流式细胞仪操作方法facs

设备名称：流式细胞仪

型号：FACSCalibur

国别厂家：美国Becton Dicknson公司

主要指标

1、激发激光波长488 nm;

2、三个荧光检测器FL1(535nm)、FL2(585nm)和FL3(630 nm)。

3、FL CV<2%

4、分选：P>97%

功能及应用范围

1．可对有机微颗粒(细胞)和有机微颗粒内(细胞内)的物质、结构的物理和生物特性进行定量和定性分析。

2．本技术广泛应用于基础和临床医学研究。

流式细胞仪使用流程

一、开机程序

1.检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。

2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSF Low），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3.将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5—10分钟。排除过滤器内的气泡。

4.如果需要打印，打开打印机电源。

5.打开电脑，等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6.执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell 中的气泡。

7.分析样品时，先用FACSF Low或PBS进行HIGH RUN 约2分钟。

做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

二、预设获取模式文件（Acquisition Template Files）

从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition

作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。

选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法绘出一个Histogram（直方图）。

将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications\CELLQuest Folder\EXP 文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。

三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整

1.从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。

2.从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect To Cytometer （快捷键：苹果键+B）进行电脑和仪器的联机。将出现的Acquisition Control对话框移至合适位置。

3.从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps，Threshold，Compensation，Status等四个对话框，并将他们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取文件。也可以用&+1，2，3，4获得此四个对话框。

4.在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifier mode）：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param 选择FL2，而FL1，FL2，FL3皆以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以

Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Log进行测量。

5.放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH或LOW上。

6.在Acquisition Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart 以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉Setup前的“√”。

7.在Detectors/Amps对话框中，调整FCS和SSC检测器中的信号增益：PMT voltages (粗调)与Amp Gains(细调)，使样品信号出现在FCS-SSC点图内，且三群细胞分布合理。

8.在Threshold对话框中选择适当的参数设定阀值，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

9.从屏幕左列绘图工具中选择Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。

10.在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器(FL1, FL2, FL3, FL4)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。

11.在Compensation对话框中，根据所用的调整补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1＋FL2－的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内，则需调大FL2－? % FL1中的“？”，并从FL1－FL2点图中观察新的调整是否恰当。

12.在Status对话框中，Laser Power：正常值－Run/Ready 为14.7 mW，Standby为5 mW；Laser Current：正常值为6 Amps左右。

13.调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。

四、通过预设的获取模式文件进行样品分析

1.从苹果标志中选择CELLQuest，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。

2.从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect To Cytometer （快捷键：苹果键+B）进行电脑和仪器的联机。将出现的Acquisition Control对话框移至合适位置。

3.从Cytometer指令栏中选择Instrument Settings, 在其对话框中选择Open调出以前存储的相同实验的仪器设定参数，按Set确定。

4.在Acquire指令栏中，选择Acquisition & Storage决定存储的细胞数、参数、信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对样选择不同的参数。

5.在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定伟建存储位置(Folder), 文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记（panel），即安排tube1, 2, 3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对样的不同分别存储于FACStation G3\BD Application\CELLquest\IMM和DNA文件夹中，文件根据日期命名。

6.在Cytometer指令栏中，选择Counters, 将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。

7.将样品管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以后启动样品分析测定。

8.微调仪器设定，待细胞群分布合适后轩瑟Acquire Control对话框中的Pause, Abort，去除Setup前的“√”，开始正式获取信号，存储数据。

9.当设定数目的细胞被检测后，获取自动停止并自动存储数据。重复步骤7，继续分析其余样品，至到所有样品数据分析完毕。

10.当所有样品分析完毕，即换上td H2O，并将FCM置于“Standby”状态，以保护激光管。

五、关机程序

1、从File中选择Quit，退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。

2、用4ml 1: 10 稀释的漂白液做样品，将上样管至于旁位(Vacuum is On)，吸去约2ml, 再将样品架置于中位（Vacuum is off），再High Run 5分钟。

3、改用td H2O 4 ml 做样品，同上处理。

4、按Prime 三次。

5、此时仪器自动转为Standby状态，换2ml td H2O，在仪器处于“Standby”状态10分钟后在依次关掉电脑、主机、

电源。

6、填写使用登记本。