高通量测序

高通量测序
高通量测序

高通量测序

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation" sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

名词解释

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA 纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deepsequencing)。

2实验过程

1.样本准备(sample fragmentation)

2.文库构建(library preparation)

3.测序反应(sequencing reaction)

4.数据分析(data analysis)[1]

3测序平台

自从2005年454 Life Sciences公司(2007年该公司被Roche正式收购)推出了454 FLX焦磷酸测序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以来,曾推出过3730xl DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)的Applied BioSystem(ABI)这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了,因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了两个强有力的竞争对手,一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer),,另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform),为此,2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。(见表一)

公司名称技术原理技术开发者商业模式

Apply Biosystems(ABI) 基于磁珠

的大规模

并行克隆

连接DNA测

序法

美国Agencourt私

人基因组学公司

(APG)

上市公司:销售设备和试剂获

取利润

Illumina 合成测序

英国Solexa公司首

席科学家David

Bentley

上市公司:销售设备和试剂获

取利润

Roche 大规模并

行焦磷酸

合成测序

美国454 Life

Sciences公司的创

始人Jonathan

Rothberg

上市公司:销售设备和试剂获

取利润

Helicos 大规模并

行单分子

合成测序

美国斯坦福大学生

物工程学家Stephen

Quake

上市公司:2007年5月首次

公开募股(IPO)(P.S.由于

该平台准确率太低等原因,该

公司已于2012年宣告破产)

Complete Genomics DNA纳米阵

列与组合

探针锚定

连接测序

美国Complete

Genomics公司首席

科学家radoje

drmanac

私人公司:投资额为4650万

美元

表一:主流测序平台一览[2]

Roche 454焦磷酸测序

(pyrophosphate sequencing)

Illumina Solexa 合成测序

(sequence by synthesize)

Illumina Genome AnalyzerIIx测序原理

Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性,高通量,高灵敏度,和低运行成本等突出优势,可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术,基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flow cell),这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在Flow cell上形成了数以亿计Cluster,每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。

ABI SOLiD连接法测序

(sequence by ligation)

4技术应用

测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展,科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种,进行全基因组重测序(resequencing),在全基因组水平上扫描并检测突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing),从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究;或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing),通过分离特定大小的RNA

分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针,这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合,从而富集到特定区段,然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ,应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势,不仅仅是费用较低,更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小,与生物学表型结合更为直接。目前,高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变,

Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序,平均覆盖度为43倍,读长为50 nt,每个个体产生了2.7-3 GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因,最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以Science杂志年度十大科学突破上疾病进行研究,包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病,以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的评选中,外显子组测序名列其中。

以上我们盘点了2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。但是除了第二代测序之外,还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中,只是还没有正式发布。所以目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。

5意义

高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降, 以人类基因组测序为例, 上世纪末进行的人类基因组计划花费 30 亿美元解码了人类生命密码, 而第二代测序使得人类基因组测序已进入万(美)元基因组时代。如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中, 对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。[3]

参考资料

高通量测序基础知识

高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序? 高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序(一代测序) Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序(Genome Re-sequencing) 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序,并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低,人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序,实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点,以及结构变异等,具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序:其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼接,组装,从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展,基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低,大规模基因组测序渐入佳境,基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序(whole exon sequencing) 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。

DNA测序结果分析

学习 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成,代表不同的碱基序列。测序图的两端(本图原图的后半段被剪切掉了)大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大,无法判读,这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时,要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近(通常要大于50个碱基距离),以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的,因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上,要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。由于临床专业的研究生,这些东西是没人带的,只好自己研究。开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰,就是杂合子位点。实际比对了数千份序列后才知道,情况并非那么简单,下面测序图中标出的两

个套峰均不是杂合子位点,如图并说明如下: 说明:第一组套峰,两峰的轴线并不在同一位置,左侧的T峰是干扰峰;第二组套峰,虽两峰轴线位置相同,但两峰的位置太靠近了,不是杂合子峰,蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成,此处的序列被机器误判为“C”,实际的序列应为“A”,通常一个高大碱基峰的前面1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰,峰的高度大约是高大碱基峰的1/2,离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是:主峰通常在干扰峰的右侧,干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较;一个位点的多个样本相比较;你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。通常,对于一个疑似突变位点来说,即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话,那么单纯通过测序结果就判定它是突变点,是并不严谨的,因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同,很难避免不产生误差的。对于一个未知

高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)

基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序,是首次对一个物种的基因组进行测序,用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装,从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种: 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序; 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序; 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序,搭建骨架,再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序,完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件,并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究,为后续的相关研究奠定基础。 实验流程: 公司服务内容 1.基本服务:DNA样品检测;测序文库构建;高通量测序;数据基本分析(Base calling,去接头, 去污染);序列组装达到精细图标准 2.定制服务:基因组注释及功能注释;比较基因组及分子进化分析,数据库搭建;基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求?

(1) 对于细菌真菌,样品来源一定要单一菌落无污染,否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上), OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;每次样品制备需要10 μg样品,如果需要多次制备样品,则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物,样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品,最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上),OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;样品总量不小于500 μg,详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物,样品来源应选用肌肉,血等脂肪含量少的部位,同一个体取样,最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上),OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;样品总量不小于500 μg,详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证,用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454,Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中,Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp,经常用于基因组骨架的组装,而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例,对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段,引物序列连接到DNA片段的一端,然后末端加上接头,将片段固定在flow cell上生成DNA簇,上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点,在第一轮测序完成后,去除第一轮测序的模板链,用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增,以达到第二轮测序所用的模板量,进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法

高通量测序RNA-seq数据的常规分析

案例一 虽然RNA-seq早已被大家所熟知,特别是在高通量测序越来越便宜的今天,但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。多个软件的使用,参数设置,参考基因组准备,输出结果的解读等等,都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。 哈哈,不用怕,有云生信,这都不是事儿!今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。不过在此之前,我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程,请不要拍砖头。图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程:根据实验设计,提取细胞RNA,并将RNA提交给测序公司,就可以坐等测序数据了。测序公司会根据客户提供的RNA进行建库,上机测序。拿到测序数据后,就到了我们大显身手的时候了。首先,我们要对测序结果做个简单的质量评估,剔除低质量的数据。然后,根据基因组数据(这里我们讲的是基因组数据已知的物种,基因组未知的有套独立的流程,这里不讲),将测序数据组装。根据组装结果,计算基因或转录本的表达量。最后,同芯片数据一样,我们可以根据表达量数据做很多分析,如差异表达分析,网络分析(包括蛋白互作网络,共表达网络等),也可以结合临床数据做分析(如预后,亚型分类、关联,药效等)。 图1. RNA-seq常规分析流程

叨叨完毕,进入正题。 进入尔云后,打开“测序数据处理”模块,我们会看到图2的结果。在这一模块,我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步:1、数据质控和过滤低质量数据;2、基因组组装,计算基因表达量。对于上面两部,尔云又根据是双端测序还是单端测序,分了两块。以edgeR 为例,输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表,有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。 图2. 测序数据处理模块 质控结束后,尔云会给出全部的质控结果。图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果,好多好多呀,可以下了慢慢看。建议主要关注一下xxx_qc_TABLE,该表格是对质控前后的数据统计,反应了测序的好坏。Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据,是第2步组装的输入文件。 图3.质控结果 组装完成后,会返回一个expression.txt的表达矩阵文件,该文件是下一步差异表达分析的输入分析。 得到表达矩阵后,我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。进入尔云的“差异分析”模块(如下图所示),它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。对于RNA-seq

高通量测序的生物信息学分析

附件三生物信息学分析 一、基础生物信息学分析 1.有效测序序列结果统计 有效测序序列:所有含样品barcode(标签序列)的测序序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 注:合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。 图形示例为: 2.优质序列统计 优质序列:有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 图形示例为:

3.各样本序列数目统计: 统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。 结果示例为: 4.OTU生成: 根据序列的相似性,将序列归为多个OTU(操作分类单元),以便后续分析。 5.稀释曲线(rarefaction 分析) 根据第4条中获得的OTU数据,做出每个样品的Rarefaction曲线。本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。 rarefaction曲线结果示例:

6.指数分析 计算各个样品的相关分析指数,包括: ?丰度指数:ace\chao ?多样性指数:shannon\simpson ?本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。 多样性指数分析结果示例: 注:默认分析以上所列指数,如有特殊需要请说明。 7.Shannon-Wiener曲线 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线,反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物信息。绘制默认水平为:0.03。 例图:

8.Rank_Abuance 曲线 根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。结果文件默认为PDF格式(其它格式请注明)。 例图: 9.Specaccum物种累积曲线(大于10个样品) 物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况,是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具,在生物多样性和群落调查中,被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。因此,通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分,在抽样量充分的前提下,运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析 对于一些生物测序公司(如Invitrogen等),我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题,但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢? PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基,我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理,通常PCR产物结束的位点,PCR产物测序一般末端的一个碱基为A(绿峰),也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起,有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时,在序列的起始端的小片段容易丢失,导致起始区信号过低,机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基(ABI3730可以达到1200bp),但是,只有一般600bp以前的碱基是可靠的,理想条件下,多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列,由于测序毛细管胶的分辩率问题,会有许多碱基分不开,就会产生N值。测序模板本身含杂合序列,该情况主要发生在PCR产物直接测序,由于PCR产物本身有突变或含等位基因,会造成在某些位置上有重叠峰,产生N值。这种情况很容易判断,那就是整个序列信号都非常好,只有在个别位置有明显的重叠峰,视杂合度不同N值也不同。 测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的,所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物 (<600bp),可以用另一端的引物进行测序,从另一端测序可以一直测通,可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列,一个测序反应测不通,就只能将PCR产物片段克隆到载体中,用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间

高通量测序及分析

高通量测序与功能分析 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序,通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系,寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类,一类是通过16s rDNA,18s rDNA,ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性;还有一类是宏基因组测序,是不经过分离培养微生物,而对所有微生物DNA进行测序,从而分析微生物群落构成,基因构成,挖掘有应用价值的基因资源。 以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析,目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析,大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。 目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种(species)(一般只能对部分菌进行种的鉴定),甚至对亚种级别进行分析, 几个概念: 16S rDNA(或16S rRNA):16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。 OTU:operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到,通过提取样品的总基因组DNA,利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增,通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性,那怎么区分这些不同的序列呢,这个时候就需要引入operational taxonomic units,一般情况下,如

DNA测序结果分析比对(实例)

DNA测序结果分析比对(实例) 关键词:dna测序结果2013-08-22 11:59来源:互联网点击次数:14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件,下面是一份测序结果的实例: CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开,.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称:Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图: .ab1文件打开后如下图: 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成,代表不同的碱基序列。测序图的两端(下图原图的后半段被剪切掉了)大约50个碱

基的测序图部分通常杂质的干扰较大,无法判读,这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时,要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近(通常要大于50个碱基距离),以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的,因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上,要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰,就是杂合子位点。实际比对后才知道,情况并非那么简单,下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点,如图并说明如下:

说明: 第一组套峰,两峰的轴线并不在同一位置,左侧的T峰是干扰峰;第二组套峰,虽两峰轴线位置相同,但两峰的位置太靠近了,不是杂合子峰,蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成,此处的序列被机器误判为“C”,实际的序列应为“A”,通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰,峰的高度大约是高大碱基峰的1/2,离得越近受干扰越大。 一个摸索出来的规律是:主峰通常在干扰峰的右侧,干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较;一个位点的多个样本相比较;你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。 通常,对于一个疑似突变位点来说,即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话,那么单纯通过测序结果就判定它是突变点,是并不严谨的,因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同,很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现,通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑:大汉昆仑王)

高通量测序中常用的生物信息分析名词解释

高通量测序中常用的生物信息分析名词解释 1. 什么是Read? 高通量测序平台产生的序列就称为reads。 (测序读到的碱基序列片段,测序的最小单位;) 2. 什么是Contig? 拼接软件基于reads之间的overlap区,拼接获得的序列称为Contig(重叠群)。 (由reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段;) 3. 什么是Scaffold? 基因组de novo测序(没有参考基因组的测序,需要研究人员从头拼接得到的序列),通过reads拼接获得Contigs后,往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库,以获得一定大小片段(如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb)两端的序列。基于这些序列,可以确定一些Contig 之间的顺序关系,这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。 (通过pair ends信息确定出的contig排列,中间有gap) 4. 什么是Contig N50? Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加,能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序,如获得Contig 1,Contig 2,Contig 3...………Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Contig总长度的一半时,最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。举例:Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度*1/2时,Contig 4的长度即为Contig N50。

基因芯片与高通量测序

基因芯片: 将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400 )探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说,就是通过微加工技术,将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA 片段(基因探针),有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上,构成的一个二维DNA探针阵列,与计算机的电子芯片十分相似,所以被称为基因芯片。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置,获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因探针是人工合成的碱基序列。,所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术,把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面,可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析 基因芯片制作 、芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体,采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外,还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。 2、样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片反应,有时样品的量很小。所以,必须将样品进行提取、扩增,获取其中的蛋白质或DNA、RNA,然后用荧光标记,以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配率。 4、信号检测和结果分析 杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像,将荧光转换成数据,即可以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。使用缩微芯片实验室,就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

高通量测序(NGS)数据分析中的质控

高通量测序错误总结 一、生信分析部分 1)Q20/Q30 碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标,质量值越高代表碱基被测错的概率越小。Q30代表碱基的正确判别率是99.9%,错误率为0.1%。同时我们也可以理解为1000个碱基里有1个碱基是错误的。Q20代表该位点碱基的正确判别率是99%,错误率为1%。对于整个数据来说,我们可以认为100个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中,背景颜色沿y-轴将坐标图分为3个区:最上面的绿色是碱基质量很好的区,Q值在30以上。中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区,Q值在20-30之间。最下面红色的是碱基质量很差的区。在一些生信分析中,比如以检查差异表达为目的的RNA-seq分析,一般要求碱基质量在Q在Q20以上就可以了。但以检查变异为目的的数据分析中,一般要求碱基质量要在Q30以上。 一般来说,测序质量分数的分布有两个特点: 1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。 2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高,质量值相对较低。

在图中这个例子里,左边的数据碱基质量很好,而右边的数据碱基质量就比较差,需要做剪切(trimming),根据生信分析的目的不同,要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。

2)序列的平均质量 这个是碱基序列平均质量报告图。横坐标为序列平均碱基质量值,纵坐标代表序列数量。通过序列的平均质量报告,我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。一般来说,当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30,可以判断序列质量较好。如这里左边的图,我们可以判断样品里没有显著数量的低质量序列。但如果曲线如右边的图所示,在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰,说明测序数据中有一部分序列质量较差,需要过滤掉。

DNA测序结果分析

DNA果套峰分析 Q-12. 测序结果有很多套峰(出现很多N),还照常收费,为什么? 返回顶端 A-12. DNA模板上出现二处以上的引物结合位点,或者DNA模板上有严重的重复序列,以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象(见图4)。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物本身所造成,对这些结果(公司保证进行2次以上的测序工作),公司会根据具体情况进行收费(详细见测序结果说明)。 Q-13. 为什么用PCR产物测序时,经常会出现套峰现象? 返回顶端 A-13. PCR产物测序出现套峰现象,一般有以下几种原因: 1)PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好,扩增出的产物除了目的片段外,还有与目的片段长度相近的片段,即使用凝胶电泳也无法分离开,这样的PCR产物测序结果是套峰。 2)结构上的原因,造成了PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/G/C/T以及原因不明的复杂结构的存在,都会出现测序结果套峰的情况。 Q-14. 出现套峰的原因是什么?返回顶端 A-14. 在测序反应中,模板或引物的原因都可能造成套峰的形成,归结其形成原因有以下几点 1)测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰 2)模板不纯,如果是质粒或是菌液,原因是非单克隆,如果是PCR,原因为非特异性条带 3)模板序列的特殊结构,如poly结构、发卡结构等 4)引物降解,引物不纯,或引物的特异性不好 Q-15. 测序结果不到800 Bases,还照常收费了,为什么? 返回顶端 A-15. 如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成(公司保证进行2次以上的测序工作)。对这些结果,公司会根据具体测序情况,进行收费(详细见测序结果说明)。出现这些情况的原因分析如下: 1) G/C rich、G/C Cluster:这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失(见图1); 2) A、T的连续结构:这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰(见图2)。根据文献记载,原因在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成测序结果紊乱,出现套峰。出现这样的情况,建议反向测序。 一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。 一般来说,PCR片段直接测序时,A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应(测序反应本身也是PCR 反应)二次聚合酶的打滑现象。 3)原因不明的复杂结构,测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行(见图3)。 查看大图

高通量测序分析

高通量测序分析 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(Deep Sequencing)。 对于微生物群落多样性分析,基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq等第二代高通量测序平台,对核糖体DNA高变区域,比如16S/18S/ITS等序列;或功能基因,比如细菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析,揭示环境样品中众多不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。高通量测序获得庞大的数据信息,通过生物信息学手段,结合统计分析,对大量数据进行PCA、PCoA等分析,得出不同条件取样中微生物的主要组成成分是否存在差异;并进一步通过RDA分析,找到与环境因子(理化因子、疾病等)相关的微生物群落组成。探讨微生物多样性,对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源利用,及疾病预防和诊断等有着重要的理论和现实意义。高通量测序及微基生物的优势: 1.测序通量高,可检测到环境样品中的痕量和微量微生物。 2.PCR产物可直接进行测序,结果稳定,重复性强,实验周期短。 3.微基生物开发了一套稳定的多样本平行测序实验方案,解决了样本间数据量不平衡的技术难题,一次可实现上百个样品的平行测序。 4.微基生物采用顶级期刊杂志Science中2012年7月发表文献中的低偏差扩增(LEA-Seq)方法构建文库,更真实的还原样本中微生物的分布比例。 5. 微生物群落多样性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq两种高通量测序平台可供选择,根据不同的测序要求提供不同的解决方案。 6.专业的生物信息学分析人员,真实准确的对测序结果进行数据分析,针对客户的不同需求,提供专业的分析流程和结果。 生物信息学分析流程: 实验流程:

高通量测序,名词解释

高通量测序基础知识汇总 一代测序技术:即传统的Sanger测序法,Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术:next generation sequencing(NGS)又称为高通量测序技术,与传统测序相比,二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定,从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。NGS主要的平台有Roche(454 & 454+),Illumina(HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq),ABI SOLiD等。 基因:Gene,是遗传的物质基础,是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代,使后代出现与亲代相似的性状。 DNA:Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸,一个脱氧核苷酸分子由三部分组成:含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链,即DNA链,DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息,是绝大部分生物遗传信息的载体。

高通量测序数据分析-环境样品数据处理方法

环境微生物群落多样性分析 QQ空间新浪微博腾讯微博微信更多71微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来,由于受到技术限制,对微生物群落结构和多样性的认识还不全面,对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新,微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术(尤其是Roche 454高通量测序技术)的成熟和普及,使我们能够对环境微生物进行深度测序,灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化,对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内,微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例,通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化,可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析,研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系;通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。 研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多,从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类:传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。 近几年,随着分子生物学的发展,尤其是高通量测序技术的研发及应用,为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术,在其实验结果中往往只含有数十条条带,只能反映出样品中少数优势菌的信息;另一方面,由于分辨率的误差,部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA序列,因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息,还需对每一条带构建克隆文库,并筛选克隆进行测序,此实验操作相对繁琐;此外,采用这种方法无法对样品中的微生物做到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息,“只能验证已知,却无法探索未知”,此方法通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。 而近年来以454焦磷酸测序为代表的高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。Roche 454高通量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测,获得样品中的微生物群落组成,并将其含量进行数字化。最近,美吉生物推出了新的测序平台———MiSeq。MiSeq高通量测序平台集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的优点,不仅可实现

高通量测序分析的几个方面及设计的生物信息技术

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。 ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。 技术路线 实验流程 生物信息分析流程

测序 对客户提供的ChIP样品(如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的)进行定量检测,检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇(Cluster generation)扩增、高通量测序。 基本数据分析 数据产出统计:对测序结果进行图像识别(Base calling),去除污染及接头序列;统计结果包括:测定的序列(Reads)长度、Reads数量、数据产量。 高级数据分析 标准高级数据分析内容包括: (1)ChIP-Seq序列与参考序列比对; (2)Peak calling:统计样品Peak信息(峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数); (3)统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度; (4)给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释; (5)在多个样品间,对与Peak关联基因做差异分析。 转录组基因分析:RNA-seq RNA-seq即转录组测序技术,就是把mRNA,smallRNA,andNONcoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。 转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定生物学过程以及

微生物群落多样性测序与功能分析(总结版)

微生物群落多样性测序与功能分析(总结版) 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序,通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系,寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类,一类是通过16s rDNA,18s rDNA,ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性;还有一类是宏基因组测序,是不经过分离培养微生物,而对所有微生物DNA进行测序,从而分析微生物群落构成,基因构成,挖掘有应用价值的基因资源。 以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析,目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析,大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。 目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种(species)(一般只能对部分菌进行种的鉴定),甚至对亚种级别进行分析, 几个概念: 16S rDNA(或16S rRNA):16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。

OTU:operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到,通过提取样品的总基因组DNA,利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增,通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性,那怎么区分这些不同的序列呢,这个时候就需要引入operational taxonomic units,一般情况下,如果序列之间,比如不同的16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定义为一个OTU,每个OTU对应于一个不同的16S rRNA序列,也就是每个OTU对应于一个不同的细菌(微生物)种。通过OTU分析,就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。 测序区段:由于16s rDNA较长(1.5kb),我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16s rDNA包含有9个可变区,分别是v1-v9。一般我们对v3-v4双可变区域进行扩增和测序,也有对v1-v3区进行扩增测序。 ?16s rDNA测序首先需要提取环境样品的DNA,这些DNA可以来自土壤、粪便、空气或水体等任何来源。 ?提取DNA后需要经过质检和纯化,一般16s rDNA测序扩增对DNA的总量要求并不高,总量大于100ng,浓度大于10ng/ul一般都可以满足要求。如果是来自和寄主共生的环境如昆虫的肠道微生物,提取时可能包括了寄主本身的大量DNA,对DNA的总量要求会提高。微生物菌群多样性测序受DNA提取和扩增影响很大,不同的扩增区段和扩增引物甚至PCR循环数的差异都会对结果有所

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