基于FT-NIR的微生物快速鉴定方法研究
２９４６光谱学与光谱分析第３０卷
箱中烘干（４０℃），然后用研钵研磨，制成菌体粉末。
１．３近红外光谱采集
光谱仪为德圆布鲁克ＭＰＡ型傅里叶变换近红外光谱仪，采用漫反射积分球模式采集细菌粉末的近红外光谱，检测器ＴＥ－ｌｎＧａＡｓ，扫描范围１０ｏｏｏ～４ｏｏｏ咖～，分辨率８咖～，扫描６４次。
１．４重现性考察
菌种不同时间培养３次，每次３个重复，采集近红外光谱，通过计算鉴别指数Ｄｙ－ｙ２（原始光谱）来考察方法的重现性，Ｄｙ，ｙ２根据以下公式计算
∑ｙ批一巧?岁ｚ
ｒｙｌｙ２２－７亍兰１＿＝１亍＝＝＝（１）
√∑折。一匆ｉ√∑胡；一面；
Ｖｆ＝１Ｖｉ＝ｌ
Ｄ；１ｙ２＝（１一相ｙ２）×ｌＯＯＯ（２）式（１）中，ｒｙｌｙ２为相关系数，ｙ¨，弛，分别为两个光谱的吸光度值，行为所选谱段的数据点数，蟊和多ｚ分别为两个光谱吸光度的算术平均值。Ｄ值为ｏ～２ｏｏＯ，Ｏ表示两个光谱完全相同（对于所选择的波段范围），１ｏｏＯ表示两个光谱完全不相关，２ｏｏＯ表示两个光谱完全负相关“］。
１．５数据分析
采用光谱仪自带软件０ＰＵＳ（、ｋｒＳｉｏｎ４．２，Ｂｒｕｋｅｒ（）ｐ－ｔｉｃｓ，Ｇ毛ｍａｎｙ）对光谱进行预处理，包括平滑以消除噪音，标准化以消除样品量的差异对光谱的影响，二阶导数处理消除基线漂移的影响，并提高光谱的分辨率。
采用主成分分析法（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｆＩｌｐｏｎｅｎｔａｍｌｙＳｉｓ，ＰｃＡ）对预处理后的光谱数据进行降维处理，然后建立基于ＬＤＡ和ＡＮＮ的鉴定模型，考察模型的鉴定准确率。ＰＣＡ和数学模型的建立由ＭＡＴＬＡＢ（Ｖｅｒｓｉｏｎ６．５，ＴｈｅＭａｔｈＷｏｒｋｓＩＩＩｃ．，ＵＳＡ）软件编程实现。
２结果与讨论
２．１微生物的近红外光谱
图１为不同菌株的傅里叶变换近红外漫反射光谱，可以看出不同菌种的光谱图比较相似，不能用来对微牛物进行鉴别，必须对光谱进行一定的数学转换以提高光谱的分辨率。图２为经过二阶导数处理的光谱，可以看出经过二阶导数处理后不同菌种的光谱图差异明显增大，特别是在信息比较丰富的６０００～４ｏｏｏ咖“波段范围，在下一步建市数学模型将以此波段范围的数据为基础。导数处理不仅可以消除基线漂移的影响，消除噪音，提取有用的波段信息，更重要的是可以提高光谱分辨率，这为光谱数据进一步应用于鉴别，鉴定及分类等问题提供了基础Ｌ１４．１５Ｊ。
近红外区的吸收是低能电子跃迁以及含有氢原子的原子团，如Ｃ－Ｈ．ｏ—Ｈ和Ｎ—Ｈ等的泛频或组频所产生的，不同的化合物可能会导致波峰的莺叠，因此财微生物细胞的近红外光谱进行解析目前还比较困难．但叮以通过分析细胞成分的标准品来初步解析伞细胞的近红外光谱。Ｒｏｄｒｉｇｕ盱ｓａ—ｏ∞等ｕｏＪ比较ｒ脱氧核糖核酸，糖原，卵磷脂，Ｎ－乙酰胞壁酸标准品的近红外光谱和全细胞近红外光谱，发现可以对全细胞光谱的主要谱峰进行归属分析，该研究得到的微生物细胞近红外原始光谱主要吸收峰为：５７７６，５１５４，４８６６，
４６０６，４３３４，４２５９和４０４８咖～，这与本文研究结果是类似的（图１）。
Ｗａｖｅｎｕｍｂｅ“ｃＴｎ。
Ｉ毽ｌＦＩ：Ｎｍｄｉ仃ｌ雠腭ｎｅｃｔａｌ［赋ｓｐｅｃｔ豫ｏｆｍ仃ｔ惮ｎｔｓｔ随ｉ璐１：＆ｃ以４彻摊ｗｅｓ卯一试ｓ谊已；２：Ｌ口ｃ￡ｏ妇ｃｉＺＺ“ｓ口ｃｉｄｏ砷ｉ￡“ｓ；
３：西如ｅｒｉ西缸∞“；４：ＥｈｆＰｒ０缸ｃ据ｒｃＺ∞ｍＰ＃
５：Ｂ口ｆｉＺＺ”ｓ５曲倒缸；６：Ｅｈｆ盯Ｄｋｃｆｅｒｎ舢譬研Ｐｓ
Ｗａｖｅｎ啪ｂ朗一ｃｍ．。
ｎ昏２Ｓｅ∞ｎｄ
ｄ喇憎ｔｉｖｅＳｐｅｃｔ随ｏｆｍｆｆｅ咖ｔｓｔｍｉｎｓ１：Ｓ口ｃｃ妇ｒＤｍ）ＩｃＰｊｃ盯ｉ讲ｊｉ卯；２：Ｌ口以Ｄ缸ｆ洲“５口ｆｌｄＤ户＾ｉＺ淞；
３：Ｂ如ｅ—ｆ＾缸∞“；４：岛ｆＰｒｏ妇ｃ把ｒｃＺ∞∞￡；
５：Ｂ口ｆｆＺｆ”ｓ５曲ｆｆＺ括；６：Ｅ，ｌｆＰｒｏ缸ｆ￡Ｐｒｎ舢舻卯ｓ
２．２重现性考察
方法重现性分析结果见表１。本研究中得到的Ｄｙ，ｙ２值与Ｎｇ伊Ｔｈｉ等㈨的研究结果类似，表明本研究中采集微生物细胞近红外光谱的方法重现性好，所得到的光谱可以用于进一步的分析。
ＴａＭｅｌＲ嚣ｕＩｔｓｏｆｒｅｐｍｄ嗽ｉｂｉＩｉｔｙ
菌种
酿酒酵母
嗜酸乳杆菌
大肠埃希氏菌
阴沟肠杆菌
枯草芽孢杆菌
产气肠杆菌
Ｄｙｌｙ２值
５．２９士４．８６
１０．９７士６．６５
８．８２±７．１６
４．４４士２．６４
７．４５士５．４０
１．６１土１－０５
２．３数据分析
将分子振动光谱应用于微牛物鉴定与分类的研究，一般
是借助指纹图谱技术，结合化学计量学，模式识别或者多元
第１１期光谱学与光谱分析
２９４７
统计分析方法对光谱数据进性分析。采用ＰｃＡ对光谱的二阶导数（６０００～４
ｏｏｏ
ｃｒＩｌ＿１）进行降纬，图３是一个ＰｃＡ结
果的二维投影图。从图中可以看出，不同微牛物的光谱都明显被分到了不同类别。表明傅里叶变换近红外技术结合ＰＣＡ可以识别微生物细胞的主要成分的差异。
酵母和细菌的细胞结构不同，分子振动光谱还可以用于鉴别酵母，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌［４］。枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性细菌，大肠埃希氏菌，阴沟肠杆菌和产气肠杆菌为革兰氏阴性细菌，图３中六个标准菌并没有明最被分为三个类群，并且同一个属的阴沟肠杆菌和产气肠杆菌也末被分为一个类群。这可能是因为前两个主成分并未反映全部信息。同时样品的制备方法和光谱采集程序还需要进一步优化。
图４是前两个主成分特征向量分布图。该分布图反映了原始变量（波数）在每一个主成分的权重的大小和某一波段对整个数据的变异贡献的大小。从图中可以看出，在５４００～
４
ｏｏｏ锄叫范围内，原始光谱对前两个主成分贡献较大，该
波段为微生物细胞近红外光谱的信息富集区，从图１也可以看出原始光谱的主要特征峰都位于该波段范围内，因此可以选取该波段的数据进行分析，该分布图也可以用于光谱有效波段的选择。
隐４
ｈｄｉｎｇ瞰０ｆ恤删ｐａｌ咖岬吣（№）
ｄ＇ｔ函Ｉ－ｅｄ
ｆｒ帅ＰＣＡ咖Ｉ伍
２．４菌种鉴定
分别建立基于Ｕ）Ａ和ＡＮＮ的模璎对得到的光谱进行鉴定，取前１４个主成分（累积方差贡献率大于９０％）数据为模型的输入。本次实验共收集６０个近红外光谱，其中４２个
用来训练模璎，１８个用来验证模型的准确性，ＬＩ）Ａ模型用准确率进行评价，ＡＮＮ模型用平均相对误差进行评价。表２为两个模型的预测结果，其中ＬＤＡ模型准确率为１００％．ＡＮＮ模型平均相对误差为５．７５％，都取得了较高的预测准确度。与ＡＮＮ模型相比，Ｕ）Ａ模型可以得到更直接更明确的鉴定结果并具有较高的准确性，更适合于微牛物鉴定之类的问题。对于ＡＮＮ模型，网络的结构和训练集数据都会影响到模型的准确性［”］。在本研究中，ＡＮＮ模型采用误差反
向传播（ＢＰ）算法进行计算，建立的是一个ＢＰ～烈州模型，
该模型易于实现。但结构简单，冈此该模型需要进一步优化，同时需要增加训练集样本的数量进一步提高模型的预测准确率。
Ｔｈｂｋ２
Ｒ瞄山ｔｓｏｆｔｗｏｉｄｅｎｔｉ行国ｔｉ叽埘目曲恼
Ｎ０．Ｓ哪ｐｌｅ
Ｉ．ＤＡｍｏｄｅｌ
ＡＮＮｍｏｄｅｌ
Ａｃｔｕａｌ
Ｐｒｅｄｉｃｔ
Ａｃｃｕｒａｃｙ阳ｔｅ
Ａｃｔｕａｌ
Ｐｒｅｄｉｃｔ
Ａｖｅｒａｇｅｒｅｌａｔｉｖｅ
ｅｒｍｒ
１００％
％
ＣＪ
７●
５
２
Ｏ
９６
８ｌ
１
８
８
Ｏ
７
０
６６
４
６
９
１
３
２
２６
２３
４
５２
７
２５７６７
４２０
９４３７６Ｏ９７９９９３５１４７６７９９６０１８９ｌ６８８ｌＯ９
７Ｏ８８３３３
４４４
５５５
６
６
６６６ｎｎ
●，●筋筋筋加ｍ
ｍ
●２３
４
５６７８
培Ｈ
基于FT-NIR的微生物快速鉴定方法研究
作者：岳田利， 王军， 袁亚宏， 高振鹏， YUE Tian-li， WANG Jun， YUAN Ya-hong， GAO ghen-peng
作者单位：西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西,杨凌,712100
刊名：
光谱学与光谱分析
英文刊名：SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS
年，卷(期)：2010,30(11)
被引用次数：5次
参考文献(17条)
1.Maquelin K;Kirschner C;Choo-Smith L P查看详情 2002
2.Naumann D;Helm D;Labischinski H查看详情 1991
3.Mariey L;Signolle J P;Amid C查看详情 2001
4.Nauman D Infrared Spectroscopy in Microbiology 2000
5.Curk M C;Peladan F;Hubert J C查看详情 1994
6.Amid C;Mariey L;Curk-Daubie M C查看详情 2000
7.Maquelin K;Choo-Smith L P;van Vreeswijk T查看详情 2000
8.Maquelin K;Kirsehner C;Choo-Smith L P查看详情 2003
9.Lopez-Diez E C;GoodacreR查看详情 2004
10.Rodfiguez-Saona L E;KhambatyFM;FryFS查看详情 2001
11.Rodriguez-Saona L E;Khambaty F M;Fry F S查看详情 2001
12.Rodriguez-Saona L E;Khambaty F M;Fry F S查看详情 2002
13.Rodriguez-Saona L E;Khambaty F M;Fry F S查看详情 2004
14.Kansiz M;Heraud P;Wood B查看详情 1999
15.Archibald D D;Kays S E;Himmelsbach D S查看详情 1998
16.Ngo-Thi N A;Kirschner C;Naumann D查看详情 2003
17.AbHaddad L;Morris C W;Boddy L查看详情 2000
引证文献(4条)
1.杨丽君,李兆杰,王静,王骏,胡巧茹,刘玉敏,崔凤杰傅立叶变换红外光谱技术对3种李斯特氏菌的快速分类鉴定[期刊论文]-食品与生物技术学报 2013(02)
2.王胜鹏,龚自明,高士伟,郑鹏程,滕靖,王雪萍,叶飞,卢素芳近红外光谱结合神经网络判别茶鲜叶产地[期刊论文] -中国计量学院学报 2014(04)
3.杨丽君,李兆杰,宋晓华,王静,刘玉敏,崔凤杰傅立叶变换红外光谱技术对5种沙门氏菌的快速分类鉴定[期刊论文]-微生物学通报 2013(02)
4.刘波,胡桂萍,肖荣凤尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸生物标记鉴别特性[期刊论文]-中国农业科学 2012(24)
引用本文格式：岳田利.王军.袁亚宏.高振鹏.YUE Tian-li.WANG Jun.YUAN Ya-hong.GAO ghen-peng基于FT-NIR的微生物快速鉴定方法研究[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2010(11)