牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化及其结构研究

牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化及其结构研究
牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化及其结构研究

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牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化及其结构研究△

冯晓梅1,韩玉谦23,赵志强1,管华诗1

(1中国海洋大学国家海洋药物工程技术研究中心,山东青岛,266101;

2中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛,266003;)

摘 要:目的从牡蛎蛋白质的酶解产物中分离制备具有活性的多肽并对其结构进行研究。方法采用胰蛋白酶对牡蛎蛋白质进行酶解,使其释放出具备特殊活性的肽,将含有活性肽的粗提物分别用Sephadex G25凝胶柱层析,DEA E2Sepharose FF离子交换柱层析和C18反相柱进行分离和纯化。结果牡蛎酶解产物经过分离纯化制备得到纯度较高的多肽F32,红外光谱的测定表明该肽的肽链是以α2螺旋的构型存在。电喷雾串联质谱法分析多肽F32完整的氨基酸序列为:Arg2G ln2Ile或Leu2G ly2Ala2Thr2Asn2Ala。结论本研究将为牡蛎酶解多肽F32构效关系的研究提供基础。

关键词:太平洋牡蛎;多肽;电喷雾串联质谱法;结构研究

中图分类号:Q959.21,R931.6 文献标识码:A 文章编号:100223461(2009)022*******

Study of isolation,preparation and structure identif ication of peptides from hydrolyzates of oyster

FEN G Xiao2mei1,HAN Yu2qian23,ZHAO Zhi2qiang1,GEAN Hua2shi1

(1N ational Engi neeri ng Research Center f or M ari ne D ru gs,Ocean U ni versit y of Chi na, Qi ng d ao266101,Chi na;2College of Food S cience an d En gi neeri ng,Ocean U ni versit y of Chi na,Qi ng dao266101,Chi na)

Abstrect:Objective To st udy t he p reparation and t he st ruct ure identification of peptides from hydrolyzates of oyster.Methods The oyster protein was hydrolyzed wit h tryp sin.The hy2 drolysates were p urified using Sep hadex G25gel chromatograp hy,D EA E2Sep harose FF ion exchange chromatograp hy,reversed2p hase H PL C o n C18column.R esults The peptide F32 was finally isolated f rom t he oyster hydrolysates.The oyster p rotein was hydrolyzed wit h t ryp sin.IR spect rum showed t he conformation of peptide chain wasα2helix.t he amino acid sequence of F32was determined by ESI2MS/MS.The sequence of F32was as follows:Arg2 Gln2Ile or Leu2Gly2Ala2Thr2Asn2Ala.Conclusion The research result would p rovide founda2 tion for t he struct ure2activity research of t he peptide F32.

K ey w ords:Crassost rea gi g as Thunberg;peptides;ESI2MS/MS;st ruct ure research

海洋活性肽是海洋活性物质研究的重要组成部分。目前海洋生物活性肽的研究主要集中在海绵、芋螺、海葵、海藻等少数几种海洋生物中,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节作用等[1]。牡蛎中含有丰富的蛋白质、糖原、牛磺酸、微量元素等生理活性物质,值得人们对

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3△基金项目:山东省科技攻关计划资助项目(No.021100102) 3通讯作者:Tel/Fax:0532288702302;E2mail:gjhyzx@https://www.360docs.net/doc/9f1741573.html,

其进行优化利用和高值化加工。J ean2Mi2 chel等[2]从牡蛎中分离到一种IKK天然蛋白肽,它通过调节细胞核(N F2κB)的活性在细胞中发挥重要作用。黄大川等[3]从僧帽牡蛎匀浆后上清液酸抽提蛋白溶液中提取分离到天然活性多肽BPO21,具有抗人胃腺癌B GC2823细胞的活性,低分子的活性峰能抑制人肺腺癌A549细胞的生长[4]。但天然存在的海洋活性肽在生物体中含量低,而且提取困难,难以实现大量生产供给所需,人工化学合成的活性肽成本昂贵。本研究以牡蛎蛋白为原料,采用胰蛋白酶对其进行酶解,使其释放出具备特殊活性的活性肽段,采用柱层析技术对酶解产物进行分离纯化得到牡蛎多肽F32,并对其结构进行了研究。初步的小鼠S180的抑瘤实验表明,牡蛎酶解多肽F32具有显著的抑制肿瘤生长作用。

1 材料、仪器及试剂

多功能食品粉碎机(上海海菱HL226型),G L220G2Ⅱ高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);FD21C冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);HD29704紫外检测仪(上海精科实业有限公司);XTW2S小型台式记录仪(上海自动化仪表三厂);P HS225B 型数字酸度计(上海大普仪器有限公司); DDS211A电导率仪(上海康仪仪器有限公司)。DEA E2Sep haro se2FF,Sep hadex G25均购自Amersham Pharmacia Biotech。三氟乙酸(色谱纯),(Aldrich Chemical Co.);乙腈,甲醇(色谱纯)均为Merck公司产品。

Nicolet Nexus470型傅立叶变换红外光谱仪(Therma Elect ron公司);微型等电聚焦电泳仪(美国,Bio2Rad公司);Q2Tof Ultima Global型基质辅助激光解离飞行时间质谱(德国,Bruker公司);Waters600 Cont roller高压液相工作站(美国,Waters公司)。

牡蛎购自青岛超市,经中国科学院海洋研究所张素萍教授鉴定为:长牡蛎Cras2sost rea gi g as Thunberg。

胰蛋白酶(≥2500u/mg,中国医药集团上海化学试剂公司),絮凝澄清专用壳聚糖(济南海得贝公司)。

2 实验方法

2.1 牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化

牡蛎肉→胰蛋白酶酶解→离心取上清液→壳聚糖絮凝→离心→冻干→酶解粗提物→Sep hadex G25凝胶柱层析→D EA E2Sep ha2 ro se FF离子交换柱层析→H PL C C18反相柱反复精制→牡蛎酶解多肽F32。

2.2牡蛎酶解多肽F32的红外光谱分析

取样品1mg用K Br压片,测定红外光谱,扫描范围4000~400cm-1。

2.3 ESI2Qq TOF电喷雾2串联四极杆2飞行时间质谱法分析牡蛎酶解多肽F32的氨基酸序列

质谱分析条件:离子源电压5.0kV;碰撞气体N2;注射泵进样速度20μL?min-1;检测方式正离子模式。

质谱分析方法:首先用TO F2MS模式进行全扫描分析,得到待测物的[M+H]+或[M+2H]2+准分子离子峰后,再利用子离子扫描模式对[M+H]+或[M+2H]2+进行MS/MS分析。逐渐调节碰撞电压,使得[M +H]+或[M+2H]2+的丰度占基峰的50%~80%之间,再采集数据。

3 结果与讨论

3.1 牡蛎酶解多肽的分离纯化

牡蛎酶解液离心取上清液,用壳聚糖絮凝(黏度120mpa.s)将大分子蛋白除去,离心,冻干,得到酶解粗提物。粗提物上Sephadex G25凝胶色谱柱,用0.1mol?L-1N H4HCO3缓冲液洗脱,流速为0.8mL?min-1,得到F1、F2、F3、F4四个组分,取纯度和含量较多的组分F3和F4继续上DEAE2Sepharose FF离子交换色谱,用p H8.5,0~0.3mol?L-1NaCl梯度洗脱,得到经过进一步分离纯化的3个组分

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F31,F32,F41。这3个纯化后的组分通过HPLC C18反相柱进行多次反复精制,色谱柱symmetry C 18反相柱4.6×250mm ,流动相A

液0.1%TFA/H 2O ,B 液0.08%TFA/乙腈。最后得到纯化后的3个组分F31,F32,F41,用RPLC 对3个组分进行纯度检测,表明组分F32的纯度较高,达到对其进一步进行质谱分析的要求(纯度95%以上),所以以组分F32为主要研究对象,对其结构进行深入研究。3.2 牡蛎酶解多肽F32的纯度鉴定

牡蛎蛋白酶解多肽根据其分子量大小,经过Sep hadex G25凝胶层析色谱初步分离后,又根据其带电性质及带电数量的不同,用

DEA E 2Sep haro se FF 离子交换层析色谱进

行了进一步的分离和纯化,经过这2个步骤的分离和纯化,得到纯度较高的分离组分。为了保证得到样品的高纯度,以免杂质的存在对后续的组成、结构和序列的研究造成干扰或影响,我们用C18极性反相柱根据牡蛎蛋白酶解活性寡肽极性大小的不同对组分F32进行了纯度鉴定。图1为组分F32用C18极性反相柱进行纯度鉴定的结果。从图中看出组分F32的反相高效液相色谱峰均为单一的对称峰,说明样品为单一成分,而且纯度较高。

图1 F32的C18反相HPL C 色谱图

Fig 1 Reverse 2phase HPL C chromatogram of F32

3.3 牡蛎酶解多肽F32

的红外光谱分析

图2 F32的红外光谱图

Fig 2 Inf rared absorption spectra of F32

图2为F32的红外光谱图,1677178cm -1的吸收为肽键中>C =O 的伸

缩振动吸收,由于中介效应,肽键中C =O

吸收频率要比醛酮低得多(醛酮和羧酸的C

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=O 吸收均不小于1700cm -1)[5]。肽链官

能团2N H 2CO 2的特征吸收谱带中,1514.69cm -1附近一组强吸收表示N 2H 相对于C =O 以反式构型的形式存在;而1417.66cm -1附近出现了一组较弱的吸收是顺式构型的形式存在。这些吸收,包含有N 2H 弯曲振动和C 2N 伸缩振动的因素。

图2的IR 谱清楚地显示了反式吸收(1514.69cm -1)远强于顺式吸收(1417.66cm -1),说明肽链是以α2螺旋的构型存在。3.4 ESI 2Qq TO F 电喷雾2串联四极杆2飞行

时间质谱法分析牡蛎酶解多肽F32的氨基酸序列3.4.1 相对分子质量的测定

在TO F 2MS 模式下进行全扫描,可分别

观察到多肽F32的准分子离子峰,其质荷比

为810.4(单电荷)。3.4.2 氨基酸序列的测定及分析

通过MS/MS 图谱的解析是推断蛋白质多肽氨基酸序列的常用方法:根据碎片离子

峰的“三联套”(t riplet )规律,手工在MS/MS 图谱中找到连续的“三联套”及“二联套”

(doublet )系列碎片离子峰:a n 、b n 和c n 、x n 、y n 和z n ,确定主要系列离子的归属,同系列

中相邻成套碎片离子峰间的质量数之差即代表一个氨基酸残基[6]。并适当结合其他一些特殊碎片离子峰提供的结构信息进行综合分析,即可推断和验证出多肽的氨基酸序列[7,8]

图3为牡蛎活性肽F32的MS/MS 离子图。从图中可以看出,y 系列离子信号强,而b 系列离子信号相对较弱,y8离子信号强度最高,是基峰。b 1~b 5系列离子的质荷比(m/z )依次是:238,366,481,538和609;y 1~y 8系列离子的质荷比(m/z )依次是:175,227,341,442,512,569,682和810。

根据以上数据,分析y n ~y n -1之间的质量差,并推导出相应的N 2端氨基酸残基如下:

8102682=128(Gln ),6822569=113(Ile or Leu ),5692512=57(Gly ),5122442=70(Ala -1),4422341=101(Thr ),3412227=114(Asn ),2272175=52(Ala -19)。其中,y 52y 4=70(Ala 21)为y 4脱H 碎片峰,所以相应的氨基酸残基应为Ala ;y 22y 1=52(Ala 219)为y 2脱水和H 的碎片峰,这些脱H 2O 、脱H 峰同样为MS/MS 质谱的特征峰,所以相应的氨基酸残基应为Ala 。另外,从相应的C 2端氨基酸残基推导出部分氨基酸残基如下:

3662238=128(Gln ),4812366=113(Ile or Leu ),5382481=57(Gly ),6092538=71(Ala )。

另外,在低质量数区,m/z175应为Arg 残基脱H 2O 和H (17521821=156,Arg )的特征碎片峰,说明牡蛎活性肽F32中应该含有Arg 残基。

综合所得的b n 系列离子和y n 系列离子的数据解析结果、牡蛎酶解多肽F32的相对分子质量以及对于用胰蛋白酶酶解所得肽片段而言在C 2端常具有碱性氨基酸残基L ys 或Arg 这几方面,可以得出牡蛎酶解多肽F32完整的氨基酸序列为:Arg 2Gln 2Ile 或Leu 2Gly 2Ala 2Thr 2Asn 2Ala 。

在常规的MS/MS 质谱图中无法区分Ile 和Leu 、Gln 和L ys ,因为它们具有相同或十分相近的相对分子质量。必须采用高能

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4?

的碰撞诱导解离(CID)或化学修饰的方式,

才可使两者的裂解片段在质谱图上呈现差

别,但这样又大大增加了图谱的复杂性,给解

析带来困难[9,10]。所以,质谱图中Ile和

Leu、Gln和L ys的区分是质谱法测序的难点

之一

图3 牡蛎酶解多肽F32的MS/MS离子图和精确质量数扫描图谱

Fig3 MS/MS spectra of bioactive peptides F32and zoom scan

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(收稿日期:2008206209)

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酶学第三章酶活性的测定及分离纯化

第三章酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时,都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作,这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力,检查酶的含量及存在,通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度,即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小,它既与酶蛋白的浓度有关,又与酶分子的催化能力大小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示,即u/ml或u/mg。 3.1.1 实用单位 不同的酶采用不同的标准。如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下,30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA(三氯乙酸)不溶物所需的酶量;又如T4 DNA连接酶的单位定义为:在20μl反应体积中,16℃,30分钟内,将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。ACC合成酶的单位是:30℃,1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。 3.1.2 国际酶活性单位 1961年,国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准,即在特定的条件下,1分钟转化1μmol底物,或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972年,国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位,叫katal(kat),katal是一个很大的酶活单位,1 katal是指1秒钟转化1mol底物,或转化1N底物有关基团所需的酶量。1 katal=6×10u。 3.1.4 转换数 在标准条件下,每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数,可 表示为: 1/Kp称为一个催化循环,单位为分钟。 3.1.5 比活性 酶的纯度往往用比活性来表示,比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量,即单位

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶。 关键词:酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类: 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶,称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶,如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶,就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高,容易得到; 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催化作用,称为细胞内酶,如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应,就是在多种酶催化下在细胞内进行的,在类酶在细胞内往往与细胞结构结合,有一定的分布区域,催化的反应具有一定的顺序性,使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的,但每一种酶的含量却很低,如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多,但各种酶的含量却差别很大。 因此,在提取某一种酶时,首先应当根据需要,选择含此酶最丰富的材料,如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制,如不能综合利用,成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多,既不受气候地理条件限制,而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到,微生物繁殖快,产酶量又丰富,还可以通过选育菌种来提高产量,用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中,除了我们所需要的某一种酶之外,往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质,因此为制取某酶制剂时,必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质,蛋白质很容易变性,所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱,保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标,在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤,始终要测定酶的总活力和比活力,这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶,纯度提高了多少,从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍: 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎(cell disruption) 高压均质器法:此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中,菌体从高压环境转到低压环境,细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

蛋白质和酶的分离与纯化培训讲学

蛋白质和酶的分离与 纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象,已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质,首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白,就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质,因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法,但是酶的活性受到多种因素的影响,因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则:来源方便,成本低,易操作、安全的原料。 蛋白分布:体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法: (1) 机械方法:通过机械运动产生的剪切力的作用,使细胞或组织破碎的方法。 如:捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法:通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用,使组织细胞破碎的方法。 如:反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法:通过各种化学试剂对细胞膜的作用,使细胞破碎的方法. 如:甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂(Triton和Tween) (4) 酶促法:溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细,分级分离 粗分:将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制:利用蛋白质性质的差异,采用不同的方法,如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性(pH、适合的温度和缓冲体系等) 二、常用的蛋白质的分离纯化技术

蛋白质和多肽提取分离

蛋白质与多肽提取分离 1 分离方法 采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括:盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化,同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段,如层析、叫泳等。 1.1 高效液相色谱(HPLC) HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是HPLC 能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。 1.1.1 反相高效液相色谱(RP-HPLC) 结果与保留值之间的关系:利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间,而含5~25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。 肽图分析(Peptide Mapping):肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断,通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱,肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质,通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得,并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图,便于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。 1.1.2疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatogrphy,HIC) HIC是利用多肽中含有疏水基因,可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的,其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。利用GIC分离生产激素(GH)产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定,活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点,将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子(EGF)也利用HIC纯化到了,均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。 1.1.3 分子排阻色谱(Sizs-Exclusion chromatogrphy,SEC) SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质,特别对一些较大的聚集态的分子更为方便,如人重组生长激素(hgH)的分离,不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同,从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体,利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法,此PEC具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。 1.1.4离子交换色谱(Iron-Exchange chromatography,IEXC) IEXC可在中性条件下,利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室 合作者指导老师 总分教师签名批改日期 碱性磷酸酶(AKP或ALP)是一种底物特异性较低,在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶,需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性,能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上,如磷酸基团的接受体是水,则其作用就是水解。AKP最适PH范围为8.6-10,动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝,小部分来自骨骼。 AKP可从组织中分离纯化,也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体,转入宿主菌中进行重组表达,并从表达菌提取,并进行酶动力学分析。 一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似,常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用,才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性,过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液,AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中,而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中,通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定,酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示,单位(U/mg?pr)来表示。因此,测定样品的比活性必须测定:a每毫升样品中的蛋白质毫克数;b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm 处比色,即可求出反应过程中产生的酚含量,而碱性磷酸酶的活性单位可定义为:在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。 3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 在环境的温度、PH和酶的浓度一定时,酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度,反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时,反应速度就会达到一个极限值,即最大反引发速度(Vmax)。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表 示: 式中:Vmax为最大反应速度;[S]为底物浓度;Km为米氏常数;V代表反应的起始速度。 ①当ν=Vmax/2时,Km=[S]。因此,Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物

多肽类分析分离方法

多肽类化合物广泛存在于自然界中,其中对具有一定生物活性的多肽的研究,一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的,生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展,从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用。不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。 1 分离方法 采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括:盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化,同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段,如层析、电泳等。 1.1 高效液相色谱(HPLC) HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的HPLC 应用与其它化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。 1.1.1 反相高效液相色谱(RP-HPLC) 结果与保留值之间的关系:利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响 的关系,其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间,而含5~25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。 肽图分析(Peptide Mapping):肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断,通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱,肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质,通过 RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得,并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图,便于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。 1.1.2 疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatogrphy,HIC) HIC是利用多肽中含有疏水基因,可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的,其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。利用GIC分离生产激素(GH)产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定,活性较稳定。Geng等利用HIC柱 的低变性特点,将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子(EGF)也利用HIC纯化到了,均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯

溶菌酶的提取分离和纯化实验报告

生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 实验报告集 班级生工1411 学号 组别7 姓名

实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施,服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求,做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室,及时、 准确地完成实验任务,实事求是地完成实验报告,杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定,爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者,应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物,节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器,不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静,不得大声喧哗、嘻闹,严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故,确保实验室安全,发现异常情况,应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后,主动整理好仪器设备,归还所借器材,关闭电源、 水源,按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作,经指导老师许可后,方可离开。

预习报告(手写,可自行续页)

实验报告 溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 一、目的 对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定 二、原理 鸡蛋是溶菌酶的主要来源,等电点约为10.5~11,最适温度50℃,最适pH为6~7左右。 1、溶菌酶分离纯化原理: (1)等电点法利用溶菌酶等电点较高,在酸性条件下除去一些杂蛋白 (2)阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白 2、溶菌酶鉴定分析 (1)考马斯亮蓝法测蛋白含量 (2)分光光度法测定酶活性 (3)使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度 三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂 鸡蛋清,PBS缓冲液,40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠,D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋,考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸,溶菌酶标准品、底物微球菌粉,蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等 2、实验仪器 低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计,玻璃层析柱,Bio-Rad垂直电泳系统,移液枪、移液管,培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。 3、实验方法 1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离 2. 树脂柱层析分离纯化 (1)D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱 3.透析与浓缩 (1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩 4.蛋白质含量的测定 5.溶菌酶纯度的测定(SDS凝胶电泳)

多肽物质分离与分析方法研究进展

?专题讲座? 多肽物质分离与分析方法研究进展 赵 锐 顾谦群 管华诗 (青岛海洋大学海洋药物与食品研究所,青岛 266003) 摘 要 综述了近几年来多肽类物质的提取分离与分析方法,主要包括高效液相色谱法、电泳、质谱及核磁共振等方法在肽类物质研究中的最新应用进展。 关键词 多肽,分离,分析,进展 多肽类化合物广泛存在于自然界中,其中对具有一定生物学活性的多肽的研究,一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的,生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展,从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用,不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。 1 分离方法 采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括:盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等[1]。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化,同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段,如层析、电泳等。 111 高效液相色谱(H PL C) H PL C的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的H PL C 应用与其他化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是H PL C能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。 11111 反相高效液相色谱(R P2H PL C)结果与保留值之间的关系:利用R P2 H PL C分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,W ilce等[2]利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间。而含5~25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件[3]。

蛋白质、多肽提取分离

蛋白质、多肽提取分离 1、分离方法 采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括:盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化,同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段,如层析、叫泳等。 1.1 高效液相色谱(HPLC) HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。 1.1.1 反相高效液相色谱(RP-HPLC) 结果与保留值之间的关系:利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间,而含5~25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。 肽图分析(Peptide Mapping):肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断,通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱,肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质,通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得,并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图,便

酶的分离纯化.

酶的分离纯化 提取原则 a. 相似相溶。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值,溶解度增加。 酶的提取方法 酶的分离方法 1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度降低,而从溶液中沉淀析出,与其它溶质分离的技术过程。 在蛋白质的盐析中,通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后,酶的溶解度随盐浓度升高而降低,这称为盐析现象。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低,就使溶质分子间的静电引力增大,互相吸引而易于凝集,同时,对于具有水膜的分子来说,有机溶剂与水互相作用,使溶质分子表面的水膜破坏,也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时,要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同,选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 蛋白质分子在离心時,其分子量、分子密度、组成、形状等,均会影响其沉降速率,沉降係系数即用來描述此沉降性质;其单位为S (Svedberg unit)。 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质,可利用超高速离心法,在密度梯度中作分離。 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

蛋白质和酶的分离与纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象,已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质,首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白,就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质,因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法,但是酶的活性受到多种因素的影响,因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则:来源方便,成本低,易操作、安全的原料。 蛋白分布:体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法: (1) 机械方法:通过机械运动产生的剪切力的作用,使细胞或组织破碎的方法。 如:捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法:通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用,使组织细胞破碎的方法。 如:反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法:通过各种化学试剂对细胞膜的作用,使细胞破碎的方法. 如:甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂(Triton和Tween) (4) 酶促法:溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细,分级分离 粗分:将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制:利用蛋白质性质的差异,采用不同的方法,如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性(pH、适合的温度和缓冲体系等) 二、常用的蛋白质的分离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。 (一)根据蛋白质的溶解度不同进行分离

重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白 和多肽的分离纯化 1. 概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理(downstream processing)阶段,这一过程又和上游过程紧密相联系,上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化,所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计,并充分考虑上游因素对下游的影响,如是否带有亲和标签,是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类,分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统,CHO细胞表达系统,不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程,目标蛋白表达是否形成包涵体,目标蛋白表达的定位(胞内、细胞内膜、周质空间和胞外),蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤,并且由于蛋白质种类少,目标蛋白容易纯化;而在细胞质内表达蛋白,可能是可溶性表达,可能形成包涵体,可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤,而包涵体易于分离,纯度较高,但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难,需要对聚集的蛋白进行变复性,通常活性蛋白的得率比较低,表1列出了不同策略对表达、纯化的影响,对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免,如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签,有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化,并能保护目标蛋白不被降解(96)。 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的 降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平,简 化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达 表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平,简 化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主 细胞生长没有大的影响,需要体外的折叠和溶解,得率较低 具有不确定N末端

高中生物第三章酶的应用技术实践第二节固定化酶的制备和应用学案苏教版选修

第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1.概念:是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2.优点:在催化反应中,它以固相状态作用于底物,反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离,可被反复使用,且保持了酶的催化性能,可实现酶促反应的连续化和自动化。 3.制备固定化酶的常用方法 目前,制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64~65分析固定化细胞技术的应用 1.应用:固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵,生产各种物质。 2.优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化,减少了酶的活力损失,同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用,而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说,保持了酶的原始状态,酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短,反应快等。 3.缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响,营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中,溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4.酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓

活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠,用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化,不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题,造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。

生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

实验报告 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法 二、实验内容和原理 1、离子交换层析 由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中,粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷,因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附,然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液,使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂的亲和力降低,把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来,从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶,它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。(50℃水解) 3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。(100℃显色) 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化(溶解即为样品Ⅲ) 2、实验试剂 ⑴ ⑵ 20 7.3 缓冲液 ⑶ 20 (1 )7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液,4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3,5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器 (1)高速冷冻离心机 (2)层析柱(φ1.0×20㎝ )(1支/组)

(3)? (1套/组) (4)部分收集器及收集试管(4管)(1台/组) (5)-20℃冰箱(保存样品用) (6)微量移液枪 200、1000 (7)1.5离心管(留样品Ⅲ和样品Ⅳ用) (8)7离心管(留样品Ⅳ用) (9)恒温水浴(50℃、100℃) (10)试管、移液管、试管架等 四、实验方法和步骤 1、仪器连接 (1)接通各仪器电源,将泵头分别放置A,B两个溶液瓶中。注意B为含溶液。 (2)点击电脑桌面上软件图标,打开软件。选择,点击,进入操作界面。点击 (3)在操作界面的工具栏,点击。出现窗口,调节为 1,确定。 2、装柱与平衡 (1)检查层析柱的两端接头,底端有膜的置于下方。 (2)程序暂停。将层析柱放入卡槽,上端接头与混合器()相连,下端接头与样品阀( )相连。 (3)平衡一个柱体积(约2020) 3、加样 停止加入20 7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时,程序暂停。旋开柱上方接头,用胶头滴管缓慢将5蔗糖酶蛋白样品溶液(样品Ⅲ)加入层析柱中,注意顺着柱壁滴加,尽可能保持胶面平整。程序继续,使样品溶液进入胶体,待样品溶液完全进入胶体后,程序暂停,用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下,并完全进入胶体后,再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱(梯度洗脱法) (1)加样后,先用进行洗脱,洗去未被凝胶吸附的杂蛋白(20左右); (2)待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定,在程序主界面的工具栏→ → → ,在两个框内均填入100,点击,最后点击一次,开始梯度洗脱。每2接一管,当上升至8 时,开始测定各管的蔗糖酶活力; (3)将蔗糖酶活力高的若干管酶液(2-3管)合并,测量总体积V4(样品Ⅳ),样品用7离心管-20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测

酶的分离纯化过程中要注意什么问题

酶分离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133 组别:第六组姓名:董冰夏学号:2013013906 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶制剂。 酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的,但每一种酶的含量却很低,如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多,但各种酶的含量却差别很大。因此,在提取某一种酶时,首先应当根据需要,选择含此酶最丰富的材料,如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制,如不能综合利用,成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多,既不受气候地理条件限制,而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到,微生物繁殖快,产酶量又丰富,还可以通过选育菌种来提高产量,用廉价原料可以大量生产。 生物细胞产生的酶有两类:一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶,称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶,如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶,就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高,容易得到;另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催化作用,称为细胞内酶,如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应,就是在多种酶催化下在细胞内进行的,在类酶在细胞内往往与细胞结构结合,有一定的分布区域,催化的反应具有一定的顺序性,使许多反应能有条不紊地进行。 由于在生物组织中,除了我们所需要的某一种酶之外,往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质,因此为制取某酶制剂时,必须经过分纯化的手续。因为酶是具有催化活性的蛋白质,蛋白质很容易变性,所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱,保持在较低的温度下操作。 酶是一种特殊的蛋白质,在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制,注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制(常用PBS缓冲溶液),在实际纯化过程中,一般要在低温冰箱中进行,缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐(1-5mM)螯和重金属离子一般避免酶失活。常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。同时要注意防止酶的变性失活。酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去,因此,在不破坏所需酶的条件下,可使用各种“激烈”的手段。此外,由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性,当这些物质存在时.酶的理化性质和稳定性发生了一定变化,从而提供了更多条件和方法可供采用。酶具有催化活性。检测酶活性,跟踪酶的来龙去脉,为选择适当方法和条件提供直接依据。在工作过程中,从原料开始每步都必须检测酶活性.一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大,活力回收高,同时重复性好。 酶活力也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定。 酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数,一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度,对于同一种酶来说,比活力越大,酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力,是表示酶的纯度

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯 化 文稿归稿存档编号:[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要:本文就胃蛋白酶的生物提取法,对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中,分离技术主要介绍了:盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了:凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点,得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词:胃蛋白酶分离纯化应用 .生物提取法生产胃蛋白酶 1.1 工艺路线 (自溶、过滤)(脱脂、去杂质) 猪胃黏膜→自溶液→上清液 (浓缩、干燥) →胃蛋白酶成品 1.2工艺过程 (1)原材料的选择和预处理:胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部,采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜,每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。(2)自溶、过滤:在夹套锅内预先加水100升及盐酸3.6-4升,加热至50度时,在搅拌下加入200千克猪胃黏膜,快速搅拌使酸度均匀,保持45—48度,消化3-4小时,得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白,收集滤液。(3)脱脂、去杂质:将滤液降温至30℃以下,加入15-20%氯仿或乙醚,搅匀后转入沉淀脱脂器内,静置24-48小时,使杂质沉淀,分出弃去,得脱脂酶液。(4)浓缩、干燥:取清酶液,在40℃以下减压浓缩至原体积的1/4左右,再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛,即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术

2.1有机溶剂法 可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮,其沉淀蛋白质的能力为:丙酮>异丙酮>乙醇>甲醇。当然此顺序也不是一成不变的,因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好,但挥发损失多,价格较昂贵,所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2.2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一,硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂,其中用的最多的是硫酸铵。美国专利(2,701,228)改进后,用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇(或酮)在50%--55%、pH在5.0—5.2时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀,沉淀物为胃酶的锌盐,然后用金属螯合剂除去锌盐,得15000—16000倍活力的酶,收集率为5.0%--5.5%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 2.3底物亲和法 底物亲和法是利用酶(胃蛋白酶)与其底物(酪蛋白)的亲和性,从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸缓冲液中充分结合,然后调pH至4(底物的等电点)沉淀底物和酶的结合物,随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中,添加低浓度的SDS将底物和酶分离,得到酶—SDS复合物,再进一步分离纯化。陈躬瑞(2001)成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离,得率大约为30%。与传统的分离方法比较,此法具有简单高效的优点,为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用,同时具有较高的特异性。【2】 2.4透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程,如果袋内外的盐浓度相等,

菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 15食安(1)班凯 摘要:本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量,得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理,菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化,但是蛋白酶活性会损失一部分。 关键词:菠萝蛋白酶;透析法;分离纯化;酶活性; 前言 菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶,不仅可充分利用资源,拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间,还可降低菠萝加工废料对环境的污染;随着市场对菠萝加工产品需求量的增大,对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要,尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。[2] 本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取,初步分离纯化及活性测定进行了初步研究,探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素,并解决实验存在的一些问题。 1实验材料与仪器 1.1实验材料与试剂 新鲜菠萝,透析袋(截留相对分子质量8 000~14 000),0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS),0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白,激活剂[含20mmo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二

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