植物生物钟研究的历史回顾与最新进展_徐小冬
118 doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2013.02.006
植物生物钟研究的历史回顾与最新进展*
徐小冬①
谢启光②
①教授，河北师范大学生命科学学院，细胞生物学研究所细胞生物学国家重点学科，石家庄 050024 ②副研究员，达特茅斯大学生物系，美国新罕布什尔州汉诺威 03755
* 科技部973计划前期研究专项(2012CB126303)；国家自然科学基金(30971507，31071247，31170265)； 河北省杰出青年科学基金(C2011205034)
关键词 生物钟；周期节律；时间生物学；植物
摘要 生物钟几乎参与调控了植物体所有的新陈代谢、生长发育过程，使植物体与外界环境条件达到时间和空间的同步，极大地增强了植物环境适应性和竞争能力。笔者首先从植物生物钟的研究历史入手，回顾了中国古代农业生产中对节律性的认识和应用；然后介绍了现代植物生物钟研究的起源、基本概念和理论知识；最后重点论述了本领域的最新研究进展，揭示了植物生物钟作为复杂的信号转导网络的“整体水平”调控特性和“牵一发而动全身”的独特性。
在生命漫长的发展历程里，由自然选择主导的进化长河中，诸多种类的生命体殊途同归，演化和发展出了可以称得上生命基本特征之一的周期节律性。生物节律(biological rhythm)的研究已经成为现代自然科学的一门重要学科——时间生物学(chronobiology)。简而言之，时间生物学是一门研究生物体节律现象的科学。周期节律是人们探索生命奥秘的科学进程中发现和揭示的一类非常重要的生命现象。生物的周期节律性的产生原因，通常认为是在漫长的进化历程中，生命体为了适应自然界的周期性变化(比如一天中昼夜现象所产生的光照和温度变化，一年中四季轮转，以及潮汐涨落等)，从而进化出的内源性适应机制。根据外界环境周期变化的不同因素，生物节律可以分为：近日节律(circadian ，circa-around, dian-day)，外因主要认为是由于地球自转引起日长变化(光周期，photoperiodism)和昼夜温度变化(温度周期)，近日节律常见表现有植物的叶片振动角度变化、花瓣开合、气孔开闭、人类的体温、激素水平变化等以近24 h 为周期的生物节律；近潮汐节律(circatidal)，外因是月球的
引力作用于地球表面海洋而形成的周期性涨落，
很多海洋生物表现出相应的潮汐节律；近月节律(circalunal)，外因是月亮环绕地球运转，例如女性的月经周期；季节节律和近年节律(circaseasonal 和circannual)，外因认为是由于地球围绕太阳公转，植物的季节性落叶和成熟，树木的生长——年轮，动物的季节性繁殖、休眠和鸟类的季节性迁徙都属于这个范畴；此外还有报道指出一些和太阳活动周期有关的近十年为周期的节律现象(circadecennian)。
任何一门科学的建立都不是凭空而来的，时间生物学在纳入严谨的科学研究范畴之前，人类已在生产生活过程中，开始对自然和生物体的节律性进行观察思考、总结经验并最终指导自身实践活动。以中国为例，早在《易经》中已经记述了“天地革而四时成”，这在某种程度上可以看作是中华民族的先人对自然界节律性认知的萌芽阶段。在《夏小正》这部中国科学技术史最古老的文献中，记载了4000年前古人已经懂得调整自己的实践活动，来适应自然界的节律性，展现了中华民族杰出的生存智慧。值得一提的是，
119
《吕氏春秋》中更进一步提出了“圜道观”，大量地记述了自然界和社会的各种节律性现象。在随后的历代农书中描述的作物轮作、土壤轮耕、物能循环等，都进一步完善和体现了“圜道观”提到的节律性思想，并用它来指导农业生产。中国传统中医学中对生物节律现象描述更为具体，比如《黄帝内经》中关于“子午流注”的记述，虽然思辨的成分多些，却与现代医学的研究有惊人的契合度。除了中国古代科技文献中有大量关于节律性的记载外，中国古代文学作品中对节律也有提及，如明代李东阳的七绝《夜合花》“夜合枝头别有春，坐含风露入清晨。任他明月能相照，敛尽芳心不向人。”通过描述合欢昼夜开合节律来比喻忠贞的爱情；唐代白居易在《长恨歌》“春风桃李花开日，秋雨梧桐叶落时”则巧妙地通过对植物季节节律的描写表达了思念之情。
生物钟调控的周期节律中，研究最为深入且广泛的是以近24 h 为周期的节律现象。circadian 源自拉丁语circa (around) and dies(day ，~24 h)，即节律周期接近24 h 。真正现代自然科学意义上的生物钟相关实验起始于1720年，De Mairan (Jean-Jacques d’Ortous de Mairan)观察到在持续黑暗条件下含羞草叶片依然保持着如同昼夜周期下同样的节律性开合现象。随后的科学研究表明生物钟现象广泛存在，目前生物钟研究的主要模式物种包括从蓝藻、衣藻、粗糙脉孢霉、线虫、果蝇、帝王蝶、拟南芥、老鼠到人，几乎涵盖了生物学研究的模式物种。生物钟的研究经历了最初的缓慢发展，到20世纪50年代，基本建立起了生物钟调控的近24 h 节律的三个主要特征。第一，生物钟调控的周期节律是内源的，独立于外
界环境信号的周期性驯化，如光暗周期、温度周期等，在持续条件下自由地以24 h 为周期振荡(self-sustaining)。或者可以说生物钟调控系统是遗传得来的，由细胞内自身的组分来控制，使得生物体能够具有“预测”时间和外界环境的周期性变化。第二，生物钟调控的节律可以被周围环境信号(如光照、温度等)所驯化(entrainable)，进而被重新设定。如同我们到另外一个时区要矫正随身携带的手表一样，生物体自身的节律也可以被调节去更好地适应外界环境。第三，生物钟调控的节律具有温度补偿现象(temperature compensation)。简单表述就是生物钟在一定生理温度范围内，可以保持自身节律的相对稳定，这就意味着对于大多数生理反应的温度系数Q 10大于2(比如酶反应温度提高10℃，速度加快1倍)在生物钟控制的节律中并不成立，其节律的Q 10
接近
1，在一定温度范围内节律性可以维持稳定状态。除上述几点，生物钟节律还有一个很有意思的规律，被命名为Aschoff’s rule(即节律的周期长短与光强相关，随着光强增加周期变短)(图1)。不夸张地说每一个生物钟研究者都了解Aschoff’s rule 的另一层含义，就是当年Aschoff 用了几十年的用来测量试管中菌体生长的生物钟周期的污迹斑斑的尺子已被装裱好，作为生物钟领域依次传承的一项荣誉。生物节律研究协会(Society for Research on Biological Rhythms, SRBR) 的大会上会颁发这项荣誉，它的评选遵循两个有趣的规则：一是继任者必须是与当前得奖者工作在不同国家的生物钟学家；二是继任者研
图1 Aschoff’s rule (图片来源https://www.360docs.net/doc/9c2284253.html,/Pages/AschoffRule.aspx)
120 究的生物体必须与当前得奖者不同。
生物钟研究中将生物体的周期节律表型通过数学方法来分析计算，常用的基本参数包括周期(period)、振幅(amplitude)、相位(phase)和中值或均值。周期指振荡曲线一次周而复始的变动所经历的时间。振幅是指生理变量的变动幅度，以余弦函数描述生物钟节律时，振幅是最大值与最小值的差值的一半。相位在时间生物学的数学表
述中是指生理变量的某一特征值在周期节律性
变化中出现的时间点，一般而言常用波峰的相位或者波谷的相位作为研究对象。中数(中值)在数据模型中指研究的生物节律相关生理变量的平均值(图2)。
图2 生物钟节律研究的几个常用参数
植物生物钟的研究有着最为悠久的历史，与其他领域的生物钟研究相互借鉴，特别是近些年随着生物技术突飞猛进，研究的深度和广度都有了飞跃式的发展。植物生物钟参与调控植物体几乎所有的新陈代谢、生长发育过程，使植物体近24 h 节律(circadian rhythm)与外界环境条件(光、温度周期)达到时间和空间的同步。生物钟调节机制使得植物在与环境应答反应中获益，从基因表达到生理生化水平，以近24 h 为周期的节律性振荡能够减少不必要的能量和物质消耗，提高生物量和生产力，极大地增加了植物生存和竞争能 力[1-4]。植物生物钟系统由三部分组成：首先是输入途径(input pathway)，红光受体PHYs 和蓝光受体CRYs 等以及其他可能存在的未知组分，将自然界光、温度、营养等的环境信号的变化传递给第二部分，生物钟核心振荡器(core oscillator)。目
前模式植物拟南芥生物钟系统核心调控由 CCA1 (CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1)、LHY (LATE ELONGATED HYPOCOTYL )、TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1)和其他PRRs (PRR3、PRR5、PRR7、PRR9)、GI (GIGANTEA )、ZTL (ZEITLUPE )、CHE (CCA1 HIKING EXPEDITION )、ELF3 (EARLY FLOWERING 3)、ELF4、LUX (LUX ARRHYTHMO )等构成复杂的多重反馈调控网络。第三部分输出途径(output pathways)，指生物钟参与调控的诸多以近24 h 振荡的生物节律，涉及到植物生长发育过程中各类关键的生理生化过程，例如：细胞游离钙离子浓度的近24 h 节律性振荡、蛋白磷酸化反应、激素的合成与信号转导、植物周期性生长、叶绿体移动、气孔开闭、下胚
轴伸长、叶片运动、花瓣开闭、开花时间、非生
物和生物逆境胁迫反应等。生物钟系统上述三部分之间的关系并不是分割独立存在的，它们之间信号网络交叉在一起，相互应答组成一个有机的整体来调控植物生长和发育及对环境的适应 性[5-11](图3)。
图3 植物生物钟系统组成关系图
1 植物生物钟输入途径——生物钟的发
条
自然环境中，植物生物钟处于外界环境因子(特别是光照和温度)的持续作用下，在植物整个生长发育进程中，机体感受到外界光照长短和温度高低的变化，不停地重新设定自身节律，使之
121
与环境变化同步。光是对生物钟的作用最为显著的因素，因此研究得较为深入。研究表明拟南芥生物钟感知光的输入途径主要通过红光受体光敏色素(phytochrome ，PHY)、蓝光受体隐花色素(cryptochrome ，CRY)和其他与生物钟相关的蓝光受体ZTL(ZEITLUPE)、FKF1(FLA VIN BINDING , KELCH REPEAT, F-BOX1)和LKP2(LOV KELCH PROTEIN2)。光敏色素及其相关的光信号途径组分(PIF3、PIF4、PIF5、ELF3、ELF4、FHY3、DET1和HY5等)感受外界光信号，并调控生物钟核心循环基因的表达来重新设定生物钟，其中隐花色素到生物钟的信号转导过程除了独立于光敏色素的途径外，还在光敏色素下游起一定的作用。研究表明ZTL 的LOV (light ，oxygen ，or voltage)结构域可以和TOC1、PRR5结合，然后通过蛋白酶依赖的降解途径降解掉TOC1和PRR5。但是蓝光可以诱导ZTL 的LOV 结构域的构象变化更加倾向于结合GI(GIGANTEA)，从而保护TOC1、PRR5和ZTL 在夜晚之前不被降解，此外PRR3作为维管束表达的PRR 蛋白，也可以通过与TOC1结合，从而抑制TOC1的降解。利用ZTL 、FKF1和LKP2双突和三突变体为材料的研究结果表明生物钟调控中以ZTL 为主，LKP2表达量很低，
但FKF1和LKP2也起了一定的作用[1,9,12-18]。
除了最早发现的光和温度两种影响生物钟的重要因子外，氮营养元素和铁离子也被证明对生物钟有重要的调控作用[19-21]。
温度补偿现象是生物钟节律的一个重要特征，但是对植物生物钟的温度补偿机制研究并没有非常深入，目前主要是PRR7和PRR9以及GI 基因比较肯定的在温度补偿机制中扮演了重要角色。此外，CCA1/LHY 虽然功能上有很大的互补，但是LHY 在高温情况下起重要作用，而CCA1在低温情况下发挥着主要作用。CK2 和 CCA1也同时受到温度的调节，CCA1作为CK2的底物，磷酸化的CCA1对其功能尤为重要。CK2 和 CCA1对温度的反应表现出相互拮抗作用，使得植物在高温下依旧能保持生物钟的正常节律。但是植物生物钟温度相关的输入途径仍然有许多空白地带需要进一步研究[22-26]。
2 植物生物钟核心循环——复杂的调控网络及不同层面的调控
随着越来越多植物生物钟相关基因的克隆及对这些基因的转录、转录后调控的研究，生物钟核心循环已经从最初单一的负反馈循环逐步发展成当前比较公认的多重负反馈循环模型，并逐步演化为复杂的调控网络。为了方便理解，可以将复杂的核心调控网络合并为三个循环[27](图4)：第一个是中心循环(core loop)，是最早鉴定的以三个重要的核心基因CCA1/ LHY-TOC1为主的反馈通路。其中CCA1/LHY 一对类似于MYB 的转录因子抑制TOC1的表达，进而TOC1直接或间接地通过未知组分调控CCA1/LHY 的表达，从而构成了一个完整调控过程。新的研究发现TCP 转录因子的成员CHE 在其中也起到了重要作用，CCA1/LHY 可以抑制CHE 的表达，而CHE 蛋白的积累反过来会降低CCA1的表达水平，同时TOC1可以同CHE 结合拮抗CHE 的作用[28]。值得注意的是，新的研究结果推翻了以前的TOC1促进转录激活的推论，证明TOC1可以直接作为DNA 结合的转录因子，结合与CCA1/LHY 启动子特定元件上，抑制CCA1/LHY 的表达，虽然与以前生物钟模型中的结论相反，但是也给出了一些需要进一步的实验去验证的推论和解释[29]。第二个循环是早晨循环(morning loop)，由CCA1/LHY 以及PRR7/PRR9组成，其中CCA1/LHY 在清晨(subjective day morning)达到表达高峰，促进PRR7/PRR9的转录，而PRR7/PRR9反过来抑制CCA1/LHY 表达。此外，另外两个关键的生物钟基因LUX 和ELF3也可以直接抑制PRR9的表达水平[30-32]。第三个循环为傍晚循环(evening loop)，主要有TOC1和未鉴定的组分Y(GI 可能部分行使着Y 的功能)，TOC1抑制GI 的表达，而GI 促进了TOC1的表达，同时GI 的转录被CCA1/LHY 所抑制[27]。此外PRRs (pseudo-response regulators)在拟南芥生物钟调控中至关重要。拟南芥基因组共有5个PRRs (TOC1/PRR1、PRR3、PRR5、PRR7、PRR9)。其中TOC1是第一个在短周期突变体基础上鉴定的生物钟基因[33]。在此基础上陆续发表的文章揭示
122 了TOC1属于5个PRRs 小基因家族成员之一，研究表明PRRs 的表达调控比较复杂，可以分为转录调控和转录后水平调控。PRRs 转录水平调控最有趣的现象是5个基因不仅受生物钟调控，而且它们的振荡就像音乐会五重奏(quintet)，它们转录水平的波峰(peaks)依次出现，间隔约2 h ：PRR9的表达紧随在一对重要的生物钟基因CCA1/LHY (表达高峰位于清晨)之后，大约在早晨达到表达高峰(early in the morning)；接着是PRR7、PRR5、PRR3；最后TOC1的表达高峰出现在入夜时分(in the early evening)[34]。PRRs 转录后调控则更为复杂，其中PRMT5则影响到了
PRR9 mRNA 的选择性拼接[35]，同时PRRs 在蛋白水平上还存在磷酸化现象，相关研究揭示了磷酸化状态也决定了PRRs 的稳定性，以及它们参与的蛋白复合体的命运(稳定性和亚细胞定 位)[36-38]。最新研究结果还证明了PRR5、PRR7、PRR9通过与TOPLESS/TOPLESS-RELATED 家族蛋白相互作用，从而抑制CCA1和LHY 的表达，进而调控生物钟[39]
。目前对于生物钟的转录后调
控越来越得到重视，对于
SKIP
基因的研究证实了
mRNA 的选择性拼接的变化可以影响到诸多生物钟关键基因的拼接模式，起到调控生物钟的作用[40]。
图4 植物生物钟主要基因调控信号途径(根据最新研究结果修改自文献[27])
3 植物生物钟输出途径——通过周期节律调控植物体环境适应性
植物的适应性部分得益于生物钟系统使机体具备了对未来环境变化的“预知”能力，提前作出调整(图5)，比如使光合作用相关基因和蛋白提前转录和翻译，达到最大的光合利用率。气孔的节律性开闭以及相关抗性基因的周期性表达，
可能使植物在尽可能减少能量和资源浪费的情况下，兼顾到对生物和非生物胁迫的抵抗。通过不同周期的生物钟突变体在长短不同的周期条件下的生长情况的比较，证明了植物生物钟如果与地球自转的周期同步将赋予植物生长发育和适应性等方面的优势[3]。另外生物钟对于杂种优势现象的解释也从一个侧面揭示了其对提高植物的环境适应性的作用[41]。2011年关于拟南芥对
123
抗霜霉病的实验表明，生物钟核心循环基因CCA1下游调控的一些抗性基因可能参与了基本防御反应和R-基因介导的抗性反应，使得植物可以预期病原菌的侵染时间，有针对性地调动相应的防御基因表达[10]。此外植物生物钟也被证明可以提前“预知”昆虫的取食行为，通过调控茉莉酸介导的防御反应与之相适应，从而与昆虫做斗争[11]。生物钟系统另一核心循环成员TOC1 (PRR1)，最早是作为种子中ABI3相互作用蛋白(ABI3-interacting protein 1，AIP1)被克隆出来[42]。TOC1被证实可以直接结合ABAR 启动子区并调节ABAR 的周期性表达，同时ABA 可以上调TOC1，因此TOC1被认为在干旱胁迫信号途径和生物钟之间起到分子开关的作用[43]。研究表明处于拟南芥生物钟核心循环中的与TOC1同一基因家族的PRR5/PRR7/PRR9在植物适应低温、高盐和干旱胁迫中也起到了重要作用，prr5/prr7/ prr9三突植株中ABA 含量比野生型明显提高，而且芯片结果显示ABA 合成途径关键基因也相应地显著上调[44-45]
。气孔运动调控叶片CO
2
交换
和水分的蒸腾散失，同时气孔开闭处于生物钟调
控之下，研究表明，在水分缺失中度胁迫情况下
ABA 对气孔的作用效果在下午明显高于早晨
[46]，在TOC1缺失突变体中ABA 介导的对干旱的抗性反应被弱化了许多[43]。
Ca 2＋
作为植物细胞中最重要的第二信使之一，不仅在植物的生长发育和新陈代谢过程中起到重要作用，而且由于其参与植物对许多逆境信号的转导过程，获得了广泛而深入的研究[47-50]。Johnson 等[51]1995年发现细胞游离钙离子浓度存在近24 h 节律性振荡(circadi an calciu m oscillation)，随后他们在拟南芥中对钙节律调控
图5 植物生物钟输出途径简图 (图片资料来源于互联网和文献)
124 机制有了进一步研究[52-53]。Xu 等利用拟南芥多种光受体和生物钟突变体以及超表达的转基因植物为实验材料，证实红光和蓝光均调控细胞质 [Ca 2+]cyt 的近24 h 节律振荡，红光途径主要由PHYB 介导，蓝光则通过CRY1、CRY2的双重调节。蓝光可以提高细胞质中[Ca 2+]cyt 水平，这种调控需要PHYB 、CRY1、CRY2的共同参与来完成。ELF3(EARLYFLOWERING3)的作用如同阀门(gating)，直接通过控制生物钟的光输入途径来调节细胞内游离钙离子节律。研究还表明拟南芥生物钟核心调控基因CCA1和LHY 共同参与[Ca 2+]cyt 及CAB2 (CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN2)的节律性调控，但是在TOC1不同突变体toc1-1、toc1-2中，[Ca 2+]cyt 及CAB2prom :luc 节律存在明显的差异，突变体中这种不同输出途径存在的节律差异表明，钙节律和CAB2prom : luc(基因表达)节律可能分别由植物生物钟核心机制的不同负反馈循环来调控[52]。目前对于钙节律振荡中钙离子的来源问题(胞外或细胞器)，cADPR 途径和CAS-IP3途径都有初步研究结果，但由于缺乏直接证据，仍处于争论状态[54-58]。
总而言之，生物钟系统参与调控了植物体内绝大多数的信号转导途径，对生物钟与其他信号途径的应答反应的研究必将对农业生产具有极好的理论价值和应用前景。生物钟在农业领域对于增强植物的适应性、抗逆性，改造作物的地域性限和提高生物量等方面均起着至关重要的作用。与其他信号通路的关系中生物钟起到了一个统领和桥梁的作用，但是植物生物钟调控模型依
然有许多缺失环节和未知的关键基因有待于我们去鉴定。
(2013年3月4日收稿)■
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The circadian clock in plants XU Xiao-dong ①, XIE Qi-guang ②
①Professor, Hebei Normal University, Colledge of Life Sciences, Key Laboratory of Molecular Cell Biology, Shijiazhuang 050024, China; ②Research Associate, Dartmouth Colledge, Department of Biological Sciences, Hanover, Hampshire 03755, USA
Abstract Circadian clock generates endogenous rhythms to confer the fitness advantages for most organisms. Plants with the
evolved self-sustaining rhythms could anticipate the changes of environment, synchronize own growth and development with oscillated outer signals. This review summarizes the emerging of research work on the various circadian rhythms, introduces the concepts of chronobiology and related theory, etc , and describes in detail on the current basic network architecture of circadian systems of higher plants, including the prominent transcriptional and posttranslational mechanism.
Key words biological clock, circadian rhythm, chronobiology, plant
(编辑：段艳芳)
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入海洋，一小时后再去寻觅，这种漫无目标之感与现在要寻找太阳的同胞恒星是相似的。
有一个好消息传来，并不是太阳的全体同胞兄妹都离得如此遥不可及。2009年位于Netherland 的Leiden 大学的Simon Portagies Zwart 实现了计算机模拟大恒星团，观察太阳的同胞兄妹会在哪里寿终正寝。他估计还有10～60个恒星如今仍存在距离我们330光年的区域内。在这个距离，一颗类日恒星我们用双筒望远镜便可以观察到。并不是每个人都赞成这种观点。俄罗斯联邦大学Yury Mishurov 和Irina Acharova 认为这种说法过于乐观。2010年他们提出这种模型过于简单，没有考虑
银河系旋臂的影响，因为银河系旋臂会将恒星打散。他们的模拟结果显示，仅仅有几个太阳同胞兄妹留在附近。为了寻找它们，Bland Hawthorn 和他的同事们寄希望于新仪器HERMES 。HERMES 安装在新威尔士赛丁泉天文台的英澳望远镜上，将探测得到20 000光年范围内近一百万颗恒星的化学组成。从2013年开始，HERMES 将测量所有它所观测到的恒星的25种化学元素的丰度，其中蕴含着恒星起源的秘密。通过研究这些元素，Bland Hawthorn 和他的同事希望可以发现那些与太阳化学成分一样的恒星。他们希望用十年的时间来解决这一问题。
然而，仅仅从HERMES 得到的结果可能还不充分。根据运动定律，太阳的同胞兄妹会沿着与太阳
类似的轨道绕星团运行。为了确定一个真正的太阳的同胞恒星，研究人员将需要把有关恒星的化学成分信息与它们的速度测量值综合起来考虑。欧洲空间局将在2013年发射Gaia 空间探测器来测量恒星的速度。
在此之前，位于美国新墨西哥州的Apache Point 天文台的小项目APOGEE 或许会先获成功。该项目的目标是通过观察100 000颗恒星来破译银河系的历史。它将测量15种化学元素的丰度，虽然看上去这与确定太阳同胞并没有必然的关系。“这些恒星是由一个模子出来的可能性非常大。”来自位于夏洛茨维尔的弗吉尼亚大学的Steven Majewsk 说。
[双木据New Scientist , 2012-04-11]