大提质粒步骤
1.取150ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心2-3min
收集细菌，尽量吸取全部上清。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入12ml Buffer P1，使用涡旋振荡器
充分混匀，悬浮细菌沉淀。
3.向离心管中加入12ml BufferP2，温和的上下颠倒混匀十几次，使
菌体充分裂解，室温放置3-5min。此时溶液应变得清凉粘稠。4.向离心管中加入12ml Buffer B3，立即上下颠倒混匀十几次，此时
出现白色絮状沉淀，室温放置5min。12000rpm离心10min，将上清液全部倒入除内毒素过滤器中，慢慢推动推柄过滤，过滤收集收集在干净的50ml的离心管中。
5.向滤液中加入11ml异丙醇，上下颠倒混匀。
6.向已装入收集管中的吸附柱中加入2mlBufferPS，12000rpm离心
2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。
7.将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。
8.6000-12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新
放回到收集管中。
9.向吸附柱中加入10mlBuffer PW，6000-12000rpm离心2min，将吸
附柱重新放回到收集管中。
10.重复步骤。
11.将吸附柱重新放回到收集管中，12000rpm离心5min，倒掉废液，
将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
12.将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜中间部位加入
1-3mlEndo-Free BufferEB，室温2-5min，12000离心5min，将质粒溶液收集到收集管中。-20℃保存质粒。
创业成功的五步骤
创业成功的五步骤：简单创意、坚持重心 导语：美国科技博客网站ReadWriteWeb评论人拉米尼?达拉比哈(RamineDarabiha)日前对斯坦福大学副教授、《四步的顿悟》一书的作者史蒂夫?布兰科(Steve Blank)进行了采访。布兰科认为，大多数成功的创业公司都不采用“精益创业”(Lean Startup)方法，他们的目标是在时机成熟时退出，而不是继续发展壮大。 以下为文章主要内容： 弹性创业公司(Flip startup)是指灵活多变的创业公司。与精益创业公司不同，弹性创业公司的首要目标不是获取经验以创建一种可持续的商业模式，相反，他们的目标是打造一款颇具发展前景的产品。例如，产品可能是某一款成功的应用或游戏。按照他们的设想，开发一款深受市场欢迎的产品，然后在时机成熟的时候退出。 这是一种不需要长期培养客户的精益发展模式，侧重点在产品开发方面。Blindtype、Hipster和About.me便是最新例证。这些产品均在推出之前被购买。在产品开发阶段，弹性创业公司与精益创业公司有着相似之处，即都必须保持灵活多变。不同之处在于，精益创业公司会实施分析，跟踪用户反馈意见，为下一代产品的推出做准备。 相反，弹性创业公司不会这样做。精益创业公司的目标是，无论市场状况如何，都要寻找和创造可持续的价值。弹性创业公司则不然，他们注重趋势，在公司估值升高时适时退出，迅速收回投资。 以下即是创业公司实现完美退出的五个步骤： 第一步：寻找简单创意 假如你的目标是快速退出，那就应该尽可能快地提供MVP服务体验。这意味着要寻找一个易于执行的创意。以Blindtype为例，这款软件主要基于人工智能，根本不需要铺垫。如果创意简单，这不仅意味着易于让人接受，还意味着容易推销：如果范围有限，你的应用或技术可能易于整合，以满足另一家公司的需要。 但是，过于简单且不突出的创意很难推销。此外，如果这个计划不能奏效，你或许可以重新利用其中的一些成果，以迅速提出新的创意，所以，你可能希望自己的成果具有某些通用性。最终，你应该侧重于提出一种能在自己熟悉的领域推出并重新利用的创意，从而不需要外人的帮助。 第二步：产品开发 在这个阶段，弹性创业公司与精益创业公司有着相似之处，即都必须保持灵活多变。不同之处在于，精益创业公司会实施分析，跟踪用户反馈意见，为下一代产品的推出做准备。相反，弹性创业公司不会这样做。开发出现有框架下最受欢迎的产品。由于以前的一些计划，你可能留有一些成果，或可以通过开源零部件或资料令工作变得更轻松。 例如，Launchrock或Optimizely等服务可有助建立一个登陆页面。这同样适用于支付、分析、电子邮件等诸多服务。一旦在这方面游刃有余，你就有精力去开发真正的应用、游戏或服务。Cabana和GameSalad等服务可你开发具有拖放功能的应用。利用这种工具快速开发有意义的产品，绝不会给人服务低劣的感觉。但是，这会影响IP的价值。 第三步：进行推广 每个创业公司都需要公关，而这一点对弹性创业公司尤为重要。如果人们看不到某款产品的潜力，就不会购买。关键是，你要给人以创造价值的承诺，将创意的最好一面展示给对方。所以，炒作没有什么错误之处，毕竟，电影预告片始终在这样做。问答服务网站Hipster因业界传言其正在开发一种奇妙的服务而受到追捧，用户纷纷提前注册。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
陈安之销售的十大步骤
陈安之销售的十大步骤 作者：陈安之 我觉得一个人成功，最后最后的关键，除了那些知识、行动、坚持到底之外，其实就是要做好一个服务。那服务就是要超越顾客的期望。 现在我们要开始的演习是“善于销售”。推销就是要交朋友。业绩好的人就是他朋友多；业绩不好的人就是他朋友不够多，因为朋友会跟朋友购买产品。当你下定决心，不管任何人说不，只要你的企图心旺盛，只要你知道如何销售你自己，行销你自己，任何事情都是有可能的！ 现在，我们来学习说服（销售）的十大步骤： 1、第一步骤：充分的准备 充分的准备包括四个方面的准备，首先是体力的准备。要想让自己体力好，就必须做一些体力上的训练。以我十几年来研究成功学的经验，总结出了一些行之有效的方法（见《自己就是一座宝藏》），现在介绍几个给大家。 一个是每天做一四二深呼吸，早、中、晚各10次，共30次；二是永远只吃七、八分饱；三是吃水果在饭前吃，不要在饭后吃；四是做运动要做有氧运动，比如散步、游泳、慢跑、骑自行车等。 第二是专业知识的准备。你必须对你的产品有非常足够的了解。第三是对顾客了解的准备。你必须非常了解你的顾客，了解他的兴趣、爱好，这样便于沟通，便于投其所好。第四是精神上的准备。在处理重要的事情之前，先静坐5分钟。 2、第二步骤：使自己的情绪达到巅峰状态 要想使自己达到巅峰状态，必须先让自己的肢体达到巅峰状态，因为动作创造情绪。同时对自己反复地做自我确认：我是最棒的！我是最优秀的！我是最好的！我喜欢我自己！我一定能成功！ 3、第三步骤：建立顾客信赖感 建立顾客的信赖感，首先是透过自己的形象！也就是——为成功而穿着！为什么这么说呢？因为一个人的第一印象非常非常地重要！一旦他第一印象建立好了，那就成功了一半了。而第一印象就是通过你的形象表现的，所以一定一定要注重自己的穿着、举止、气质。 第二要学会倾听。永远站着或坐在顾客的左边，保持适度的距离，保持适度的目光接触，倾听不要打岔，不要发出声音，同时微笑点头即可。还要做好记录。顾客讲完后，要重复一次做确认。不要想即将说的话，要听出他真正的意思，用关心的角度跟他沟通。 第三要模仿对方的谈话。模仿对方的文字、声音和肢体语言，与对方相似，引起共鸣。在模
4.创业团队创建基本步骤
创业团队创建基本步骤 （一）制定战略目标与重点 明确自己事业的方向与工作重点，至关重要。这对于选择创业合作者以及后期整个团队章程的制定等，都起着决定性作用。 （二）创业者自我评估 主要指就创业者的各项能力、素质以及现有的资源进行自我测评，明确自己的优势与劣势，为后期寻找“相似性”或者“互补性”的团队成员（创业合作者）、寻找补充性的资源，提供重要参考依据。 （三）选择创业合作者 选择创业合作者，要注重两个核心问题： 一是注重互补性能力组合。在挑选团队成员时，要努力保证所找的对象有助于形成互补性的能力组合。而且，值得注意的是，不仅要寻找那些目前拥有未来团队所需要技能的人员，也要寻找那些具备技能开发潜质的人员。通常的技能组合包括解决问题的能力与决策能力、人际关系能力、专业技能、团队技能等等。 二是人员规模。创业团队规模，一般初期不宜过多，便于股权的分配、内部统一集中管理、达成一致以及高效率的发挥，当然，具体应该根据战略目标与重点而定。 （四）确定组织架构、职责与权利 进行初期内部的组织架构设计，简单、高效、便于沟通交流与操作执行即可。同时，明确各自的职责与权利，具体包括组织所赋予的职责与权力范围，以及团队成员的授权范围。 过程中应注意：职责的安排无需一成不变。你可以在某一时间进行职责轮换，或者你也可以指定几名成员在整个创业过程中共同承担某些职责。这也是高效创
业团队的具体体现。 （五）制定组织目标与章程 通过制定组织目标（尤其是要突出初期现实可行的目标）与章程，主要目的是为了统一创业团队的努力方向、价值取向以及行为规范，使得创业团队方向达成一致、文化达成一致、行为达成一致，确保创业发展不偏离轨道。章程的具体内容，主要包括： ●使命与目标 ●团队文化 ●决策原则 ●团队行动纲领 ●职责与分工 ●绩效考核方法 ●与利益相关者的沟通及关系处理 ●团队成功的度量标准
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；
铺垫邀约的五大步骤
铺垫邀约的五大步骤 在每次邀约的过程当中，很少有人知道邀约有哪些规则，铺垫又有哪些技巧。同样是做一个邀约，有的人做成功了，有的人就没效果，做成功的人一定有正确的方法，而做失败的人一定是因为做错了。 有些业务员在稍微地问候以后就开始邀约，并且朋友也邀约过来了，这种情况属于个别现象，也许是该业务员在传统行业很优秀，又或者是信任度很高时才能行得通。但不良后果是对朋友的需求了解不透彻，没有刺激对方的欲望，背景也很不清楚。从而出现在以后的引导工作中出现困难的现象。因此，不管三七二十一把朋友邀约上来是很不明智的，因为朋友会感到突然、迷茫、怀疑，这样的邀约大多会失败。 那么，什么是有效的铺垫与邀约的基本法则和技巧呢?成功的铺垫与邀约基本上分五个个步骤去完成，具体如下: 铺垫邀约五大步骤 1、了解事实，资料，年龄，职业，爱好，工作，生活，家庭情况，身体，性格，关心对方。 2、创造需求:看对方喜欢吃什么鱼(相对应给什么鱼饵)，如没需求，给对方压力，有压力才有动力。挖掘并给对方未来的需求点。 3、引发理想:用自己的理想感染对方，肯定对方的人品，能力，我不是能力强，而是信息与机会多。
4、提高欲望:鼓励，利用人性的攀比引发欲望。 5、感召行动:具备了前面所有条件，便成为吸引力就可以发出邀约信号了。 一、了解事实 建立关系，以关心问候为主，问候是对对方的客气和尊重，主要目的是了解被邀约人的工作，收入等情况，但问候一定要简短，问候之后迅速转入正题，有些人一聊就一个小时，最后把正事都忘了。 1、对于一直保持联系的被邀约人，可以通过推崇对方的职业，生活现状，家庭条件，个人能力让对方向你吐苦水。例如:你能力那么强，你老板/上司肯定给你涨工资啦，什么时候买房子?什么时候买车子?当对方向你吐苦水时，推崇对方的能力，同情对方的处境，隐约让他知道你有能力让他改变现状。 2、对于很长时间没有联系的被邀约人，可以通过一些借口建立关系，整个了解过程可以通过几次电话分步完成。例如:我在整理电话本，看看你还有没有用这个电话。 二、创造需求 了解对方的需求，帮对方评估未来危机。例如:说说你今天去哪里花了多少钱，买衣服花了多少钱，吃饭花了多少钱，抱怨现在的物价飞涨，你是多么的身不由己，因为这些是应酬的必要开支。同时问对方最近有什么计划?打算去哪里旅游?告诉对方你有计划和他一起去，只是怕他请假难(了解他请
超级说服力十大步骤
超级说服力十大步骤DellAS-PE2950MLK 1、第一步骤：充分足够的准备 充分的准备包括四个方面的准备，首先是体力的准备。要想让自己体力好，就必须做一些体力上的训练。以我十几年来研究成功学的经验，总结出了一些行之有效的方法（见《自己就是一座宝藏》），现在介绍几个给大家。 一个是每天做一四二深呼吸，早、中、晚各10次，共30次；二是永远只吃七、八分饱；三是吃水果在饭前吃，不要在饭后吃；四是做运动要做有氧运动，比如散步、游泳、慢跑、骑自行车等。 第二是专业知识的准备。你必须对你的产品有非常足够的了解。第三是对顾客了解的准备。你必须非常了解你的顾客，了解他的兴趣、爱好，这样便于沟通，便于投其所好。第四是精神上的准备。在处理重要的事情之前，先静坐5分钟。 2、第二步骤：使自己的情绪达到巅峰状态（自我确认） 要想使自己达到巅峰状态，必须先让自己的肢体达到巅峰状态，因为动作创造情绪。同时对自己反复地做自我确认：我是最棒的！我是最优秀的！我是最好的！我喜欢我自己！我一定能成功！ 3、第三步骤：建立顾客信赖感 建立顾客的信赖感，首先是透过自己的形象！也就是——为成功而穿着！为什么这么说呢？因为一个人的第一印象非常非常地重要！一旦他第一
印象建立好了，那就成功了一半了。而第一印象就是通过你的形象表现的，所以一定一定要注重自己的穿着、举止、气质。 第二要学会倾听。永远站着或坐在顾客的左边，保持适度的距离，保持适度的目光接触，倾听不要打岔，不要发出声音，同时微笑点头即可。还要做好记录。顾客讲完后，要重复一次做确认。不要想即将说的话，要听出他真正的意思，用关心的角度跟他沟通 。 第三要模仿对方的谈话。模仿对方的文字、声音和肢体语言，与对方相似，引起共鸣。在模仿肢体语言的时候，要模仿对方的表情和语气，注意千万不要同步模仿。 第四是要使用顾客见证。顾客说一句话顶你一万句，每个推销员至少带5个顾客见证。 4、第四步骤：了解顾客的问题、需求和渴望 了解顾客先从聊天开始，聊天就是做生意。首先前20分钟要聊FORM，F代表家庭；O代表事业；R代表休闲；M代表财务。其次聊购买的价值观。所有的销售都是价值观的销售，彻底了解顾客的价值观。第三就是问问题。问NEADS，N代表现在；E代表满足；A代表更改；D代表决策；S代表解决方案。 5、第五步骤：提出解决方案并塑造产品的价值
创业的主要步骤
谈到创业，几乎人人都有一套可以高谈阔论的生意经,然而真正付诸执行的个案实在是屈指可数。原因在于，害怕创业的人总是多过愿意承受创业压力的人。其实，创业的想法并不是那么可怕的。因此在这里，将创业过程总结成八个步骤,希望投资者们在创业之路上走得更踏实。第一步骤:从三百六十行中选择你的最爱人人都可以创业，但是，却不是人人都可以创业成功的。这其间有着许许多多成功创业的小秘诀,而这些秘诀并非都来自创业成功个案的经验，很多是从失败的例子中去反省、领悟而来的。综合这些经验谈,创业者首先必须做的便是决定要从事哪一种行业，哪一类项目?在你下决定之前,最好先为自己作个小小的测验,了解自己在哪方面较有创意、潜力；哪方面的事业较能吸引自己的注意力、并鞭策自己奋往直前等。一旦做好选择，接下来的许多课题便需要创业者一步步地去执行,才能逐渐地迈向成功之路。第二步骤：持续自我成长与学习有了完整的创业点子，下一步骤便是尽量让自己多接触各种信息与资源管道；诸如专业协会及团体等组织机构。这些团体、组织不仅可以帮助你评估自己的创业机会与潜力,并可以尽早让创业计划就定位。其它有效的资源：诸如创业者的自传、创业丛书、商业杂志等；或是专业的商业组织,如中小企业管理局的计划书顾问群等,也都可以提供许多的好材料给创业者去脑力激荡。创业者也可主动出击,把公司信息告知当地的商业组织、团体等来增加公司曝光率。即使有可能遭受到地区性竞争者的妒忌,你还是可以试着与其它地区的同业交换创业心得、征询适时的忠告。有很多成功的创业者都有这种相同的经验,差别只是解决方法不同而已，所以别太早死心,枉送别人的美意。第三步骤：慎选你的品牌或公司名称最佳的品牌或公司名称是要能够充分反映你的产品或服务与众不同的特色及单一性。基本上，品牌或公司名称与产品之间的关系是成正比的；亦即是要能在消费者或顾客群的心目中产生一种紧密的联想力。具创意的品牌或公司名称不仅有助于建立品牌的形象,同时也能打动顾客的购买欲。选择的品牌或公司名称时应该具有前瞻性与远见;所选择的品牌或公司名称要能很有弹性地将自己推荐给消费者。最后，别忘了先作注册公司名称调查，确定你所选择的名称仍然还未被登记或已在公司商标法的保护中。切记,别取一个过于冗长的名称,消费者不容易记得。第四步骤:决定公司的合法组织与法律架构在开始计划营运前你必须选择何种法定组织架构适合你的创业大计。简而言之,首先你必须决定是要自己创业？还是合伙创业?如果选择合伙创业,公司的起始资本额要如何分配?合伙创业的模式可以是有限股份公司制或是以一集团公司名称方式创业。这中间并没有一套可依循的准则,来分析各种可能状况以区分孰优孰劣；因此，你必须先了解各种公司组织型态的利弊及运筹方式，再选择最适合组合模式配合你的创业计划方式。尽管各种公司营运架构有些微的差异性,但是最需要注意的焦点是一旦公司营运出状况时，公司内部将由谁负起最后法律上的财务责任?举例来说,以独资或合伙人型态创业,公司组织法要求个人自行负担公司的债务归属问题。也就是说，一旦公司因牵连上财物官司而败诉，则个人名下所属财产及不动产等都会受到法院的扣押、拍卖以偿还债务。无论一开始你选择哪一种经营模式，都不代表公司的经营体制已经定型不变,还是可以依据公司的发展与未来潜力做适时的变更。第五步骤:评估一份具体的预算报告经营一项有利润的新事业必须要有充分的流动资金，并且要能与实际经营运作时所需的开销相平衡，是以草拟一份年度预算表是必要且马虎不得的。要草拟一份精确的年度预算表并不容易，即使是一位最有预算概念的大师来编列预算表，还是多少会有低估预算,或遗漏些小细节，这些小细节常常
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
Neon电转染操作步骤
Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理 电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等 影响电穿孔效率的因素 电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。 1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip), the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。 2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的 culture medium，DPBS等。 3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum and supplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。 4.Aspirate the media from cells and rinse the cells using DPBS, trypsinize the cells using Trypsin/EDTA, after neutralization, harvest the cells in growth medium with serum. 用DPBS漂洗细胞两次，加入Trypsin/EDTA消化细胞，再加入生长培养基终止消化，收集细胞。 5.Count cells to determine the cell density, transfer enough cells for Neon transfection into a 1.5 ml microcentrifuge tube or a 15 ml cornial tube and centrifuge the cells at 100-400 × g for 5 minutes at room temperature. 对消化的细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL 或者15 mL的离心管中，100-400 × g，室温离心5min。 6.Wash the cells with DPBS by centrifugation at 100-400 ×g for 5 minutes at room temperature. 用DPBS漂洗一次，同上条件离心。 7.Aspirate the DPBS and resuspend the cell pellet in Resuspension Buffer R in a final density of 1.0 × 107 cells/mL. Gently pipette the cells to obtain a single cell suspension. 弃DPBS,用适量的Buffer R重悬细胞，使细胞密度达到1.0 ×107 cells/mL.（该密度仅适用于每个
学习五大步骤
陈安之老师谈学习，总结起来，有以下5个步骤： 1、初步了解； 2、重复为学习之母； 3、开始使用； 4、融会贯通； 5、再次加强； 6、创新 的确学习如果按照以上的步骤进行，势必能够取得事倍功半地效果。学习本来就应该讲求方法、技巧。有选择性地学习，不断重复学习，做到学有所用，融会贯通，对学习的知识加深理解，记忆，最后做到举一翻三，才能够说得上是真正掌握了所学的知识。 分析陈安之老师讲的成功学，主要包括以下7个方面关键问题： 1、拥有成功的环境；所指的环境包括生活的环境，工作的环境，身边接交的朋友等等。 2、主动出击；主要指一种积极的态度，做任何事都应该变被动为主动。 3、成功＝知识+人脉；从大多成功人的身上，我们就能够清楚看到，他们除了具有广博的知识外，还有很好的人际关系、社会网络。 4、做好顾客服务；因为每个人都在从事顾客满意度的行业，你就应该多方面去了解顾客的期望，达到顾客的期望，超越顾客的期望。 5、永远持续不断进步；每个人都应该有一种居安思危的思想，常言道“生于忧患，死于安乐。”讲的就是这个道理。在这个充满竞争的社会，如果你不学习，不进步，你就会落后，最终被竞争者打败，被社会遗弃。 6、物超所值十倍以上；你的顾客希望是能够花最少的钱，能够办到最好的事。你要留住老客户，要想吸引更多新客户，就应该做到物超所值十倍以上。让客户真正体味到你是在为他们办实事，为他们贴心服务。而不是在一味地追求利润。 7、最短时间采取最大量的行动；做任何事情都应该把握住机会和时间，并且要即时行动起来，采取具有针对性的措施，才能够取得最好的效果和收益。 一个成功的人，与他平时勤奋学习，刻苦专研是分不开的；与他对生活的热爱，对事业的执着追求也是分不开的；总之，成功不是偶然，偶然不会成功；成功其实是一种习惯。
想要成功建设一个厂房需要经过这十大操作规范
想要成功建设一个厂房需要经过这十大流程！ 如何建设一个厂房？成功建设一个厂房需要经过哪些流程？在中国，厂房建设项目主要细分为以下阶段和步骤，需要说明的是，其中不少步骤往往是同步进行的，项目成功的关键因素之一就是项目管理和协调。 一、前置审批 主要包括：工厂项目立项备案、用地、选址及环境评审、获取土地使用证及规划审批等这几项内容其中部分是可以同步进行的，大部分地区的具体操作流程基本大同小异，部分地区可能会在具体细节上顺序及操作方式会有所不同。 买地建厂投资流程：签订投资意向或合资合作意向书、工商注册(工商行政管理局)、企业名称预先核准申请表、公司具体名称、股东名称、出资总额、出资比例（如股东是法人，需带营业执照副本复印件）、验资证明、环保证明、房产证明项目备案(计划局、发改委)：编制项目简介、填写项目申请备案表、项目备案请示、企业法人营业执照正副本复印件、组织机构代码证复印件相关手续办理(环保局、建设局、土地局)：环保评审∕审批、选址意见书、建设用地规划许可证、地质灾害评估报告、土地评估、建设用地勘测定界报告、建设用地预审办理土地证(土地局)：地籍调查表、用地申请及法人身份证复印件、公司章程及营业执照、国土资源局规划股出图意见、建设部门一证一书、环保证明、一书四方案、土地评估 二、厂房选址 在全球范围内对许多制造业企业所作的调查表明，企业认为下列因素是进行设施选址时必须考虑的： 1、地理位置、当地各项成本及原材料和成品运输成本； 2、劳动力的获取条件及雇员生活环境质量； 3、与市场或客户的接近程度及服务的便利程度； 4、与供应商和生产制造资源的接近程度和便利程度； 5、政策优势及当地其它软环境。 6、越来越多的投资者关注风水和运势 三、厂房风水 工厂是商业用，以商为用当然要以财为主，如果你找的厂房财不旺，如何能发财？不旺财还劫财那你可就惨了 从年年出口的外贸顺差，到中国惊人的外汇储备。从世界产品中国造，到全世界国家都说中国强大起来了。支撑这一切繁荣的是几千万家大大小小的工厂。这种繁荣的景象无疑催生了更多的工厂，每天有上千家的工厂开业，也有几百家工厂倒闭关门，有几百家在苦苦支撑，到现在，能从激烈的市场竟争中走出来的工厂是幸运的，随着中国产品对国外市场 所占的比例越来越高，一些国外商家与媒体对中国产品的反面炒作，抓住一些问题产品大做文章，使进口国加强了对中国产品的检验，国内相关部门也加强了对生产产品的质量监管，使中小企业的生存发展空间变小，市场竟争越来越激烈。当然要理性的看待这个问题，中国经过改革开放20多年来，特别是近十年的快速发展，必然会暴露出一些发展过程中存在的问题来引起国内相关部门的重视，各大工厂也将面临新一轮的洗理——优胜劣汰。作为厂家也不用悲观，毕竟中国的市场很大，出口的大门还没关。现在开工厂，除了要看产品是否有竞争力与市场定位外，其中工厂选址就是一个很重要的环节。在什么样的地方生产什么样的产品销路好，在多旺的地方发多大的财，这些在无形之中好像都是有定数的。 在确定了项目后那么首先要找厂房，在现在经济发达的地区厂房的种类可谓是名目繁多参差不齐，大体可以分四种； 第一种；企业有一定实力后自己卖或租地建厂房自用。 根据调查现在60％以上的企业会请有经验的风水师来选址规划布局施工指导。这类企业一般都有实力发展也快。 第二种；由政府统一规划建设的经济开发区厂房。
创业成功的五大秘诀
创业成功的五大秘诀 如果你不想找工作，而是选择自己创业的话，就要做好亏钱或赢钱的准备。 “虽然赚大钱最快的方法就是自己当老板。但是，当老板一定有两种可能，一个是赚大钱，另外一个风险就是亏大钱。” 我现在给大家分享成功老板规律，经过上万个成功企业验证过的“五大创业秘诀”，助有志创业的人：赚大钱，不亏钱，少风险。 第一、要做自己喜欢、相信、有发展，而且是趋势性的行业 所谓“趋势性”行业，就是未来有巨大远景的项目。 就像十几年前大家都没有手机，如果十几年前你就做手机的话，这就是一种趋势性的行业。 趋势性行业的定义是现在大家都还没有，但是在未来几乎每一个人都会有。如果你能做一个趋势性的行业，这就给你创业成功带来很多的帮助。 如果你可以进入一种趋势性行业去创业的话，你就等于骑上了快马，创业成功的几率就有了五成的把握。 第二、降低成本，一切从简单开始 刚开始创业的时候，没花钱印名片、没花钱印宣传彩页、没花钱买复印机……因为要先想尽一切办法降低成本。 年轻人创业时，不要拿着一大笔钱，借一大堆贷款去创业，你一定要先学会降低成本，因为降低成本就等于是创造利润，同时你创业的压力也没有这么大。 降低成本地创业，心态就不会这么急，不会这么急的话，你
就比较容易按部就班，按部就班就会少风险，就比较容易创业成功。 第三、要活用《孙子兵法》 在《孙子兵法》中包含了创业的所有招式，做市场要赢，一定要用到《孙子兵法》中“赢”的策略。 因为创业成功的前提，一是对顾客要有充分的了解，二要对竞争对手有充分的了解，才能保证自己不亏钱，少风险。 怎么对顾客有很好的了解？可以先做市场调查；怎样了解竞争对手？通过顾客来探究。 竞争对手哪里好？可通过问不同的顾客群，马上就能知道竞争对手哪里好，怎样可以更好，从中就可找到自己的商机。 超越竞争对手的方法，不外乎是用更好的质量、更低的价格、更好的服务或者是更快的速度。 个人比较喜欢“赢”的策略是“物超所值”， 华人首富李嘉诚经商50多年的创业心得是：所有商业的成功都应该归功于“物超所值”。如果你可以做到“物超所值”“物美价廉”，你就很容易超越你的竞争对手。 超越竞争对手的策略是“蓝海策略”，就是做竞争对手不做的事情，也叫“避开敌人的优势”，进行“差异化营销”。 另一个超越竞争对手的策略——要与巨人合作，借别人的大军来达成自己的目标。 每一个人创业时，自己的实力、自己的资金、自己的人力资源都是很单薄的。但是如果你可以像比尔"盖茨一样，一开始就和IBM合作，那么你的成功率就很高了。 如果你可以像马云一样，和亚洲首富孙正义合作，和世界最大的互联网巨人雅虎合作，那你成功的几率就会很高。 第四、不断地进行推销与服务
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
lipo2000转染操作步骤
Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
一场成功的演讲的五个步骤
一场成功的演讲的五个步骤 研究报告表明，有超过7成的商业演讲都无法为听众创造价值。今天小编给大家分享一场成功的演讲的五个步骤，希望对大家有所帮助。 一场成功的演讲的五个步骤 步骤一、搞清楚你的听众想要从你演讲中得到什么，然后准备好这些内容。 但如果你事先不认识这些人，你怎么知道他们想要什么?比如说一个专业的演讲家不认识各位，他该如何得知观众想要什么?那么在开始写稿前，就要问自己两个问题， 1.我已经公开做演讲了20xx年，我是如何准备的? 2.我该如何简化这些复杂的过程，然后让听众可以从我的经验中获益。 步骤二、打造你自己的演讲目录
使用影片、照片或是图表而不只是文字来说明你的想法。为什么我要去听一个主讲者只是朗读目录上文字的演讲?你会想去吗? 步骤三、好好的准备来解释你的想法 排练排练再排练，直到你完全熟悉你要讲的东西。很多人会跳过这个步骤，认为这样比较省时。是吗?你会去一场表演者都没有排练过的音乐会吗?观众不会喜欢没有事先准备的演讲者。练习是成功演讲的关键。 步骤四、和观众互动 当你正式开始演讲时，你是要和你的观众对话，而不是念书给他们，也不是对他们上课。想想那些你喜欢且信任的人，他们并没有在对你上课，他们是在跟你聊天。 一场成功的演讲感觉就像是一次愉快的聊天对话，想办法让你的演讲也是这样。 当你在说明一个新想法时，要记得给范例。要适时的停下来并且问问题，如「这有道理吗?」或是「你知道我在说什么吗?」把你的讯息和你观众的生活和工作连在一起。告诉他们这个想法对他们有什么帮助。如果你能够做到这些，他们就会很专心，而你需要他们专心你才能够成功把你想讲的说清楚。 步骤五、要让你的演讲结束后可以造成明确的行动
销售十大步骤总结
销售十大步骤 一、准备 1. 机会只属于那些准备好的人 2. 一个准备得越充分的人，幸运的事降临到他头上的机会就越多 3. 为成功而准备 （一）、身体 锻炼身体是您工作中最重要的工作之一 （二）、精神 1.去拜访客户之前，复习我们产品的优点 2.熟悉同行业竞争对手产品的缺点 3.回忆最近拜访顾客的成功案例 4.联想一下与客户见面的兴奋状态 （三）、专业 优秀的销售员是一个杂学家，上知天文、下知地理 要想成为赢家，必须先成为专家 对自己的产品了如指掌，对同行业竞争对手产品如数家珍 顶尖的销售人员象水： 1. 什么样的容器都能进入 2. 高温下变成蒸汽无处不在 3. 低温下化成冰坚硬无比 4. 在《老子》73章中讲到“水善得万物而不争”“唯不争，故无尤”“不争即大争”
5. 古人把女子比喻成水，水柔，以柔克刚，故男人征服天下，女人征服男人 6. 水无定性，但有原则（涉及到公司利益、品牌、资料）（四）、顾客 1．跟专业人士了解产品信息，购买熟人产品 2．顾客买产品是冲着老板的为人，做人成功 3．了解客户详细信息，对顾客了解越多，成效的机率越大 二、良好的心态 老板的心态（事业的心态）、持久的心态（长远的心态）、 积极的心态、感恩的心态、学习的心态 三、如何开发客户 （一）、准客户的必备条件 1．对我们的产品有需求 2．有购买力 3．有购买决策权 （二）、谁是我的客户？ （三）、他们会在哪里出现？ （四）、我的客户什么时候会买？ （五）、为什么我的客户不买？ 1.客户不了解 2.客户不相信 （六）、谁跟我抢客户？ （七）、不良客户的七种特质：
1．凡事持否定态度，负面太多 2．很难向他展示产品或服务的价值 3．即使做成了那也是一桩小生意 4．没有后续的销售机会 5.没有产品见证或推荐的价值 6.他生意做得很不好 7.客户离你地点太远 （八）、黄金客户的七个特质： 1.对你的产品与服务有迫切需求（越紧急，对细节、价格要求越低） 2.与计划之间有没有成本效益关系 3.对你的产业、产品或服务持肯定态度 4.有给你大订单的可能 5.是影响力的核心 6.财务稳健、付款迅速 7.客户的办公室和他家离你不远 （九）、开发客户的步骤： 1.收集名单 2.分类 3.制定计划 4.大量行动 四、如何建立信赖感 1.形象看起来像此行业的专家 2.要注意基本的商务礼仪 3.问话建立信赖感 4.聆听建立信赖感