非小细胞肺癌组织中ERCC1和RRM1表达与吉西他滨_顺铂疗效及预后的关系

[作者简介] 李亮亮,女,硕士研究生,主要从事肿瘤内科临床工

作,T e:l 139********,E m ai :l liliangli ang309@g m ai.l co m [作者单位] 1.解放军307医院全军肿瘤中心肺癌内科,北京 100071;2.解放军309医院,北京 100091[通讯作者] 刘晓晴,Te:l 010 ********

非小细胞肺癌组织中ERCC1和RR M 1表达与吉西他滨/顺铂疗效及预后的关系

李亮亮

1,2

,刘晓晴

1

[摘要] 目的 探讨核苷酸切除修复交错互补基因 1(ER CC1)和核糖核苷酸还原酶亚单位M 1(RRM 1)在非小细胞肺癌组织中的表达水平,分析其与吉西他滨/顺铂化疗敏感性及生存时间的关系。方法 以71例 B ~ 期肺癌患者的穿刺或手术标本为材料,采用免疫组织化学方法检测其ERCC1和RRM 1的表达水平。Cox 回归分析筛选影响预后的独立危险因子,K aplan M e i er 生存曲线分析比较不同ERCC1和RR M 1表达水平患者的中位生存期和无病进展时间。结果 非小细胞肺癌组织中ERCC1的阳性率为46.5%,RRM 1的阳性率为56.3%。ERCC1低表达者接受吉西他滨/顺铂的化疗效果优于高表达者,两者间的差异有统计学意义(P =0.036);RRM 1低表达者接受吉西他滨/顺铂的化疗效果优于高表达者,两者间的差异具有统计学意义(P =0.003),ERCC1和RRM 1低表达的患者生存期明显长于高表达者(P 值分别为0.002和0.001)。结论 ERCC1和RRM 1的表达可作为非小细胞肺癌患者吉西他滨/顺铂方案化疗敏感性及其预后判断的指标之一。

[关键词] 非小细胞肺癌;核苷酸切除修复交错互补基因 1;核糖核苷酸还原酶亚单位M 1;免疫组织化学;耐药;吉西他滨;顺铂

[中图分类号] R 734.2

[文献标志码] A

[文章编号] 1000 5501(2010)03 0265 05

Correlation of expression of ERCC1/RR M 1w it h cisplatin co m bi n ed w ith ge m citabine che m ot herapy sensitivity and prognosis in non s m all cell lung cancer

LI L iang liang 1,2

,L I U X i a o qing

1*

(1.Lung Cancer D epart m ent ,Tumo r Center o f PLA,H o spita l 307of PLA,Be ijing 100071,Ch i na ;2.H osp ital 309o f PLA,

Be ijing 100091,Ch i na)

*C orres ponding au t hor ,LI U X i ao q i ng ,T e:l 010 ********

[Abstract] O bjective T o i nvestigate t he express i on o f exc i sion repair cross comp le m enti ng gene 1(ERCC1)and ribo nuc l eo tide reductase subunitM 1(RRM 1)i n non s m a ll ce ll l ung cancer (N SCLC),and explore the correlation o f ER CC1and RRM 1expressi on w it h the t herapeuti ca l effect o f cisp l atin co m bi ned w ith gem citabine chemo t herapy and surv iva l ti m e i n patients w ith N SCLC .M ethod s Seven t y one pa ti ents w it h stage B and N SCLC we re enro lled i n t he study.I mmuno h i stoche m istry for pa ra ffi n e m bedded tu m or spec i m ens w as perfor m ed to i nv esti g ate ERCC1and RRM 1expressi on .Cox re g ressi on ana l ysis w as used to screen i ndependent risk facto rs for surv i va.l K aplan M e i er surv i va l curv e analysis w as used t o compare m edian overa ll surv ival ti m e and m edian progression free surv i va l ti m e a m ong the patients of w ith diff e rent expres s i on o f ERCC1and RRM 1.Re s u lts T he positi ve ra tes o f ERCC1and RRM 1expression in NSCLC sa mp l es w ere 46.5%and 56.3%respec ti ve l y .The therapeu tic effect o f g e m c itab i ne comb i ned w it h cisplati n in patien t w ith ERCC1l ow expres s i on w as obv i ousl y be tter than tha tw i th ERCC1h i gh expressi on(P =0.036).T he t herapeuti c effect o f gem citabine /c i sp l a ti n in pati ents w ith RRM 1low expressi on was obv i ousl y better than that w ith RR M 1high expressi on(P =0.003).The m ed i an overa ll surv i va l ti m e and progression free s urv i va l ti m e o f patientsw ith ER CC1/RRM 1l ow expressi on w ere obv i ousl y l ong er than those w it h h i gh expression(P =0.002and 0.001).Conc l u sion T he ER CC1and RRM 1expressi on m i ght be consid e red one of the pred i c ting m arkers o f drug sensitiv it y of ge m c itabi ne /cisplati n and progno si s i n NSCLC.

[K ey w ords] non s m all cell l ung cancer ;ERCC1;RRM 1;i m munoh istoche m i stry ;drug resi stance ;gemc itab i ne ;c isplati n

肺癌已成为癌症的首要死因,75%~85%的非小细胞肺癌(N SCLC)患者平均生存期不超过2年。化疗是其主要的治疗手段之一,以吉西他滨为基础的化疗方案作为N SCLC 的一线化疗方案,在临床应用广泛,耐药是导致治疗失败的

主要原因,目前尚无有效的方法指导化疗方案的选择。吉西他滨作为主要的化疗药物,其作用机制是阻断DNA合成而致细胞死亡。DNA的合成和修复异常与肿瘤的发生、多药耐药均有密切联系,其中核苷酸切除修复(nucleo ti de ex cision repair,N ER)系统是修复化疗药物所致DNA损伤的主要机制。核苷酸切除修复交错互补基因 1(exc i sion repa ir cross comp l em enti ng gene 1,ERCC1)是NER的限速酶。核苷酸还原酶(r i bonuc leo ti de reductase,RR)是DNA合成通路中的限速酶,是唯一使核糖核酸转变成脱氧核苷酸的酶,为DNA合成和修复所必需。RR包括两个亚单位,核糖核苷酸还原酶M1亚单位基因(r i bonucleo ti de reductase subun i M t1,RRM1)作为调节亚单位,能控制底物的特异性和全酶的活性。我们通过检测非小细胞肺癌石蜡包埋组织中ER CC1和RRM1的表达,分析其与吉西他滨疗效以及预后的关系,旨在提供一个吉西他滨疗效的预测指标,指导临床化疗方案的选择。

1 对象和方法

1.1 对象

选取2000年1月至2008年10月在解放军307医院经组织学确诊的进展期非小细胞肺癌患者,共71例(男性48例,女性23例),年龄31~82岁(中位年龄55岁),PS评分0~2分。均接受吉西他滨/顺铂方案化疗(吉西他滨1000 m g/m2d1、d8,顺铂75mg/m2d1,q3w)。对可测量的病灶采用REC IS T评价标准进行疗效评价,观察生存期,若末次随访仍然存活则定为截尾值。随访至2009年10月,随访率为100%,其中死亡67例。收集手术或活检病理标本。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法检测ERCC1的表达 采用免疫组化二步法检测ERCC1在石蜡包埋病理标本的表达情况。石蜡标本切成4 m厚切片,常规脱蜡、水化后,微波抗原修复5

m i n,PBS洗涤2m i n!3次,以3%H

2O

2

去离子水孵育10

m i n阻断内源性过氧化物酶,PBS冲洗2m i n!3次,蒸馏水冲洗2m in!3次;除去多余液体,滴加一抗,4?冰箱放置过夜,PBS冲洗2m i n!3次;除去多余液体,滴加二抗,37?孵育30m i n,PBS冲洗2m i n!3次;应用DA B溶液显色,蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。试验中一抗为1#50稀释的小鼠抗人ERCC1单克隆抗体,二抗为通用型二步法免疫组化检测试剂PV 8000,均购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化法检测RRM1的表达 方法及步骤同1.2.1,试验中一抗为兔抗人RRM1单抗,购自美国Santa Cruz公司;二抗为通用型二步法免疫组化检测试剂PV 8000,购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.3 染色结果判定 在高倍镜视野下随机选取5个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞。ER CC1主要为细胞核染色,参照W achters等[1]方法分析免疫组化ERCC的表达水平,细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞,阳性细胞数<10%为ERCC1(-)即低表达,阳性细胞数?10%为ERCC1(+)即高表达;RRM1主要为胞浆染色,胞浆呈棕黄色染色为阳性细胞,阳性细胞数<50%为RRM1(-)即低表达,阳性细胞数?50%为RRM1(+)即高表达。1.2.4 疗效评价 疗效按实体瘤评价标准(response evalua tion cr iter i a i n so li d tu mo rs,REC IST):完全缓解(comp lete re m ission,CR)、部分缓解(parti a l rem issi on,PR)、疾病稳定(stable disease,SD)、疾病进展(prog ressi ve d isease,PD)。近期客观有效为RR=CR+PR,有效者1个月后检查确认。总生存期(overa ll surv iva,l O S)为自治疗开始到患者死亡或失访,无进展生存期(progress i on free surv i va,l PFS)为自治疗开始到疾病进展,均以月为单位计算。

1.2.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件包,蛋白表达水平与临床病理指标采用 2检验,采用K aplan M e ier生存分析法进行单因素生存分析,并进行L og rank时序检验,采用Cox回归进行多因素分析,用Spear m an相关分析进行ERCC1和RRM1表达水平的相关性分析,P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

在71例患者中, B期患者23例,期患者48例;男性48例,女性23例,男女比例为2.09#1;中位年龄为55岁(31~82岁),?65岁的10例,<65岁的61例。鳞癌23例,腺癌46例,大细胞癌2例。PS评分0分32例,1分29例,2分10例。

2.2 免疫组化结果

71例患者中,RRM1(+)表达率为56.3%(40/71), ERCC1(+)表达率为46.5%(33/71),见图1、图2。经 2检验,与性别、年龄、组织学类型、临床分期均无相关性(均P >0.05)(表1)

。

表1 RRM1、ERCC1表达与临床特征之间的关系

项目RR M 1(+)

RR M 1(-)

2P 值ERCC 1(+)

ERCC1(-)

2P 值性别

男28200.240

0.624

21

270.444

0.505

女

12111211组织类型 鳞癌158 1.0940.57911121.7870.409

腺癌

24222224 大细胞癌1102年龄

?65岁550.1900.663640.8550.355

<65岁35262734临床分期 B 期1013 2.2870.1308151.8710.171

期

30

18

25

23

2.3 近期缓解

共71例患者,无CR 患者,14例PR ,总有效率RR (CR +PR )为19.7%,40例SD (56.3%),17例PD (23.9%)。RRM 1(+)患者RR 为3例(7.5%),RRM 1(-)患者RR 为11例(35.5%),差异具有统计学意义( 2=8.640,P =0.003);ERCC1(+)患者中,RR 为3例(9.1%),ER CC1(-)患者RR 为11例(28.9%),差异有统计学意义( 2=4.399,P =0.036)。2.4 远期生存

71例患者中,67例

(94.4%)死亡,中位总生存期(OS)为14个月,中位无进展生存期(PFS)为3.5个月。在RR M 1(+)的40例患者中,中位OS 为8.8个月,中位PFS 为2.5个月;而RRM 1(-)的患者中,中位O S 为15.3个月,中位PFS 为4.3个月。RR M 1(-)的患者中位OS 明显长于RRM 1(+)者,经Log rank 检验,具有统计学意义( 2=11.492,P =0.001),见图3;RRM 1(-)的患者中位PFS 明显长于RRM 1(+)者,经Log rank 检验,具有统计学意义( 2=8.250,P =0.004),见图4。

图3 RRM 1不同表达水平的O S K apl an M eier 生存曲线图

ERCC1(+)的33例患者,中位OS 为8

.8个月,中位PF S 为2.7个月;而ERCC1(-)的38例患者,中位OS 为13.7个月,

中位PF S 为4.1个月。ERCC1(-)的患者中位OS 长于ERCC1(+)者,经L og rank 检验,差异具有统计学意义( 2=9.454,P =0.002),见图5;ERCC1(-)的患者中位PFS 长于ERCC1(+)者,经L og rank 检验,差异具有统计学意义( 2=8.841,P =0.003),见图6。OS 与临床分期(P =0.001)、PS 评分(P =0.000)显著相关,在不同年龄(P =0.356)、性别

图4 RR M 1不同表达水平的PFS K aplan M eier 生存曲线图

(P =0.768)、组织学类型(P =0.998)之间无显著性差异。

2.5 NSCLC预后Cox多因素分析

Cox多因素回归分析显示,RRM1表达(P=0.048)、ERCC1表达(P=0.046)、临床分期(P=0.018)、PS评分(P= 0.007)均为有统计学意义的预后因素,见表2。

表2 N S CLC患者生存期多因素Cox回归分析

相关因素OR值95%C I W al d P值

PS评分1.6731.154~2.4247.3820.007临床分期2.0471.133~3.701 5.6290.018 RRM1表达1.7451.006~3.027 3.9190.048 ERCC1表达1.7251.011~2.944 3.9980.046

2.6 ERCC1表达和RR M1表达的相关性

应用Spea r m an相关性分析显示,ERCC1和RRM1的表达呈一定正相关,Spear m an相关系数为0.251,P值为0.035,小于0.05,具有统计学意义。

3 讨论

N ER系统是DNA最主要的修复机制,其功能异常在多种肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[2]。ERCC1是核苷酸外切修复家族重要的成员之一,在NER系统中起着损伤识别和核酸内切酶的双重功能,其表达水平可以代表NER 系统的活性[3]。ERCC1见于所有的肿瘤细胞,但表达水平差异很大,它的表达常常伴随着肺癌发病率的增加[4],很多研究显示,其高表达与吉西他滨/顺铂方案化疗耐药相关[5]。Bep ler等[6]报道,前瞻性采集一项基于社区的 期随机临床研究的N SCLC肿瘤标本中,其原位ERCC1蛋白表达水平(P=0.003,r=0.39)和RR M1蛋白表达水平(P=0.001, r=0.41)均与卡铂/吉西他滨或吉西他滨单药治疗后疾病缓解成显著负相关,即ERCC1和RR M1低表达者缓解率更高。此外,在其他肿瘤组织中,ERCC1的表达水平和化疗效果亦有相关性,朱娟等[7]对于63例接受草酸铂化疗的结直肠癌患者进行研究发现,ERCC1阴性的患者其化疗有效率明显高于阳性者(P=0.025)。本研究的结果提示,在接受吉西他滨/顺铂方案化疗的晚期N SCLC患者中,ERCC1低表达者可获得更高的疾病缓解率、更长的O S和PFS,与Belpe r等的结果一致。

也有研究得出不同结论。S i m on等[8]检测了51例N SCLC患者术后肺癌组织及癌旁组织中的ERCC1基因表达水平,结果发现ERCC1在肺癌组织和正常组织中表达无明显差异,ERCC1高表达的患者可获得更长的生存期。Z heng 等[9]发现,ERCC1和RRM1高表达的患者PFS、OS更长。周崧雯等[10]采用免疫组化法检测手术切除的73例NSCLC患者肿瘤组织中ERCC1的表达水平,发现ERCC1阳性表达患者的5年生存率要优于阴性者,但差异无统计学意义(P= 0.32)。分析上述不同研究结果,我们发现,其选取的病例分期不同,结果也不同。S i m on等[8]还发现,ERCC1高表达者的中位生存期显著长于低表达者(P=0.03),但在晚期N SCLC患者( ~期),ERCC1高表达往往导致肿瘤对铂类化疗耐药,化疗失败[11]。可见,ERCC1和RRM1表达对患者生存的影响在早期和晚期NSCLC起不同作用,手术后患者高表达者往往预示术后生存期较长,但高表达者往往耐药性也增加;晚期N SCLC低表达者预示着对某些化疗药物较敏感,比高表达者预后更好。

RRM1是吉西他滨重要的分子靶点,是RNA合成的前体,参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核酸的过程,是唯一催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸的酶,后者为DNA聚合及修复必需,为DNA修复的限速酶[12,13]。RRM1的表达水平与吉西他滨的疗效密切相关。Ro se ll等[14]采用RT PCR 的方法对晚期N SCLC患者的病理标本进行检测,发现RRM1低表达组较高表达组的中位生存期明显延长(13.7个月vs 3.6个月,95%C I=9.6~17.8个月,P=0.009)。RRM1与ERCC1均低表达组的中位生存期明显长于两种基因均高表达组(6.8个月,95%C I=2.6~11.1个月)。Cepp i等[15]对70例晚期N SCLC患者进行回顾性研究,证实在mRNA水平, RRM1低表达组中位生存期明显延长(13.9个月vs10.9个月,P=0.039),RRM1和ERCC1表达水平有高度相关性,两者均低者预后较好。这也与本研究的结论一致,即RR M1低表达者,接受吉西他滨/顺铂方案化疗,其OS、PF S均明显长于高表达者。

此外,ERCC1和RR M1的表达水平之间,似乎有一定的相关性。Zhang等、C eppi等均曾发现ERCC1和RR M1的表达水平有显著的相关性,并呈正相关。林莉等[16]曾通过实时荧光定量PCR技术检测6株肺癌细胞系中RRM1和ERCC1等基因的表达情况,发现ERCC1和RR M1的表达具有相关性。在本研究中,我们也发现,ERCC1和RRM1的表达呈正相关(P=0.035),其具体机制尚不明确。

在临床实际工作中,对N SCLC患者肿瘤组织进行免疫组化检测,比较容易实现,且成本低,其缺点是石蜡包埋组织的抗原丢失情况难以避免,影响检测结果。但晚期N SCLC患者标本常不易取得,且很多穿刺标本量较少,无法进行基因组学检测。所以,在目前情况下,应用免疫组化方法进行ERCC1和RRM1表达水平的检测,具有现实意义。因此,临床上可将其作为吉西他滨/顺铂方案化疗敏感性及其预后的预测指标之一。

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(姜晓舜 编辑 2009-12-11 收稿)

(上接第268页)

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(杨兆弘 编辑 2010-03-05 收稿)