重悬的细胞悬液混合，取少量悬液镜下观察，呈单个细胞分布。离心（800 rmp/min，5 min）。用3 ml的DMEM-H-G液重悬。 三、细胞纯化 用Percoll等密度梯度沉淀法分离纯化胃肠巨噬细胞 （1）用9份Percoll液与1份10* D-Hanks′液配制90%的Percoll母液，再用Percoll母液与D Hanks′液配制35%和45%的Percoll溶液。 （2）用带14号长针头的玻璃注射器，按密度从大到小依次将45%和35%的Percoll溶液沿10 ml 离心管侧壁缓慢加入，每个梯度加3 ml，操作过程中注意不要有气泡产生。（3）将3 ml的细胞悬液用吸管缓慢沿管壁加入离心管，使其铺于Percoll密度梯度的液体表面，2500 rmp/min，20min，离心。 （4）离心后管内分3部分，底层（主要含红细胞），顶层（含连接组织成分，小血管，结缔组织），中间层（含统一的单个核细胞总体）。用吸管吸出云雾状中间层细胞带，比重在1.048～1.062 g/ml。加入3倍于Percoll液的DMEM-H-G液稀释，离心（800 rmp/min，10 min）。 （5）用少量20%胎牛血清、100 u/L青-链霉素的DMEM-H-G液重悬细胞沉淀。 这样就可以得到你要的巨噬细胞，不过可能会混有别的细胞，但大部分还是你所需要的。
实验报告设计-叶绿体中色素的提取和分离
叶绿体中色素的提取和分离 一、实验目标 1、知识方面 （1）探究叶绿体中含有几种种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系 （2）了解纸层析法的原理。 2、能力方面 掌握提取和分离叶绿体中色素的方法。 3、情感态度与价值观方面 认识生物科学的价值，乐于学习生物科学，养成质疑、求实、创新及勇于实践的科学精神和科学态度 二、实验原理 1、色素提取的原理：叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中，故可用丙酮和无水乙醇提取色素。 2、色素分离的原理：叶绿体中的各种色素在层析液中的溶解度不同。溶解度大的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度快；溶解度小的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度慢。三、实验准备 实验材料：新鲜的绿叶（如新鲜菠菜叶片）。 实验仪器及用具：定性滤纸，研钵，玻璃滤斗，脱脂棉，尼龙布，毛细吸管，剪刀，药勺，量筒（10mL），天平，试管，试管架，滴管，培养皿，三角瓶，烧杯 试验试剂：无水乙醇（或丙酮），层析液（CCl4），石英砂（SiO2）和碳酸钙（CaCO3） 四、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取菠菜新鲜叶片5g，洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。 （2）向研钵中加入少许碳酸钙和二氧化硅，再加10mL无水乙醇，进行迅速、充分研磨（二氧化硅有助于研磨得充分，碳酸钙可防止研磨中色素被破坏）。 （3）将研磨液迅速倒入漏斗（漏斗基部放一块单层尼龙布）中进行过滤。将滤液收集到试管中，及时用棉塞将试管口塞严。 2、制备滤纸条 用预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长10 cm、宽1cm的滤纸条，在滤纸条的一端剪去两角（防止层析液在滤纸条的边缘扩散过快），并在距离这一端1cm处用铅笔画一条细的横线。 3、画滤液细线 用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。待滤液干后，再画二三次。 4、分离叶绿体中的色素
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 （1）台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；
细胞色素C的制备及测定
细胞色素C的制备及测定 一．摘要 本实验以猪心为原料提取细胞色素C，通过三氯乙酸溶液沉淀、硫酸铵粉末抽提和透析等一系列步骤制备得细胞色素C溶液，并利用消光法对其进行鉴定。由实验可得，重量为166.6g心肌可得到38.0ml的细胞色素C溶液，其中蛋白质含量为0.71724mg/ml，细胞色素C产量为9.9023mg，产率为59.44mg/公斤；从实验中还可得，氧化型样品的最大吸收峰应在410毫微米、530毫微米。还原型样品的最大吸收峰应在410毫微米、520毫微米及550毫微米。 二．关键词：细胞色素C、猪心、制备、测定 正文 1.前言 细胞色素是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素 C 是其中的一种【1】。自然界中，细胞色素C 的含量与组织的活动强度成正比。以哺乳动物的心肌、鸟类的胸肌和昆虫的翼肌含量最多，肝、肾次之，皮肤和肺中最少。细胞色素 C 是一种重要的细胞呼吸激活剂，常作为组织缺氧治疗的急救用药和辅助用药，如 C O 中毒、安眠药中毒、初生婴儿窒息、严重休克期缺氧、麻醉前处理以及肺部疾患引起的呼吸困难、高山缺氧、各种脑部疾病引起的脑缺氧、各种心脏疾患的缺氧。也用于脑血管障碍、中风后遗症、乙型脑炎后遗症等的治疗。另外细胞色素 C 还能促进受损肝细胞的再生、骨髓造血机能修复以及显著减轻由放疗引起的白细胞减少症。通常外源性细胞色素 C 不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素 C 便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用，最终在一定程度上恢复损伤的电子传递链【2-4】。因文献中有关细胞色素C的研究鲜见，本实验采用猪心为原料对其进行研究。 2．实验部分 2.1实验原理
总蛋白的提取
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取： （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6 ）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取： （1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 含量测定
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物： 6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤： 1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。 3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。 4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至 5×106cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁（时间短，可以不灭菌）染色。观察。
细胞色素C的制备及测定
实验三吸附法制备细胞色素C 粗品 一、实验目的 1．学习细胞色素C 的理化性质及其生物学功能。 2．掌握制备细胞色素C 的原理。 3．掌握制备细胞色素C 的操作技术。 二、实验原理 细胞色素C（cytochrome,Cyt）是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b 和细胞色素aa3 之间，细胞色素C 的作用是在生物氧化过程中传递电子。 细胞色素C 分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000 道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。细胞色素C 分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C 制成还原型的，氧化型细胞色素C 在408nm、530nm 有最大吸收峰，还原型细胞色素C 的最大吸收峰为415nm、520nm 和550nm，这一特性可用于细胞色素C 的含量测定。 由于细胞色素C 在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。 三、实验材料 1. 实验器材 绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l 型分光光度计；烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋 2. 实验试剂 ⑴1M H2S04 溶液；1M NH40H 溶液；固体硫酸铵 ⑵25％硫酸铵溶液: 100m1 蒸馏水中含25 克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度 ⑶0.2％氯化钠溶液：称0.2 克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml. ⑷10%乙酸钡试剂：称10 克乙酸钡, 溶于100ml 蒸馏水中。 ⑸20％三氯醋酸溶液 (6) 人造沸石(60～80 目)
细胞总蛋白提取方法
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
色素提取试验方法
一、暗紫贝母内生真菌红色素的提取及稳定性研究张辉东，曾雪丽，陈鹊，吴卫 （四川农业大学农学院，四川雅安625014） 1．2方法 1．2．1红色素的生产和提取工艺菌种→扩培→ 发酵→收集菌体→超声波提取→减压浓缩→红色 素粗品。 1．2．2菌体培养从保存试管培养基斜面上挑取 单菌落接种于PDA培养基中，28℃，恒温培养3 d， 将菌丝转接于装有液体培养基的三角瓶中（150 mL／250 mL），总计20瓶，放于26℃、110 r／min恒温 摇床培养7 d，抽滤，弃上清液，得红色菌体。 1．2．3不同溶剂下红色素的提取方法称湿菌体6 份，每份2．0 g，分别加入去离子水、甲醇、乙醇、甲醇 和丙酮的混合液（1∶1，V∶V，下同）、丙酮、乙酸乙酯 40 mL，在超声功率400 W、超声10 S间歇20 S条件 下超声破碎30 min，过滤除去菌体，即为红色素在 不同溶剂中的提取液。 红色素的吸收光谱 称取湿菌体2．0 g，20 mL丙酮作溶剂，超声波法 提取红色素，抽滤得红色素溶液，在25℃下用日本 岛津UV2450型紫外分光光度计于190 nm到500 nm范围内扫描测定，测定结果见图1。由图可知，红 色素在210 nm处有一个最大吸收峰，该峰为红色素 的特征吸收峰。 2．2不同溶剂对红色素提取量的影响 根据1.2.3所述方法获得的不同溶剂的红色素 提取液，分别在210 nm处用紫外分光光度计测定吸 光度（OD）值。红色素在210 nm处的OD值与红色 素含量呈正比，OD值越大，单位体积中红色素的含 量越高，即溶解度越大，提取量越高。结果见表1。从 表1可见，红色素在不同溶剂中测得的OD值不同 即溶解度不同。在室温条件下，红色素在丙酮中的
大鼠骨髓巨噬细胞的分离_纯化_培养以及鉴定_李静
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04 大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定 李静,王亚平 (重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016) =摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。 =关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定 =中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24 Methodology of separation,purification,cultivation an d identification of rat bone marrow macrophage LI Jing,et al (Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage. =Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification 巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明[1,2],巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心 作者介绍:李静(1973-),女,讲师,硕士, 主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管国内外不少文献报道[3,4]已能从多种组织和器官中分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。
绿叶中色素的提取与分离实验操作过程(图文)
绿叶中色素的提取与分离实验 一、实验原理 1、提取的原理：利用色素溶于有机溶剂无水乙醇而不溶于水的性质。 2、分离的原理：利用各种色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液在滤纸上扩散的速度不同。（纸层析法） 二、目的要求 1、进行绿叶中色素的提取和分离； 2、探究绿叶中含有几种色素 三、材料用具 1、材料：新鲜的绿叶（如菠菜、韭菜的绿叶）。 2、用具：剪刀、药匙、研钵、量筒、漏斗、试管、棉塞、尼龙纱布、盖玻片、试管架、干燥的定性滤纸、铅笔、直尺、烧杯、穿针的细线、滴管。 3、试剂：无水乙醇、层析液、二氧化硅（石英沙）和碳酸钙。 四、方法步骤 1、提取绿叶中的色素 （1）取深绿色的植物叶片，洗净，抹干水分，并称取5g，剪成小块置于研钵中。（2）在研钵中加入少许二氧化硅（SiO2）、碳酸钙（CaCO3），再加入6ml无水乙醇。（3）迅速、充分地研磨成糊状。 （4）在漏斗基部放一小块单层尼龙纱布，将研磨液迅速倒入玻璃漏斗中进行过滤。将滤液收集到试管中，及时用棉塞将试管口塞严。 剪碎绿叶加二氧化硅、碳酸钙，（迅速）研磨成糊状 再加入10ml无水乙醇 过滤收集滤液，棉塞封口 2、制备滤纸条（如下图） 3、画滤液细线（如下图） 滤纸条：长6cm，宽1cm，用盖玻片一端蘸取滤液，沿铅笔线画线， 距一端1cm处用铅笔和直尺等滤液细线风干后，再画下一道细线，重复 画一条细的横线。2—3次。画线要求：细、直、齐。
4、分离色素 将3ml 层析液倒入小烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）轻轻插入层析液中，随后用培养皿盖盖住小烧杯。注意：不能让滤液细线接触到层析液。 5、观察与记录 观察烧杯中滤纸条上出现了几条色素带，以及每条色素带的 颜色和宽度。 将观察结果记录下来，并将层析结果的分离结果贴在上面。 “培养皿法” 五、讨论 1、滤纸条上有几条不同颜色的色带？其排序怎样？宽窄如何？这说明了什么？ 2、滤纸条上的绿叶细线为什么不能触及层析液？ 3、将有色素带的滤纸条夹在书里，几天后会出现什么现象？这说明了什么？ 4、到了秋天叶色变黄、变红的原因是什么？ 注：无水乙醇-------------------溶解、提取色素 二氧化硅（SiO 2）--------研磨充分 碳酸钙（CaCO 3）--------防止色素破坏 层析液----------------------分离色素 胡萝卜素叶绿素b 叶绿素a 叶黄素 橙黄色 黄色 蓝绿色 黄绿色
细胞的总蛋白质提取全过程及经验
细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021
细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所
肺泡巨噬细胞的制备及RNA提取
PAM (肺泡巨噬细胞) 的制备 一、准备工作 1、高压灭菌好的1×PBS两瓶（1000ml/瓶）、小托盘1个、500ml烧杯2个、大 剪刀1把、镊子2把和50ml离心管若干。另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。 2、细胞培养液的配备 生长液：10%胎牛血清+DMEM培养基+双抗+两性霉素 二、制备细胞 1、将小猪腋下放血致死 2、从颈部剖开腹腔，避免伤到气管和肺脏 3、用棉线结扎气管上部，然后剪断气管，将气管和肺脏完整取出来，放到准备 好的大烧杯中 4、转移到细胞培养室，用PBS冲洗干净肺脏表面，弃除杂物 5、在操作工作台上用灭菌好的剪刀剪断结扎了的气管。（以下步骤需无菌操作） 6、吸取PBS灌进肺内，充盈后，用手轻轻捏揉肺叶数次后，把肺内液体倒出到 蓝盖瓶中。 7、重复灌洗2次 8、将所收集的液体分装到50ml离心管中，4℃2000g、10min离心 9、视情况可以将沉淀细胞再用PBS或培养基清洗离心1次 10、在细胞沉淀中，加入2ml Trizol试剂，用移液器充分吹打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）。 11、后续可按Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保 存在冰箱中保存。
RNA抽提 第二阶段：分离阶段 6．加入0. 2 ml 氯仿,剧烈混匀20 s ,室温放置10 min 。 7．10 000 rpm/min,4 ℃离心15 min。 第三阶段：RNA的沉淀 8．吸取上清于5 ml 离心管中,加入0.5mL异丙醇（预冷）颠倒混匀5 次,室温放置10 min 。(注意：在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染) 9．10 000 rpm/min,4 ℃离心10min。（RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁） 第四阶段：RNA的漂洗 10．去上清,沉淀用1ml 75 %乙醇漂洗，振荡，7 000 rpm/min,4 ℃离心10 min，倒净乙醇。11．RNA 沉淀加入0.5 ml无水乙醇漂洗，振荡，7 000 rpm/min,4 ℃离心5 min，倒净无水乙醇。（缩短RNA沉淀晾干的时间，避免RNA在空气中暴露时间过长而增加外源性Rnase对RNA 的降解） 第五阶段：RNA的再溶解 12．在超净工作台上平放离心管,待离心管管壁无明显液滴时加入50 μl DEPC 处理的灭菌双蒸水，在55-600C温育10min，溶解RNA 沉淀。 13．将溶解充分的RNA溶液转移到1.5ml离心管中，做好标签，放入-800C的冰箱中保存备用。 总RNA检测及浓度测定 总RNA的完整性可通过普通琼脂糖凝胶电泳检测，过程如下： 1. 制备1.2％琼脂糖凝胶：将1.2g琼脂糖溶于1×TAE中，稍加冷却，加入少许EB，混合均匀后，灌制凝胶，待凝胶凝固好后，即可使用。 2. 点样：取2μL总RNA与2μL Gel Loading Buffer及6μL DEPC水混合后点于点样孔中，15V/cm，电泳20min。 3. 拍照：电泳结束后，用紫外透射仪观察，并用凝胶成像系统成像。 4. 用紫外分光光度计测量总RNA样品浓度，每个3次，取平均值。 5. 根据所测浓度，用DEPC水稀释每个RNA样品浓度至1μg/μL，其余样品保存在超低温冰箱备用。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备： 超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。 操作步骤： （1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。 （2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。 （3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。 （5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。 （6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。 （8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。
（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。 （10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。接种75cm2细胞培养皿中。 （11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
人肝癌组织原代巨噬细胞的提取与鉴定
·论著· 180? ?中华普通外科学文献 （电子版） 2019年6月第13卷第3期Chin Arch Gen Surg （Electronic Edition ）, June 2019, Vol. 13, No.3 人肝癌组织原代巨噬细胞的提取与鉴定梁浩?谢炬平?黄镇辉?张大伟?蒋小峰?薛平 【摘要】 目的?研究人肝癌组织原代肿瘤相关性巨噬细胞（TAMs ）的提取与鉴定方法。方法?收集原发性肝癌患者术中切取的肝癌组织标本15份，免疫组织化学染色方法检测肝癌组织中肿瘤相关巨噬细胞表面标志物CD68及CD206的表达。利用机械法和酶消化法结合分离TAMs ，贴壁培养24 h 后在倒置显微镜下进行细胞形态学观察，利用CD68和CD206作为标志物，流式细胞术鉴定细胞纯度。结果?癌巢和癌旁组织中均可见CD68、CD206阳性表达，阳性细胞表现为棕褐色；获得一定纯度的原代巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征，其中CD68单阳性比例为36.29%，CD68和CD206双阳性比例为15.96%。结论?本研究采用的方法可有效提取和培养人肝癌组织来源的原代TAMs ，对进一步研究人类肝癌组织TAMs 特性及对肿瘤生物学行为的影响具有重要价值。 【关键词】 巨噬细胞；癌, 肝细胞；细胞培养技术；提取；鉴定 Extraction and identification of primary macrophages from human hepatocellular carcinoma Liang Hao, Xie Juping, Huang Zhenhui, Zhang Dawei, Jiang Xiaofeng, Xue Ping. Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, China Corresponding author: Xue Ping, Email: dexueping@https://www.360docs.net/doc/8f7059159.html, 【Abstract 】 Objective To study the extraction and identification of primary tumor-associated macrophages (TAMs) from human hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Fifteen hepatocellular carcinoma specimens were collected from patients with primary HCC. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of tumor-related macrophage surface markers CD68 and CD206 in HCC tissues. TAMs were separated by mechanical method and enzymatic digestion method. After 24 hours of adherent culture, the cell morphology was observed under inverted microscope. CD68 and CD206 were used as markers to identify the purity of TAMs by ?ow cytometry. Results CD68 and CD206 were positive in the central and adjacent tissues, and the positive cells were brown. A certain purity primary macrophages were obtained with morphological characteristics of macrophages. The single positive rate of CD68 was 36.29%, and the double positive rate of CD68 and CD206 was 15.96%. Conclusion The method used in this study can e ff ectively extract and cultivate primary TAMs from human HCC tissues, which is of great value to further study the characteristics of TAMs and their e ff ects on biological behavior of tumors. 【Key words 】 Macrophages; Carcinoma, hepatocellular; Cell culture techniques; Extraction; Identi?cation DOI ：10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2019.03.003基金项目：广州市科学（技术）研究专项一般项目（201607010033）作者单位：510260 广州医科大学附属第二医院肝胆胰外科 通信作者：薛平，Email ：drxueping@https://www.360docs.net/doc/8f7059159.html, 巨噬细胞是重要的免疫细胞，在人体组织中 广泛分布，具有抗感染、参与组织修复、免疫应答、 免疫调节等重要的生物学功能［1-2］。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是含量最为丰富的免疫细胞之一， 又称为“肿瘤相关巨噬细胞”（tumor-associated macrophages, TAMs ）［3］。原发性肝癌是我国常见 的消化道恶性肿瘤，在男性癌症相关死因中位居第二，在女性中位居第七［4］。肝癌肿瘤微环境中的巨噬细胞在肿瘤的进展过程中起重要作用。如何从肝癌组织中分离、获取大量巨噬细胞是进行体外研究的关键，目前国内少有关于肝癌组织原代巨噬细 胞提取的报道。本研究中以酶消化法与巨噬细胞 分离液分离肝癌组织巨噬细胞，根据巨噬细胞的黏 附特性，进行贴壁培养和鉴定，探讨此法提取巨噬