啤酒废酵母细胞破壁方法的研究_孟国庆
啤酒废酵母全身都是宝，它含有丰富的蛋白质、核糖核酸、维生素Ｂ族、脂类、多糖和酶等多种营养成分和某些协调因子，具有多种生理功能。随着啤酒产业的迅猛发展，啤酒废酵母产量也与日俱增。我国现有啤酒企业５００多家，年产啤酒３０００多万ｔ，每年产啤酒废酵母６０￣９０万ｔ。啤酒废酵母大都经过简单烘干作为饲料，没做进一步加工，仍然没有形成对啤酒副产物的真正综合利用。研究发现，啤酒酵母不但可用于啤酒生产，而且在食品和医药工业也有广泛应用，如可提取蛋白质、胞壁多糖、维生素、核酸和核苷酸类物质及谷胱甘肽等，也可生产食品添加剂及功能性食品。如果能将啤酒行业中产生的废弃酵母综合利用，既可以减少对环境的污染，也可以回收大量的高附加值资源，产生巨大的经济效益和社会效益。
啤酒废酵母综合利用的第一步是对酵母细胞进行破壁处理［１］。微生物细胞壁的结构和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互交连的程度，破碎细胞的主要阻力来自于连接细胞壁网状结构的共价键。了解细胞壁的组成和结构，有助于选择合适的破壁方法［２］。酵母细胞的细胞壁是比较坚实的，其厚度大约为
啤酒废酵母细胞破壁方法的研究
孟国庆王传宝朱陶张海丽王宜磊觹
（菏泽学院生命科学系，山东菏泽２７４０００）
摘要：本文采用反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨等方法对啤酒酵母细胞进行破壁处理，对细胞破壁率、海藻糖得率和破壁时间进行分析比较，结果表明：微波法的细胞破壁率（49%）和海藻糖得率（5.64%）最高，且时间（30min）最短。通过对这6种破壁方法的研究，为啤酒废酵母的综合开发利用提供理论数据和技术条件。
关键词：啤酒废酵母；破壁方式；革兰氏染色；海藻糖
中图分类号：Q93-3文献标志码：A文章编号：1008-1038(2014)12-0030-05
Research on the Cell Wall-Breaking Method of Waste Beer Yeast
MENG Guo-qing WANG Chuan-bao ZHU Tao ZHANG Hai-li WANG Yi-lei*
（Life Sciences Department,Heze University,Heze274000,China）
Abstract:The methods of repeated freezing and thawing,ultrasonic,microwave,salt,enzymatic and liquid nitrogen grinding on wall-breaking were compared and the trehalose yield and broken walls of time were analyzed in this study.Results showed that the method of microwave was the best way to get the rate of broken yeast cells(49%),the trehalose yield(5.64%)and the time(30min).Through the study of the six wall-breaking methods,we provided experimental basis and technical conditions to further comprehensive exploitation and utilization of waste beer yeast. Key words:Beer waste yeast cells;methods of broken wall;gram staining;trehalose
收稿日期：２０１４－０６－２４
基金项目：山东省科技计划项目（２０１１ＧＳＦ２１１４）；菏泽市科技计划项目（２０１０Ｓ００２）
作者简介：孟国庆（１９８４—），男，助教，研究方向为应用微生物技术
*通讯作者：王宜磊（１９６４—），男，教授，研究方向为微生物生理、资源与利用
０．１￣０．３μｍ，重量占细胞干重的１８％￣３０％，主要构成为葡聚糖（３５％￣４５％）、甘露聚糖（４０％￣４５％）、蛋白质（５％￣１０％）、几丁质（１％￣２％）、脂类（３％￣８％）、无机盐（１％￣３％），其结构类似三明治，外层为甘露聚糖，中间是一层蛋白质分子，其中有的是以与细胞壁结合的酶的形式存在，内层为葡聚糖［３］。根据酵母细胞壁的组成和结构，选择合适的破壁方法。
细胞破壁的方法很多，按照作用方式的不同划分，可以分为三类：物理法，如高压匀浆破碎法、超声波破碎法、微波破碎法等；化学法，如酸热法、化学渗透法；生物法，如酶溶细胞破壁法等［４］。这些方法各有其自身的局限性和不足，为此，国内外学者进行了大量的试验研究，以期找到理想的破壁方法［５］。刘明源等［６］研究６种破壁方式对啤酒酵母细胞中海藻糖溶出的影响，寻求能高效提取啤酒酵母细胞海藻糖的破壁方法。王凤琴［７］在从啤酒废酵母中提取ＲＮＡ时就曾使用１０％的食盐配合热处理对酵母细胞进行破壁，提取出的ＲＮＡ得率为２．２５％，提取时间为４ｈ，提取温度为９０℃。黄国荣［８］在啤酒酵母多糖提取产工艺的研究中使用高压均质法对酵母细胞进行破壁，提取多糖的得率为３．０３％。郭卫芸等［９］采用反复冻融法对啤酒废酵母进行研究，在反复冻融３次时，破壁率可达３５％，可溶性蛋白溶出率为５０．２９％。
鉴于上述酵母细胞破壁方法的研究，本文遵循产物高释放率、低能耗和便于后续提取的原则，旨在探索“环境友好型”的细胞破壁方法。以废弃啤酒酵母泥为原料，采用反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨等方法对啤酒酵母细胞进行破壁处理，分别对细胞破壁率、海藻糖得率和破壁时间进行比较分析，微波法的细胞破壁率（４９％）和海藻糖得率（５．６４％）最高，且时间（３０ｍｉｎ）最短。通过６种破壁方法的研究，为废弃啤酒酵母的综合开发利用奠定技术基础。
1材料与设备
1.1材料与试剂
啤酒废酵母，青岛啤酒（菏泽）有限公司。
蜗牛酶，上海源叶生物科技有限公司。
ＮａＣｌ（ＡＲ）、革兰氏染色液、蒸馏水等。
1.2仪器与设备
超声波细胞粉碎机，Ｙ９２－Ⅱ型，配有超声波细胞粉碎机隔音箱，宁波新芝生物科技股份有限公司；
微波炉，合肥荣事达三洋电器股份有限公司；
恒温水浴箱，北京长安科学仪器厂；
台式高速冷冻离心机，ＴＧＬ－１６型，上海安亭科学生物仪器厂；
冰箱，青岛海尔股份有限公司；
数码显微镜，ＯＬＹＭＰＵＳＤＰ７２，奥林巴斯数码仪器公司；
超滤离心管，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ３ＫＤａ，苏格兰产；
台式高速冷冻离心机，ＨＲ／Ｔ２０Ｍ，湖南赫西仪器装备有限公司。
2方法
2.1啤酒废酵母的预处理
啤酒废酵母→过筛（１００目）→离心洗涤→５％酒石酸脱苦→离心洗涤→过筛（１００目）→离心洗涤→蒸馏水→离心洗涤→干净酵母泥
2.2破壁方法
２．２．１反复冻融法
反复冻融法是利用冻结－解冻过程中内部冰晶体对细胞壁的机械作用而使其破裂的一种物理方法。该方法比较温和，可避免高温对原料造成的营养损失、风味劣变等不良影响［１０］。
称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比１：３制成酵母悬液，分别于－２０℃冰箱中反复冻融３￣５次，每次冷冻时间２ｈ，１００℃水浴中解冻２０ｍｉｎ。
２．２．２超声波法
超声波法是一种有效的、温和的破碎细胞的方法，是利用超声波的“空化作用”，产生局部高温高压，并形成强大的冲击波，而使细胞破碎。同时，高速射流可对细胞组织产生物理剪切力，使之变形、破裂并释放出内含物，这就大大加速了细胞破碎的过程，是解决啤酒废酵母资源再利用的新途径［１１］。
称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比１：３制成酵母悬液，设定功率３００ｗ，于冰浴条件下进行超声破碎３０ｍｉｎ（设定工作５ｓ，间隔１０ｓ）。
２．２．３微波法
微波是利用微波场将电能转化为热能，导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破［１２］。
称取适量新鲜酵母泥，在平皿上铺成均匀薄层，置于微波炉中处理１０ｍｉｎ，微波工作功率为７００Ｗ。２．２．４盐法
盐法是通过调节酵母所处环境的渗透压，使细胞壁或细胞膜通透性增大。高浓度的盐可产生高的渗透压，使细胞失水，质壁分离，在外力作用下使细胞自身破裂。盐法以其提取条件温和，成本低的优点，得到广泛应用［１３］。
称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比１：３制成酵母悬液，加入ＮａＣｌ制成浓度为２．０％盐溶液，于８０℃水浴中处理６０ｍｉｎ。
２．２．５蜗牛酶法
酶法破壁是在酶的作用下溶解细胞壁，蜗牛酶是一类混合酶，它能溶解酵母和植物的细胞壁。酶法破壁对营养物质损伤小，破壁条件温和，成为近年来研究的热点。
称取适量酵母泥，加入蒸馏水，按料液比１：３制成酵母悬液，然后按照每克鲜酵母加入１ｍｇ蜗牛酶（酶活１０００ｕ／ｍｇ）的比例，３７℃恒温水浴摇床上处理４ｈ。２．２．６液氮研磨法
液氮温度为－１９６℃，它既能使各种组织成分不易被破坏或降解，又能使组织变硬，脆性增加，易于磨碎。液氮研磨，一是，终止细胞内外一切生物反应，比如提取ＲＮＡ时，防止ＲＮＡ酶的降解反应等；二是，在液氮中的细胞完全冻硬了，研磨可达很好破胞效果，使里边的物质释放出来。
称取适量新鲜酵母泥，直接放入预先处理好的研钵中，加入适量液氮，在其沸腾状态下进行多次研磨，直至研磨成细粉状。
2.3测定方法
２．３．１破壁率的测定方法
将６种方法破壁后的酵母悬液，４５００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，上清液再过３０００Ｄ的超滤，超滤离心管装液量１０ｍＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，收集超滤滤过液，离心分离，采用蒽酮－硫酸法测定海藻糖含量。沉淀部分分别进行革兰氏染色，对比不同破壁方法革兰氏染色差别。点样至血球细胞计数板，对酵母菌进行直接计数，按照以下公式计算样品中酵母总数和已破壁的酵母细胞数量，计算破壁率。
１ｍＬ菌液中的细胞数（个）＝Ｃ
５
×２５×１０×１０００×Ｄ式中：Ｃ—５个中方格中酵母总数；
Ｄ—稀释倍数。
２．３．２破壁时间的测定方法
破壁时间的计量，由于反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨这６种破壁方法的操作条件不同，以实验过程中每种方法最终得到破碎酵母细胞悬液的平均操作时间为准。
3结果与分析
3.1蒽酮-硫酸法测糖标准曲线的制作
配制海藻糖标准品梯度浓度，在５９０ｎｍ的波长下测定吸光度，以海藻糖标准品浓度为横坐标，以ＯＤ值为纵坐标，绘制标准曲线。
图1海藻糖标准曲线
Fig.1Standard curve of trehalose
如图１所示，海藻糖标准溶液在给定浓度之间呈良好的线性关系，得到回归曲线方程
ｙ＝０．６４０２ｘ－０．００６２，Ｒ２＝０．９９９０。
3.2不同破壁方法革兰氏染色效果及破壁率的比较
通过对上述６种方法处理后的酵母悬液进行革兰氏染色后，显微镜下观察，能观察到不同处理的酵母细胞的破壁效果，见图２。
图2不同破壁方法革兰氏染色效果图
Fig.2Renderings of different gram wall-breaking method
通过革兰氏染色，显微镜下明显观察到酵母细胞有红色和紫色之分，红色的细胞说明细胞壁被破除
。
通过三次平行试验，
由血球板计数，对各种方法的破壁效率进行比较。如图３所示。
图3不同破壁方法破壁率的比较（n=3）
Fig.3Comparison of wall-breaking rate of different wall-breaking method （n=3）
由图３可知，
反复冻融法，破壁率达到３６％；超声波破碎法，破壁率达到４２％；微波法处理后，破壁率达到４９％；盐法，酵母破壁率为２５％，蜗牛酶法，壁率达到３９％；液氮研磨处理后破壁率为３１％。由此可见，酵母破壁率较高的是微波法。3.3
不同破壁方法海藻糖得率的比较
将６种方法破壁后的酵母悬液，
采用蒽酮－硫酸法测定其海藻糖的含量，并计算海藻糖的得率，如图４所示。
图4
不同破壁方法海藻糖得率的比较
Fig.4Comparison of trehalose yield of different
wall-breaking method
由图４可知，反复冻融处理时，海藻糖得率达到３．２７％；超声波破碎时，海藻糖得率达到５．３２％；微波处理，海藻糖得率达到５．６４％；盐法，海藻糖得率为３．７６％；蜗牛酶法，海藻糖得率达到４．３７％；液氮研磨
处理后，海藻糖得率为３．８３％。由此可见，微波法处理的海藻糖得率最高。3.4
不同破壁方法破壁时间的比较
图5不同破壁方法的处理时间
Fig.5Processing time of different wall-breaking method
如图５所示，
６种破壁方法中，以反复冻融法的破壁时间最长，为４２０ｍｉｎ；微波法破壁提取时间最短，为３０ｍｉｎ，显著小于其他破壁方法；超声波法时间为６０ｍｉｎ，盐法处理时间为６０ｍｉｎ；蜗牛酶法时间为２４０ｍｉｎ；液氮研磨时间为７５ｍｉｎ。不同方法破壁时间的比较，单从处理时间的长短方面考虑，微波法最佳，为实际应用和生产工艺的放大的可行性上提供参考。4
讨论
综上所述，酵母细胞破壁的方法有很多种，各有一定的局限性。本文采用反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、酶法、液氮研磨法对啤酒酵母细胞进行破壁处理，以细胞破壁率、海藻糖得率和破壁时间为评价指标，微波法以其４９％的细胞破壁率、５．６４％的海藻糖得率和３０ｍｉｎ的处理时间，优胜于其他５种处理方法，综合考虑成本的高低及工艺放大的可行性，微波法适宜进行工业化生产。
不同的细胞破壁的方法各有优缺点，可根据不同的目的和要求，选择合适的破壁方法。在实际应用的
破壁条件中，选用什么样的破壁方法要根据具体情况而定。许多学者将不同的破壁方法相互叠加进行细胞破壁的复合处理研究，为此，我们下一步准备将上述探讨的几种环境友好的破壁方法进行细胞破壁的复合处理，大幅度的提高使其破壁效率。
本实验选用反复冻融法、超声波法、微波法、盐法、蜗牛酶法、液氮研磨６种方法破碎酵母细胞壁，仅
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以细胞破壁率、海藻糖得率和破壁时间为评价指标。众所周知，啤酒酵母中含有丰富的蛋白质、胞壁多糖、核糖核酸、脂类和酶等多种营养成分和协调因子，具有多种生理功能。下一步实验重点是以破壁后细胞中的可溶性蛋白质、胞壁多糖及功能性油脂等为指标，考察细胞破壁的可行性、各种活性物质的收率及功能性添加剂的应用。
本文仅从环境友好角度选择６种细胞破壁方法，通过这几种方法对啤酒废酵母细胞的破壁效果、海藻糖得率及破壁时间上进行分析比较，考察这６种方法为进一步探索经济、高效啤酒废酵母的破壁方法提供理论数据和技术参考。
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