促红细胞生成素促进体外鼠胚脑皮质神经干细胞增殖

解剖科学进展　Progress of Anatomical Sciences　2010 Nov, 16(6):570~573

1231111

袁丽丽，马登殿，杜红梅，孔佑华，张慧，任妍，郭岩（1. 济宁医学院组织胚胎学教研室，山东日照276826；2. 济宁医学院附属医院耳鼻喉科，山东济宁 272000；

3. 潍坊医学院组织胚胎学教研室，山东潍坊 261042）

【收稿日期】2010-07-14

摘要目的　检测体外培养SD大鼠胚脑皮质神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖和分化的生物学特性，为NSCs研究提供适宜的细胞模型；探讨促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对NSCs增殖的影响，为NSCs的相关研究提供实验依据。方法本研究对孕14 d(E14) SD大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察，以nestin免疫荧光染色鉴定NSCs，微管相关蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP2）和神经胶质原纤维酸性蛋白（glia fibrillary acid protein，GFAP）检测NSCs分化。取第三代（P3）NSCs向悬浮培养基中添加不同剂量的EPO，通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测法检测NSCs的增殖情况。结果　分离E14d SD大鼠胚脑皮质，在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养，可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代，神经球内的细胞均呈Nestin阳性、 BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中，神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。与对照组对比，加入≥5U/ml EPO后MTT检测NSCs OD值明显增高。结论　SD大鼠胚脑皮质体外培养可得到大量增殖的神经干细胞并能分化为神经元和神经胶质细胞， EPO可促进体外NSCs的增殖。【关键词】　Sd 大鼠；皮质；神经干细胞；体外培养；促红细胞生成素

【中图分类号】　R322.81；Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】1006-2947（2010）06-0570-04

【】1231111

YUAN Li-li , MA Deng-dian , DU Hong-mei , KONG You-hua , ZHANG Hui , REN Yan , GUO Yan (Department of Histology and Embryology, Jining Medical College, Rizhao 276826 China; 2. E.N.T .Department, Affiliated Hospital of Jining

Medical College, Jining 272000 China; 3. Department of Histology and Embryology of Weifang Medical College，Weifang 261042 China)

【】【】　Abstract Objective The proliferation and differentiation of neural stem cells （NSCs） of cortex were

studied in embryonic Sprague-Dawley rats in vitro, and the effect of erythropoietin （EPO）on the proliferation of the NSCs was explored. Methods The NSCs were isolated and cultured in serum-free suspension, then cultured by differentiating suspension and identified by nestin immunohistochemistry. The self-renewal of NSCs was detected using light microscope and electron microscope. Microtubule-associated protein 2（MAP2）and glia fibrillary acid protein（GFAP) were used to detect the differentiation of NSCs by immunofluoresocytochemistry. 0.5, 5, 50 and 500u/ml concentrations of EPO were added respectively to NSCs serum-free suspension to determined the proliferaton of NSCs by light microscope and MTT test. Results The cells of cortex in embryonic rats were isolated and cultured in serum-free suspension. Nestin-positive and BrdU-positive cells were detected in neural sphere, MAP2 and GFAP positive cells were found in serum with 10% FBS. The EPO supplementation groups displayed a significant increase of NSCs and OD values compared with the control group. Conclusion EPO can promote the proliferation of the NSCs in vitro with a concentration dependent manner.

Key words Sprague-Dawley rats；cortex；neural stem cells; in vitro; erythropoietin

The proliferation of the cultured neural stem cells of cortex promoted by

erythropoietin in SD rats

[1]的生长、发育，抗神经细胞凋亡等对CNS起到保护Mckay 认为NSCs具有自我更新并分化为神经元[2,3]和胶质细胞的能力。近年来研究发现，促红细胞生作用。本实验对鼠胚脑皮质行体外培养，鉴定为成素（enrythropoitin，EPO）可通过调节神经干细胞

神经干细胞后，加入EPO观察EPO对体外神经干细胞增殖的影响。

鼠抗MAP2、小鼠抗GFAP一抗（单标）或者大鼠抗1　材料与方法

BrdU及小鼠抗nestin混合一抗（双标），4℃冰箱过1.1 材料

夜。冲洗后滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG（单标）或雌性、雄性成年未经产SD大鼠由潍坊医学院实者FITC标记的羊抗大鼠IgG及Cy3标记的羊抗小鼠混验动物中心提供。将成年雌雄SD大鼠于晚8点按2：合二抗（双标），避光条件下37℃孵育60 min，冲1比例合笼，次日早8点阴道涂片查精子，查到精子洗。滴加终浓度为10μg/ml 的Hoechst332589（单标者记为E0d。

经此步骤），37℃避光孵育30min，冲洗，防淬灭封生长培养基：DMEM/F12（1：1，Hyclone），片剂封片，4℃冰箱避光保存，激光共聚焦显微镜观2%B27（Gibco），20ng/ml bFGF（Sigma），20 察、拍照。对照实验：以0.01M PBS代替第一抗体，ng/ml EGF（Sigma），100 U/ml青霉素，100 μ其余步骤相同。

g/ml链霉素。分化培养基：DMEM/F12（1：1， 1.4 实验分组和倒置相差显微镜观察

Hyclone），10%胎牛血清（杭州四季青），100U/ml 将P3 NSCs悬液接种于添加EPO的生长培养基青霉素，100μg/ml链霉素。中，根据EPO的终浓度随机分为四个实验组，即1.2 NSCs的分离和传代

0.5、5、50、500 U／ml组，另设不加EPO的对照取胚胎14天（E14d）SD大鼠，脱臼处死，无菌组。放入37℃、5％CO 条件下静置培养，待形成神2条件下分离大鼠脑皮质，机械吹打成小块，加入经球后，将各组分别接种于含10％FBS的分化培养基0.25%胰蛋白酶37℃消化10min，过滤离心弃上清，中，实验组添加EPO，对照组不加EPO。每组均设复5加入生长培养基，调整活细胞密度5×10/ml，接种孔，实验重复3次。每日在倒置显微镜下观察细胞生于培养瓶中，置于37℃、5%CO 、饱和湿度培养箱长状况，适时采集照片。2中培养。细胞换液采取只加入不吸弃的方法，细胞 1.5 MTT检测

接种后培养24h换液一次，以后每两天换液一次。待取P3代NSCs的单细胞悬液按上述方法分组，将5接种6-7d神经球长到由50~200个细胞组成时，采用细胞悬液以1×10/ml种植于96孔板中，每孔体积胰蛋白酶加机械吹打的方法制成单细胞，离心弃上200μl，设4复孔，并在每个96孔板中设置空白对照5清，生长培养基重悬，以5×10/ml的细胞密度进行列（此列每孔加入200μl无血清培养基）。每日观传代，传第1代的细胞记为P1，按上述方法传代三次察细胞的生长状况，并且测定OD值。方法：每孔加即传至P3。每日在倒置显微镜下观察细胞生长状入MTT（5g/L）20μl，置于37℃、5%CO 、饱和湿度2况，适时采集光镜照片，并制作电镜标本观察拍培养箱中继续培养4h，将孔内的细胞离心收集，每照。

孔加入150μlDMSO，振荡10min后，酶标仪490nm波将P3代单细胞悬液接种于含50mg/L BrdU的无血长下自动检测OD值。实验重复3次。

清培养基中，培养7 d的细胞悬液离心弃上清，加入统计学分析：数据采用SPSS11.5统计学软件处血清培养基，将神经球以适当的密度接种入预先置理，各组均数比较采用方差分析。

入L-多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培养板中培养，6-8h吸去24孔板中的培养基，每孔加入0.01M PBS洗 2 结果3次，取出盖玻片分别用冷丙酮固定10min，进行　

2.1 倒置相差显微镜及电镜观察结果

BrdU及Nestin的免疫荧光染色。

从SD大鼠E14 d鼠胚脑皮质分离得到的单细胞，1.3 鼠胚大脑皮质神经干细胞的自然分化和鉴定

悬浮生长，呈圆球形，细胞饱满，折光性强，台盼取P3代的神经球悬液离心，1000rpm、5min，弃蓝染色计数活细胞>96%。获取的细胞在无血清培养上清，加入血清培养基重悬细胞，将神经球置于预基中培养24h，大部分细胞呈悬浮生长，4个或8个细先涂有L-多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培养板中行胞形成的细胞团较多见，双细胞也较多。少部分细分化培养，7d后行MAP2、GFAP免疫荧光染色，观胞紧贴底壁，呈现由十多个至几十个细胞聚集形成察其生长分化状况。

的细胞团。细胞团边界清楚，折光性强。培养72h，免疫荧光染色: 细胞爬片冷丙酮固定10 min，出现较多的由十多个至数十个细胞形成的呈悬浮状0.01 M的PBS（pH 7.2）冲洗。滴加2N HCl、37℃孵态的细胞团即为神经球。随时间的延长，贴壁细胞育30min（加BrdU的需经此步骤），正常羊血清封渐趋减少，神经球越来越大。第5-7天，细胞几乎全

闭，37℃孵育30min；甩掉多余血清，不洗。滴加小

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超微结构形态与24h时相似，细胞之间出现连接（图2）。7d少数细胞出现凋亡的形态学改变，有核染色质边集、核固缩等。本实验通过电镜观察结果显示，培养的细胞核浆比例较高，细胞器也较少，与干细胞的一般形态特征一致。2.2 免疫细胞染色和荧光染色

BrdU与Nestin免疫荧光双标染色结果显示，神经细胞球中的胞核较大呈强绿色荧光，胞浆较少呈现红色荧光，BrdU阳性细胞也呈Nestin阳性(图3)。呈悬浮状态，神经球多由数十个到数百个细胞组MAP2免疫细胞化学染色：阳性细胞胞浆及突起着成，细胞排列紧密。传代培养后，单细胞可增殖形色，呈棕黄色，胞体较小、突起长（图4）。成小神经球，小神经球不断增大可形成由数百个细GFAP免疫细胞化学染色：阳性细胞胞浆及突起着胞构成的大神经球。

色，呈棕黄色，胞体较大、突起粗而短（图5）。电镜观察，24h时大部分细胞的胞核较大，形态 2.3 EPO的作用和MTT检测结果

较规则，核仁明显，核质比较大，细胞器较少，有倒置相差显微镜观察可见，细胞接种48 h时，些细胞内还可观察到双核（图1）。72h，120h细胞

EPO各组细胞分裂相明显多于对照组；随着培养时

Fig 1. Electron microscope photograph of neural stem cell cultured for 24h showing double nucleus in the same cell ×7.0kx

Fig 2. Electron microscope photograph of neural stem cell cultured for 120h showing high electron density region between two cells ×

40.0kx

Fig 3. Colocalization of BrdU(green) and Nestin(red) positive cells in neurosphere Scale bar=20μm

Fig 4. MAP2 positive cells in differentiated serum cultured for 7 days with antibody against MAP2(green), and Hoechst dye(blue). Scale

bar=10μm

Fig 5. GFAP positive cells in differentiated serum cultured for 7 days with antibody against GFAP(green) and Hoechst dye(blue). Scale

bar＝10μm

Fig 6. Neurosphere in 5U/ml EPO group in primary culture . Scale bar＝100μm

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Fig 7. OD values in each groups

间的延长，神经球数量逐渐增多，普遍大于对照EPO是一种含唾液酸的酸性热稳定（80℃）糖[4]组，尤其是EPO剂量为5 U/ml和大于5 U/ml的各组，蛋白。Yu等的研究表明，EPO及其受体在脑部及脊神经球数量和大小明显高于正常对照组（图6）。

髓具有防止细胞凋亡的功能，对于神经细胞正常发EPO实验各组OD值都高于正常对照组，尤其是育具有重要作用。有研究表明在缺氧／缺血时，EPO剂量为5 U／ml和大于5 U／ml各实验组的生长曲EPO对CNS具有明显保护作用。在体实验EPO对线显著高于对照组（ <0.01，图7）NSCs的研究较多，也取得了很大的进展。赵舒武等[5]研究发现，EPO促进体外培养的胚胎神经管NSCs增3 讨论

殖，与我们实验观察结果EPO促进体外培养的鼠胚脑皮质NSCs增殖相吻合。NSCs的增殖、发育和分化神经干细胞是当今神经科学领域的研究热点。受外来信号和自身基因共同调节，是一个非常复杂本实验从大鼠胚胎脑皮质分离NSCs，应用无血清培的过程，下一步将继续深入研究NSCs定向分化的诱养技术培养，即在基础培养液中添加了较高浓度的导因素及其分化机制，为实现NSCs移植治疗中枢神EGF（20ng/ml）和bFGF（20ng/ml），以维持NSCs的经系统疾病提供理论基础。

增殖状态。本实验通过电镜观察结果显示，培养的细胞核浆比例较高，细胞器也较少，与干细胞的一【参考文献】

般形态特征一致。本实验神经球电镜照片观察到细[1] Mckay R. Stem cells in the central nervous system[J]. Science, 1997, 胞间出现连接方式，考虑为神经球难以分离成单细276: 66-71.

胞的原因之一。巢蛋白（Nestin）属于第Ⅳ类中间丝[2] Junk AK, Mammis A, Savitz SI, et al. Erythropoietin administration 蛋白，巢蛋白具有维持神经前体细胞正常形态的作protects retinal neurons from acute ischemia-reperfusion injury[J]. 用，本实验Nestin作为NSCs的标记物，其免疫荧光染Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:10659-10664.

[3] Siren AL, Fratelli M, Brines M, et al. Erythropoietin prevents 色结果，在生长培养基中原代及传代培养的细胞爬neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress[J]. 片数小时后呈Nestin/BrdU 双标阳性，表明培养的是Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 4044-4049.

NSCs，且具有增殖的潜能。鼠胚脑皮质NSCs在培养[4] Yu X, Shacka JJ, Eells JB, et al. Erythropoietin receptor signalling is 基添加10%FBS条件下贴壁分化。免疫荧光细胞化学required for normal brain development[J]. Development, 2002, 129:505-516.

染色显示分化细胞有MAP2、GFAP特异性抗原表[5] 赵舒武，高英茂，张晓丽, 等. EPO对体外培养的神经干细胞增达，表明鼠胚脑皮质NSCs具有分化为神经元、星形殖、分化和凋亡的影响[J]. 神经解剖学杂志, 2007, 23(5): 549-胶质细胞的能力。

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第六届全国解剖与临床学术研讨会（头颈部专题）征文通知

根据《解剖与临床》杂志第五届编委会第一次变的临床与解剖研究；5、头颈部结构及病变的断层会议工作安排，由《解剖与临床》杂志社主办、山解剖学和影像学（CT、MRI、fMRI、超声、核医学东大学医学院承办的第六届全国解剖与临床学术研和介入放射学等）研究。

讨会（头颈部专题），定于2011年4月下旬在山东省2．征文要求

论文未经公开发表，包括结构式中英文摘要青岛市召开。现将会议有关事项通知如下。（各400字）及中文全文各1份，并在稿件首页下方1．征文内容

凡涉及颅脑部、颅（颌）面部、颅底部和颅颈注明“征文”字样、联系电话和电子信箱。通过电交界区域的结构及病变的临床与解剖研究文章，均邮发至062505@https://www.360docs.net/doc/8214168503.html,；或通过信件寄至安徽省蚌为本届学术会议的征文内容。1、颅脑部，主要与神埠市长淮路287号《解剖与临床》杂志编辑部，邮编经内、外科有关的结构及病变的临床与解剖研究；233004，请在信封上注明“征文”字样，张萍主任2、颅面部，主要与眼科、耳鼻咽喉-头颈外科有关收。征文截止日期：2011年3月30日，以邮戳为准。

的结构及病变的临床与解剖研究；3、颌面部，主要与口腔颌面外科和整形外科有关的结构及病变的临《解剖与临床》杂志社床与解剖研究；4、颅底部，主要与颅底外科有关的山东大学医学院前颅底、鞍区、中颅底、侧颅底及颅颈交界区域病

2010年7月30日

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