感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)

感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)

感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)

感受态细胞: 理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。即指细菌细胞在一定的生长阶段,自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。如大肠杆菌经CaCl2处理,就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

一般来说,感受态细胞的最基本要求是:

1、没有质粒

2、容易被转进去(一般是G-细菌,细胞壁薄)

3、营养条件一般,非苛养菌

CaCl2法:

操作原理:

1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成

细胞膨胀,同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞

细胞膜通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。

2.此时,将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激(90s),细胞膜的液晶结构会发生

剧烈扰动,并随机出现许多间隙,外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

意义:

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达,不仅可以检验重组载体是否构建成功,最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验,如蛋白质表达纯化等工作。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

实验材料:E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA;eppendorf管。

试剂:

1.LB固体和液体培养基

2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

5.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

50-100mg/mL;

10mmol/L EDTA(pH8.0),25mmol/L Tris-HCl (pH8.0);

现配现用);

的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸,28.5mL H2O);

一、受体菌的培养

-80℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外的超净台中,用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板上划线,并将菌种迅速放回-80℃保存。在划线板上做好相应标记,于37℃培养16-20小时。

在照过紫外的超净台中,用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20μl枪头(或者灭过菌的牙签),从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右(或过夜,220rpm),直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中(据其他资料:取50或100ul菌液接种于5ml的培养基中),37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.3~0.5左右。细胞数小于10的8次方, 过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于1:10,即转接菌液:培养基体积≦1:10。培养基体积与三角瓶体积比不得小于1:5,即培养基体积:三角瓶体积≧1:5。要有足够的空间提供溶氧。)

OD值是一个重要的参数,当OD600值大于一定值时,菌体不会保持对数生长。同时,OD 值大时菌体总量达,所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样。

二、感受态细胞的制备( CaCl2 法)

1、将细菌悬液液转入离心管(1.5ml)中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。(有些微0.1mol/L的CaCl2)

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。(15% - 20%甘油为细菌的冷冻保护剂,也可在此步骤不加甘油,细胞直接用于转化)

4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

三、转化

1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30

分钟后。(有资料为200ul加1ng质粒)

3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复

正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液

完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

同时应做两个对照:

对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。

四、计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:

转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

注意事项:本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

(1)转化缓冲液中试剂的纯度务必使用所能得到的最高质量的试剂,这些试剂应分装成小份,避光保存于冷处。

(2)细胞的生长状态由于一些不清楚的原因,直接用贮存于-70℃冰冻培养基中的贮存原种接种而进持培养的细菌,所得到的转化效率最高,不应使用在实验室中连续传代,贮存于4℃或贮存于室温的培养物。

(3)玻璃和塑料器皿的清洁度痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的生长效率,所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌,而不作它用。

制备感受态细胞时,测OD600 在0.3--0.5之间,空白用无菌体的LB培养基。(菌体的OD600值,JM109或BL21,OD值为0.35,DH5α为0.4,要尽量保证OD值不要过高,更不能超过0.6)

感受态的感受效率最关键的是一个冷字,刚制备的感受态其感受效果最好,但是随着时间的延长感受效果会逐渐下降,所以要将制好的感受态细胞冻存于液氮中,或-70度冰箱保存,这样感受效果才不至下降过快。一般感受态制备好以后24小时其转化效率最高,随后就逐渐下降。一般的宿主菌都不要传代太多,传多了就容易状态不好和污染杂菌。状态好的时候建议冻上一批,用EP管分装好,然后,每次就可以取冻存的菌种来扩增使用。

试剂和用品,非如果有可能,所有的用品(离心管、摇瓶等等)用新的,如果使用旧的,要确保干净。

制备质粒DNA:

碱裂解法小量制备质粒DNA:碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的,在pH12.0~12.6的碱性环境中,线型染色体DNA 和环型质粒DNA氢键会发生断裂,双链解开而变性,但质粒DNA由于其闭合环型结构,氢

键仅发生部分断裂,而且其互补链不完全分离;当将pH值调节到中性并在高盐浓度下,已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构,通过离心,大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性,恢复到原来的构型,呈可溶性状态保存与溶液中,离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。

1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中,37℃震荡培养12~16小

时;

2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中,12000 g离心30 Sec,弃上清液,在吸水纸上扣干;

离心时间不能太长,以免影响下一步的菌体悬浮

3、加入100mL预冷的溶液I ,于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞,尽量使细胞分散;

溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度,减少提取过程中的机械剪切力,防止染色体DNA 的断裂;EDTA的作用是与二价离子(Ca2+)结合,降低DNase对DNA的降解。

4、加入200mL新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3-5min;

溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞,使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构

5、加入150ml溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀,冰上放置2~3min;

溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液,中和NaOH,以便使部分变性的闭环质粒复性,而细菌染色体DNA不能正确复性

6、12000 g离心6 min,将上清移入另一干净的Ep管中;

7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀,室温放置2min.

8、12000g离心10min,弃上清液,再用70%的乙醇洗涤一次,12000g离心1min,离心管倒

置于吸水纸上扣干,然后在中空浓缩系统上干燥质粒;

9、加入40mL含20 mg/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物,室温放置直到质

粒完全溶解(约8min),存于-20℃或直接用于酶切。

质粒图谱:

(四)提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳:

1、在0.5mL Ep管中依次加入下列溶液于0.5ml离心管中

提取质粒DNA 3.0 uL

10× buffer H 1.0 ul

EcoR I 2.0 U

dd H2O 5.8 uL

10 uL

1U: 1单位酶通常定义为,在建议缓冲液及温度下,在20 mL 反应液中反应1h,使1 mg DNA完全消化所需的酶量.

2、轻轻混匀, 4000g离心10秒,置于37℃水浴中酶解1.5h。

3、酶解完成后,加入1.2 ml 10×上样缓冲液(或2ml 6×上样缓冲液), 混匀.

4、称取1g琼脂糖,置于三角瓶中,加入100mL0.5×TBE或1×TAE缓冲液,瓶口倒扣一个小

烧杯,将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。

5、将梳子放置在制胶槽上,在冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴EB,小心混匀,

倒到制胶槽上,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层,不要产生气泡(厚度约为3~4mm);

6、室温下静置30min左右,待凝固完全后,轻轻拔出梳子。

7、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有0.5×TBE或1×TAE缓冲液的电泳槽中使用(注意:电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致)。

8、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内加完样后的凝胶板即可通电进行电泳(80~100V的电压下电泳,一般情况下,电压/电极间距离应小于5V/cm),当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。

9、在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带(在紫外灯下观察时,应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩,避免眼睛遭受强紫外光损伤,拍照电泳图谱时,可采用凝胶成象系统)。

感受态细胞的制备步骤和原理

实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 [让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm4℃离心 10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL100mmol/L冰冷CaCl2中,轻吹,4℃30min,4000rpm 离心5min弃上清。 [细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一

定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)]5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL,加入2 uL无菌双蒸水阴性对照:LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶液和pET-21a质粒未被污染。] [冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。] 7热激42度,90s 【在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】 8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB,37℃复苏1h 【用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生 素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mLCarbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。 4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。 7、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验,也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化,活细胞数务必少于108个细胞/mL,对于大多散大脑杆菌来说,这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20 min测定OD600值来监测,用监测的时间及OD值列一个图表,以便预测培养物的OD600值到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间,OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大,因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并

大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心,弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数,应该在3以上) 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备 标签: tr..,Ca..,co.. 分类:细胞技术> 感受态细胞 来源: 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (R-,M-),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(原理) 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法),该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase(DNA酶)的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。

感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)

感受态细胞的制备(DH5α) 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机(50ml离心管),37℃恒温箱,37℃摇床,超净台(使用前需要紫外消毒15min 至少);0.22μm的滤器2个(过滤灭菌TfB2种溶液),10ml注射器2个;冰盒;高压灭菌的1.5mlEP管1盒,与离心机配套的50ml离心管6个(高压灭菌),高压灭菌的500ml 锥形瓶2个,高压灭菌的100ml玻璃瓶2个,高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制(甘油特别难吸,用蓝枪头慢慢吸吧) ① LB平板:单纯LB平板,加有amp或有kana的(制板时需标注好类型,时间)。 ② SOB培养基(Super Optimal Broth) ③ TfBⅠ:(100ml制备量)分别称取乙酸钾0.294g,MnCl2 0.99g,KCl 0.146g,CaCl2 0.111g,置于200ml烧杯中,加入15ml甘油和85mlDDW,摇晃,使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液,置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中,4℃保存,使用前必须预冷。(装在50ml离心管,封口4度保存) ④ TfBⅡ(20ml制备量,每次现用现配,装在50ml离心管):分别称取MOPS 0.046g,CaCl2 0.167g,KCl 0.015g,置于50ml烧杯中,加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃,使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液,使用前必须预冷。

配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。(50ml离心管分装) 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后,定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。(50ml离心管分装) 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后,定容至100 ml,高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液,加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块,调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后,4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH,调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后,4度保存。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 ?1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落,接种于3~5ml LB液 体培养中,37℃振荡培养至对数生长期(12h左右); ? 2、将该菌悬液以1:100~1:50转接于100ml LB液体培养基中,37℃振 荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30min测一次OD600,至OD600为0.3~0.5时停止培养,并转装到1.5 mL离心管中; ? 3、培养物于冰上放置20min; ? 4、 0~4℃,4000g离心10min,弃去上清液,加入1 mL冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞, 冰浴20分钟; ?5、0~4℃, 4000g离心10min,倒净上清培养液,再用1.0 mL冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴20min; ? 6、 0~4℃, 4000g离心10min,弃去上清液,加入100 μL冰冷的 0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后,即制成了感 受态细胞悬液; ? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验,如果在4℃放置 12~24h,其转化效率可以增高4~6倍;也可加入占总体积15%左右 高压灭菌过的甘油,混匀后分装于1.5ml离心管中,置于-70℃条件下, 可保存半年至一年。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5α或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜(约16小时); 2 .取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时(250-300rpm); 3 .将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤需在超净工作台和冰上 操作; 4 .吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟; 5 .4℃下3000 g冷冻离心5分钟; 6 .弃去上清,加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动 打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟; 7 . 4℃下3000 g冷冻离心5分钟; 8 .弃去上清,加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动 打匀,使细胞重新悬浮; 9 .细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超 低温冷冻贮存备用(-70℃)。 注意事项 1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使 用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml); 2 .所有操作均应在无菌条件和冰上进行; 3 .经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的 推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的); 4 .化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 (如Mn 2+或Co 2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍); 5 .所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率; 6 .质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的DNA; 7 .一定范围内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比;

感受态制作注意事项

A)细菌的生长状态:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/mL左右,这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B)所有操作均应在无菌条件和冰上进行;实验操作时要格外小心,悬浮细胞时要轻柔,以免造成菌体破裂,影响转化。 C)经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的); D)化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍); E)所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率; 首要问题就是操作是防止污染,因为这个是最容易影响感受态制作的因素。 其次,就是悬浮沉淀的过程,一定要轻轻悬浮,最好轻摇悬浮,如果用移液器,把枪头前面剪掉一部分,然后再吹,这样吹的比较柔和 感受态制备及转化的方法很多,效率最高的是电转化,可达到10次方,普通的化学转化只能达到8次方,一般自己做也就是6-7次方,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化,但效率也最低,只能满足环形质粒的转化(某些公司也有现成试剂盒)。要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。 以下是一些制备感受态的注意事项: 1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑。 2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值:培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。 3、培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说,接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后,可以测一下pH 值,不要低于6.0,最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低。 4、培养后的OD值。其实这是一个非常重要的参数,只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等。同时,OD值大时菌体总量大,感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响

高效感受态细胞的制备

感受态细胞的制备 一、实验原理 受体细胞通过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,MnCl2,MgCl2等化学试剂法)的处理后,使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的状态,成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 二、材料及准备工作 一)材料准备

二)试剂配制 1、液体LB培养基(200ml,高压灭菌,4℃保存备用) 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠(NaCl) 2.0g 2、固体LB培养基(2×100ml,高压灭菌) 蛋白胨2×1.0g 酵母提取物2×0.5g 氯化钠(NaCl)2×1.0g 琼脂粉2×1.5g 温度降低到45℃后(不烫手),取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml(100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄)后铺平皿,另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液(100ml)(有效期2周) 聚乙二醇(PEG8000)10g 终浓度10% DMSO 5ml 终浓度5%

MgCl2(1mol/L)5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml,0.22μm过滤器过滤后,4℃保存备用 注:聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液(10ml)(可-20℃长期保存备用) KCl(2mol/L) 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后,4℃保存备用(不要高压消毒) 5、氨苄青霉素(amp)(100mg/ml) 取0.5g氨苄青霉素,溶解于5ml去离子水中,0.5ml分装,-20℃ 保存备用 三)仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 [让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF

异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm 4℃离心10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中,轻吹,4℃30min,4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细 胞壁打开,十分脆弱)] GAGGAGAGGAFFFFAFAF

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期:2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中,首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中,感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中,0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器:超净工作台,恒温摇床,冷冻高速离心机,高压灭菌锅,冰箱,70℃超低温冰柜,分光光度计,接种针,10ml 试管,50ml 离心管,1.5ml 离心管,冰浴,微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌,灭菌条件:120℃,15分钟。 材料:土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂: YEB液体培养基(1升):酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g, MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0,高压灭菌; 链霉素(Sm)储液:125mg/ml 0.15 N NaCl,高压灭菌。 20mM CaCl2,高压灭菌。

四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基(含Sm 125mg/l)中,28°C振荡培养过夜; 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中,28°C振荡培养至OD600为0.5; 3. 5000rpm, 离心5min; 4. 加入10ml 0.15N NaCl,使农杆菌细胞充分悬浮,5000rpm, 离心5min; 5. 弃上清,置于冰上,加入1ml预冷的20mM CaCl2,充分悬浮细胞,冰浴中保存,24小时内使用,或分装成每管200ml,液氮中速冻1 分钟,置70°C保存备用。 一.农杆菌感受态细胞的制备 二.双元载体转化农杆菌EHA105 三.杆菌转化子的鉴定 A.农杆菌转化子的PCR鉴定 B.农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词:农杆菌感受态细胞转化子 一.农杆菌感受态细胞的制备(同大肠杆菌质粒DNA的提取),然后将其转化大肠杆菌,再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM(0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0)液体培养基中,220rpm, 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中, 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管,5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min, 4℃下,5000g离心5min,去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液,轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二.双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min;-70℃放置10min ;取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min;冰浴2min;加入800μl YM液体培养基,28℃,175rpm摇培3hr;取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上,28℃培养到形成单菌落。

Protocol感受态制作与转化

感受态细胞的制备: 1.以1:100的比例吸取过夜菌液(250ul)加入25ml LB液体培养基中,37℃,200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右(OD600范围0.4-0.6)。 2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置30min,使培养物冷却到0℃。 3.于4℃,以4000rpm离心10min,回收细胞。 4.倒出培养液,将管倒置1min(于滤纸/吸水纸上),使最后残留的痕量培养液流尽。 5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2,重悬每份沉淀,放置于冰浴上30min。 6.于4℃,以4000rpm 离心10min,回收细胞。 7.倒出培养液,将管倒置1min(于滤纸/吸水纸上),使最后残留的痕量培养液流尽。 8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2(含15%甘油)重悬每份细胞沉淀。 9.在冰上将细胞分装成小份,100ul/份,防御-70℃冻存。 10.如果当天要用,最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用,效果较好。制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用,不影响效果。 感受态细胞制备流程图: 过夜菌250ul加入25ml LB液体培养基37℃,200r/min 振荡培养2-3h OD600测 达0.5左右转移至50ml聚丙烯离心管冰上放置30min 培养物到0℃ 4℃,4000rpm ,离心10min 回收细胞弃培养液倒置放置1min 加入 5ml 0.1mol/LCaCl2悬浮细胞沉淀,冰上放30min 4℃,4000rpm ,离心10min 回收细胞 弃培养液倒置放置1min 加入1ml预冷0.1mol/LCaCl2(含15%甘油)悬浮细 胞沉淀冰上分装,10ul/份70℃冻存(当天实验4℃放置4h,最多可放置48h)

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37C, 180rpm培养过夜。[让菌复苏, 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37C 250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。] 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中,冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min,弃上清。(将所 有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中,轻吹,4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 [细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA ),经短时 间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。 (一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照:0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。][冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。] 7热激42度,90s 【在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(短节西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活,所以应等到LB600C时(热而不烫),加入抗生素。】

实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化

实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象,一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变,这种现象叫做转化,获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中,所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞,表达相应的选择标记基因,并在一定的培养条件下,在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内,才能进行扩增和表达,从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作,如亚克隆等;或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞(competent cell)。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态,而另一些细菌只有处于某个生长时期时(一般为对数生长早、中期),才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强,从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法,通过瞬间的高压电流,在细胞上形成孔洞,使外源DNA进入胞内,从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级,达到1 x 108转化子/μg DNA,甚至1 x 109转化子/μg DNA,所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术,大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌,本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1.LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中,另各取3mL装于2只大试管中,其余装于装于500mL三角瓶中,121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2.LB/Amp/IPTG/X-Gal平板(1): 配1L LB液体培养基,加入20g琼脂粉和1支搅拌棒,同上高压灭菌,趁热取出置搅拌器上冷却,待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板,每皿倒约15 mL,室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG,涂匀,待这两种化合物渗入琼脂后,即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个,LB/Amp 平板5个,LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3.IPTG储存液(0.1mol/L):1.2g IPTG加水至50ml,过滤除菌,4℃储存。 4.X-gal储存液:50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中,过滤除菌,4℃储存。 5.1 mol/L CaCl2储存液,使用浓度为0.1mol/L,CaCl2应使用分析纯,配100mL,高压灭菌,全班用。6.甘油(灭菌),全班50mL,同上高压灭菌。 7.酸洗无菌玻璃珠,涂布平板用,用50mL三角瓶分装,同上高压灭菌,烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等

酵母菌感受态制作及转化

Y187 酵母感受态制作及转化 1)挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液,30℃,250 rpm 培养16-18h;2)至OD600>1.5,1:10 转接,此时OD600≈0.3; 3)30℃,250 rpm,4-7 h,每2 h 检测一次,直到OD600=0.4-0.6; 4)转入2 个50 ml 离心管,5100 rpm,5 min,弃上清; 5)加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞,5100 rpm,5min,弃上清; 6)每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc,冰上混匀,10000 rpm,15 s,去上清; 7)每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc,冰上混匀,10000 rpm,15 s,去上清;8)每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc,冰上混匀,10000 rpm,15 s,去上清;9)每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc,每管100 ul 分装; 10)分别加入100 ng 左右DNA(plasmid)和0.1 mg 鲑鱼DNA(10 mg/ml,10 ul),移液器抽吸混匀溶液; 11)分别加入600 ul LiAc/PEG,高速混匀(10 s-1 min 内); 12)30℃摇床恢复30 min; 13)超净台(无菌条件下)加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀; 14)42℃热激15 min; 15)冰上放置1-2 min; 16)14 000 rpm,15 s,去上清; 17)300 ul TE 重悬细胞; 18)100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板; 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板; 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上,30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。

大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化解析

一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 (一)大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数。而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说: 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有: (1)发芽的芽孢杆菌容易转化; (2)大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化; (3)适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA分子能进入细胞。证据是:(1)蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;

(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论,但是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果,认为: 近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来的水平。 (二)重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞,接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞,使受体菌具有新的遗传特性,并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α,必须不同外来DNA分子发生遗传重组,通常是rec基因缺陷型的突变体,同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷(rk- mk- rec-)同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感(Ap)。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素(Ap)基因存在,当它导入受体细胞后,就赋于这些受体细胞新的特性,即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ,我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ,使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。

CaCl2法制备感受态细胞知识讲解

C a C l2法制备感受态 细胞

大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备

出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基 (3)30%甘油:30mL甘油溶于100mL蒸馏水,高压灭菌。 主要设备 (1)超净工作台 (2)冷冻离心机 (3)恒温摇床 (4)-70℃冰箱 (5)10mL移液管 (6)吸耳球 (7)1mL、200μL移液枪(配套枪头) (8)50mL 离心管 (9)1.5mL离心管 实验材料 (1)大肠杆菌DH5α(R-,M-,Amp-) 实验步骤 (一)受体菌的培养

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