实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定
实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定
一、实验目的
1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理
自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。
三、实验仪器及试剂
材料土样取自学校校门口小树林5—20cm深处；
仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；
培养基
（1）筛选培养基（500ml）
CMC-Na 10g、(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3g KH2PO4 2g、MnSO4 1.6mg、FeSO4 5mg ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0mg 琼脂20g PH7.0 （保藏培养基（500ml）CMC-Na 15g、MgSO4 0.5g、K2HPO4 1.5g、酵母粉10g NaCl 5g、蛋白胨15g、琼脂20g、刚果红PH7.0
四、实验步骤
1.土样采集取自学校校门口小树林5—20cm深处；
2.实验器材灭菌：平板、移液管的包扎及灭菌；
无菌水的制备：量取99ml自来水于250ml锥形瓶中，并放入适量颗玻璃窗珠，塞上棉塞，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。量取9ml自来水于试管中，用试管塞塞好，用牛皮纸包扎，于121?C条件下灭菌20min备用。
筛选培养基配制及倒平板：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节pH7.0。在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出于无菌环境旧倒平板备用。
保藏培养基配制及摆斜面：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml蒸馏水中，调节
pH7.0。分装试管中，在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出摆斜面备用。
土样预处理及梯度稀释
（1）样品菌悬液的制备先取1g样品，加入到99ml含有玻璃珠的无菌水中，震荡几分钟形成悬液。
（2）梯度稀释：在无菌条件下，用灭好菌的移液管取1ml到装有9ml无菌水的试管中，依次稀释10 -3、10-4、10-5、10-6的梯度备用
7.倒平板涂布分别取10-4、10-5、10-6三个浓度的菌悬液接种到倒好了的平板中，并涂布均匀
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 作者：王春学号:11101680 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1 材料与方法 1.1 培养基 1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2 菌株的分离 1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3 菌种的鉴定 1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1材料与方法 1.1培养基 1.1.1平板培养基(1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2摇瓶培养基(1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2菌株的分离 1.2.1菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3菌种的鉴定 1.3.1细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.216SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3聚合酶链反应(PCR)检测PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
纤维素酶的生产工艺及分离提纯
纤维素酶的生产工艺及分离提纯 姓名：朱帅帅学号：201404015024 四院三连通信工程摘要： 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。 关键词：发酵法；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电泳Abstract： Cellulase is an important enzyme products, a complex enzyme, mainly by the exo-β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase and other components, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest industrial enzyme after saccharifying enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to become the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a new growth point. Is a protein that can decompose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides. Keywords:Fermentation, Salting out, Gel filtration, Ion exchange chromatography, Electrophoresis.
乳酸菌菌种的分离筛选办法
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
菌种鉴定SOP
微生物的鉴定 1 原则 微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则，用分类学的知识，一步步地将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择相应的鉴定系统将未知的微生物鉴定到种。鉴定包括以下几个环节：①菌种采集②菌种纯化；3菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5革兰氏染色反应，阳性或阴性；6氧化与发酵试验；7接触酶与氧化酶试验；鞭毛与动力等等。通过上述基础试验结果再结合细菌鉴定检索表，从而确定微生物所属范围，并选择合适的鉴别试验条，将微生物鉴定到种。也可采用分子生物学鉴定方法，提取DNA后通过扩增、序列分析等方法，测定DNA序列，得到鉴定结果。 2基本定向生化试验 在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验成为基本定向生化试验。以下详细介绍这些基本定向生化试验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。 A革兰染色试验 原理：由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；而格兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当酒精脱色时，脂类物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。 制片、染色操作在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹成均匀的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟后，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。 镜检观察在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。观察菌体的形态、排列（分辨并描述是球菌、杆菌、弧菌、放线菌）和大小（用已标定过大小的目镜微尺测量菌体大小）等。 B. 3%氢氧化钾试验 原理：在碱性溶液（3%KOH）中，革兰阴性细菌的细胞壁会快速破裂，细胞内的脱氧核糖核酸被释放到碱性溶液中，使溶液的黏性增强并形成黏丝：而革兰阳性细菌的细胞壁在碱性溶液中不会被溶解，细菌均匀地分散在碱性溶液中不会产生黏性。本实验用于当革兰染色试验的结果来确定革兰染色实验结果。 材料;3%KOH溶液（W/V）、木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物（18-24小时）。 操作:在一洁净的载玻片上等距离滴上滴3%的KOH水溶液;用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照；用枯草芽孢杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照；-用木质或塑料接种环从培养基分别挑取阳性、阴性和待检菌的新鲜纯培养物（18-24小时)于载玻片上的3滴KOH水溶液中，然后用接种环快速
根际细菌分离纯化及鉴定实验方案
根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案 一、方法： 稀释涂布分离法 二、培养基： 1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar) 2、牛肉膏蛋白胨培养基（NB ） 3、金氏培养基B （King ） 4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar) 5、YG 6、NA 7、无氮培养基 8、分解纤维素菌筛选培养基 9、TSA 培养基 三、实验流程 梯度稀释 涂板分离 挑取不同的单菌落于斜面培养 液体培养及液体保种 提取DNA PCR 扩增 酶切带型分型确定操作单元 连接转化 克隆子挑选及PCR 鉴定 测序 序列拼接 建树 采集根际土壤样品
四、具体实验方案 1、采集根际土壤样品：将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。 2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离：梯度稀释土壤样品，取10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10-6六个梯度涂板，每个浓度梯度涂3个平行，过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。选择合适的浓度平板，根据形态、大小、颜色，挑取不同菌株的典型单个菌落，达到分离纯化的目的。 3、挑取不同单菌落于斜面保种：通过上述的分离纯化步骤，可筛选得到不同的菌株，对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。最后斜面放于4℃冰箱保存，备用。 4、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min，37℃）培养。过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。剩下的菌液用于以下实验。 5、提取DNA（CTAB法）： （1）取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。 （2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。 （3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），混匀，于55℃温育1h。 （4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。 （6）冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP 管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。 （7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。 （8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。 （9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
产纤维素酶菌种的研究开题报告
一、研究的目的及其意义 1.意义：能源危机这个时代沉重不可避免的话题以及同样重要的环境污染问题需要更加重视。纤维素乙醇作为新的清洁能源的一支,正在备受瞩目的开发研究之中。当前获得的纤维素酶的活性偏低,满足不了工业化生产的要求。虽然微生物可以直接降解天然的纤维素原料,但是,已知的纤维素酶却不能直接高效的降解结晶纤维素。如何快速有效地获得高活性的纤维素酶及产酶菌株成为了研究的热点之一。本实验利用刚果红脱色圈法,从多种含降解纤维素的自然环境中,得到高纤维素酶的细菌,进一步进行紫外诱变处理,获得酶活显著提高且具有遗传稳定性的菌株,最后通过单因素优化实验,初步确定较优的培养条件。这对利用木质纤维素原料的发酵制备燃料乙醇,解决当今世界所面临的环境污染、资源和能源危机等问题具有一定的现实意义。 2.目的 ①了解产纤维素酶微生物分离的基本原理和方法； ②掌握筛选原则与操作方法； ③掌握纤维素酶活力检测原理与方法； ④掌握诱变育种原理与紫外诱变的操作方法； ⑤掌握优化方法； ⑥掌握发酵罐的基本操作； ⑦了解正交分析方法。 二、国内外的研究现状和发展趋势 据估计,通过植物的光合作用,地球上每年合成的植物量约达1.8*1011t,其中有一半是纤维素物质[1,3],我国每年农作物稻秆?产量达6xl08t之多,利用微生物产生的纤维素酶,将这些闲置的纤维素资源水解转化,则可以在能源、词料、食品、纺织、造纸等方面得以有效利用[4,6],不仅可以减少因堆弃和焚烧对环境带来的污染,还将带来的巨大的经济效益和社会价值。 能源危机和环境污染的凸显,使得可再生清洁能源之一的生物质乙醇的进一步研发迫在眉睫。虽然国内外对于发酵工艺和代谢工程的研究较为广泛,但是目前取得的进展仍然存在较大的不足。一方面,人类获得的纤维素酶酶活力偏低,且不能直接高效降解天然结晶的木质纤维素。另一方面,自然界的大量微生物却可以直接快速的利用天然的木质纤维素来迅速繁衍。筛选并获得高活性的纤维素酶及其菌种,对于纤维素乙醇的研究具有重要意义。 三、研究的主要任务 1.调查并充分查阅资料； 2.设计实验方案； 3.样品的采集与处理； 4.实验操作的准备； 5.详细的实验流程；
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
纤维素酶的生产及分离纯化
纤维素酶 纤维素酶编号：EC 3.2.1.4。它是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，是可以将纤维素分解成多糖或单糖的蛋白质或ＲＮＡ。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属、曲霉属和青霉属。 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 纤维素酶的生产方法： １，固体发酵法 固体发酵法以玉米、稻草等植物秸秆为主要原料生产纤维素酶。该法投资少，工艺简单，产品价格低廉。然而固体发酵法存在着根本上的缺陷——不可能像液体发酵那样随着规模的扩大，大幅度降低成本。以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取和精制。目前生产厂家只能采用直接干燥、粉碎来得到固体酶制剂，或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙，质量不稳定，杂质含量高；劳动强度大、生产效率低；易污染杂菌。国内外对木霉纤维素酶的研究较多，但木霉一方面毒性嫌疑大，使之应用受到限制；另一方面普遍存在着β-葡萄糖昔酶活力偏低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。 ２，液体发酵法
液体发酵生产时，将原料送入发酵罐内发酵，同时接入纤维素酶菌种。发酵过程中，需要从发酵罐底部通入无菌空气对物料进行气流搅拌，发酵完后的物料经过处理可得到纤维素酶产品。液体发酵法生产纤维素酶，原料利用率高，生产条件易控制、产量高、劳动强度小、产品质量稳定，但动力消耗大，设备要求高。液体深层发酵的方法具有培养条件容易控制，不易染菌，生产效率高等特点。因此，目前此方法是大规模生产的可行方法。 其生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至20目以下，进行灭菌处理后，送发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70 h，控制温度低于60℃，将净化后的无菌空气从釜底通入，进行物料的气流搅拌，发酵完的物料经压滤机压滤、超滤浓缩、喷雾干燥，制得纤维素酶产品。其流程为: 空气→过滤 ↓ 原料→发酵罐→浸泡→粗滤→超滤提取→成品 ↑ 种子→摇瓶(床) 纤维素酶的分离纯化 纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法、酒精沉淀法、丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但在纤维素酶分析研究上主要采用一系列蛋白质分离纯化技术，如分级沉淀、色谱法、电泳法等。目前，对粗酶的提取大多采用硫酸桉分级沉淀法；对酶活力的测定国际上一般采用Horikoshi方法；对蛋白质的测定按考马斯亮蓝(Bradford)法；还原糖的测定采用３,５一二硝基水杨酸(DNS)法。以下介绍一些常用的纯化方法：
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程
目录 2.1菌株的分离纯化 (1) 2.1.1菌株的分离 (1) 2.1.2菌株的纯化 (1) 2.2菌株的鉴定 (2) 2.2.1革兰氏染色镜检 (2) 2.2.2菌株的生化鉴定 (2) 2.3药敏试验 (3) 2.3.1药物的配制 (3) 2.3.2质控 (4) 2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (4) 2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7) 2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7) 2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7) 2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)
2.1菌株的分离纯化 2.1.1菌株的分离 2.1.1.1实验的准备 1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管 （1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁； （2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡； （3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz； （4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz； （5）倒出管中水，重复（4）一次； （6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干； （7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min； （8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。 2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。 3.试管的准备：本实验需要100根试管 （1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁； （2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压； （3）取出后烘干待用。 4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管 根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。 5.麦康凯琼脂培养基的准备： 按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。 2.1.1.2实验过程 （1）每个分离管装入20mlBPW； （2）三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中，按肉样的标号在分离管上标号，放入37±1℃温箱摇床上培养6h，200r； （3）取分离管中的菌液50μL加入LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r； （4）用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养。 2.1.2菌株的纯化 2.1.2.1实验的准备 1.伊红美兰（EMB）琼脂培养基的准备： 按所选商品的规格配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。 2. LB肉汤培养液的准备：同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。 2.1.2.2实验过程
纤维素酶产生菌的筛选分离
纤维素酶产生菌的筛选分离 一、实验目的： 1.掌握无菌操作的技术 2.掌握选择培养基的设计和配制 3.掌握特定菌种筛选方法 4.掌握菌种鉴定方法 5.测定菌种生长曲线和纤维素酶的活性 二、实验原理： 该研究设计性实验是利用纤维素酶产生菌可以分解纤维素酶，故而在含有羧甲基纤维素的平板（pH9.0）上可形成透明圈的原理和筛选纤维素酶产生菌。 三、实验内容： (1)培养基 ①选择培养基的配制 同体培养基： 250mL三角瓶、1.8g营养肉汤、100mL水、pH9.0、2g CNC-Na、2g琼脂、搅拌均匀包扎灭菌 液体培养基：
250mL三角瓶、1.8g营养肉汤、100mL水、pH9.0、2g CNC-Na、2g琼脂、搅拌均匀包扎灭菌（配制2份备用） ②摇瓶发酵培养基的配制 蛋白胨 1.0%、酵母粉 1.0%、CMC-Na1.0%、NaCL0.5%、KH2PO4 0.1%，另配10% NaCO3，分开灭菌后与上述培养基成分按1:9的比例混合均匀，使培养基的初始PH为9.5-10 （2）配制筛选平板和斜面培养基 在超净台中将上述培养基倒入平板和试管，试管倾斜放置，待培养基凝固后，低温保存，待用。 （3）菌种筛选 ①称取土样10g，用无菌水稀释定容至100mL，将土壤液稀释至移取150mL土壤悬液到筛选平板A，均匀涂布后于30。C恒温培养箱培养12h. ②待平板A长出单菌落后，用接种环挑取每个单菌落的一半到另一筛选平板C上，作染色鉴定，原来平板B保存于4。C的冰箱中，保藏备用 ③将用于染色鉴定的筛选平板C于30。C恒温培养1-2d，向培 养皿中加入适量1mg/mLa的刚果红溶液，并染色1h;弃去染液，加入适量1mol/L的NaCla溶液，洗涤1h，若细菌产生纤