菌种岗位操作规程

菌种岗位操作规程
菌种岗位操作规程

菌种岗位操作规程

一、菌种岗位工艺流程

安培管无糖斜面斜面摇瓶种液生产种液接种上罐

二、开安培管制备无糖斜面

1、目的:将经过休眠的安培管菌种扩大培养到无糖斜面上。

2、操作规程:

2.1前期准备工作:先将无菌间、摇瓶间、缓冲间擦拭干净,擦拭部位包括摇瓶机、冰箱、超净工作台、培养箱、桌子、凳子、吊顶、墙面、地板以及其他无菌室内必须的物品和工具。擦拭过程应先用清水擦拭,再用消毒液擦拭。然后将无菌风通入,调试好摇瓶间的温度控制装置。通风2天待无菌室、摇瓶间温度稳定并符合要求后,做无菌平板,检验无菌度合格后,无菌室才能投入使用。

2.2进无菌室前准备工作:进无菌室前半小时,先打开无菌室超净工作台使之运行,然后将消毒过的需要使用的物品和未经接种的经过挑选空白无糖斜面放入缓冲间,最后依次打开超净工作室、无菌室、缓冲间的紫外灯。进入无菌室应先关闭紫外灯,然后打开日光灯,进入缓冲间前应先用75%酒精棉球擦拭手和需要使用的器皿,然后将安培管放进用75%酒精棉球擦拭过的100ml烧杯中(烧杯内部与先放入消毒过的纱布垫好)一起带入缓冲间,先用消毒液洗手然后更换无菌衣,然后将待接种斜面和安培管一起带入无菌室,进入无菌间每道门应侧身迅速进入,并迅速关闭每道门。进入无菌间后动作要轻,先用消毒液洗手,关闭超净工作台上的紫外灯,打开台面日光灯,然后用消毒液擦拭超净工作台台面,然后将待接种的斜面和安培管用消毒液擦拭,轻轻有序的放在超净工作台台面上,然后取75%酒精棉球擦手和安培管外表面,在试管斜面背面用记号笔做好标示,将包裹在斜面口上的牛皮纸拿掉,解取斜面口上扎纱布的绳子,准备接种。

2.3开安培管:接安培管需二人配合用小砂轮片在安培管上口部位磨一圈,然后在酒精灯火焰附近打开安培管,若开不了,在酒精灯火焰上烘烤划口部位,再在划扣部位滴75%的酒精使加热部位急剧冷却,在酒精灯火焰附近用酒精棉球包住划扣上部掰开安培管。

2.4接种:在酒精灯火焰附近剥开接种环外包裹的牛皮纸,取出接种环,在酒精灯火焰上用火稍微烧一下,然后将接种环放在安培口,同时另一人在酒精灯火焰附近轻轻取出待接种的斜面棉塞,带接种环冷却后用接种环将安培管内的奶粉搅碎,挑取一环奶粉划线涂布到待接种斜面上,接种完毕后另一人将接好种的斜面棉塞先用酒精火焰燎一下,然后塞上棉塞,包好纱布,在接种下一支斜面,打开安培管要一次接完。每只按配管科接种3-4支试管斜面。

2.5结束:将接种好的斜面及其他用品放入铁丝框内,带出无菌室,关闭超净工作台,用消毒液擦拭超净工作台台面和无菌室地面、墙面,打开紫外灯照射20分钟。出无菌室时将所有物品带出无菌室,人出了无菌室后将无菌室及缓冲间的紫外灯打开半小时。

2.6培养、保存:将接完种的斜面倒置放在事先调好温度的30o C培养箱内培养24小时,带斜面种子长丰满后,用消毒过的牛皮纸包裹好试管口,放入5o C冰箱保存。

3、注意事项:○1无菌室内的操作要求轻拿轻放。动作一定要轻、快、稳、准。○2

进入无菌室内与接种无关的物品不得带入无菌室,需要使用的物品和斜面要带有备用的。进入无菌室后不得随便出入无菌室。○3进入无菌室手要消毒,未经消毒

的物品不得带入无菌室。○4无菌室每半个月要做一次无菌检测。即在无菌室的四个角和超净工作台上和顶部各放置一块开上盖的无菌平板20分钟,盖上上盖在35-37o C培养箱内培养24小时。检查菌落数。不得超过5个,若超过则要对无菌室重新处理。○5安培管个体较小,在酒精灯火焰附近不要太近,否则会将安培管内的菌种烫死。○6接种过程中接种环不得碰到安培管和斜面外壁,安培管口和斜面口要靠近酒精灯火焰上方,但不能在火焰上烧。

三、有糖斜面的制备

1、目的:将无糖斜面菌种扩大到有糖斜面上,为生产提供优质合格的斜面。

2、操作过程:

2.1进无菌室前准备工作:进无菌室前半小时,先打开无菌室超净工作台使之运行,然后将消毒过的需要使用的物品和未接种的空白有糖斜面放入缓冲间,最后依次打开超净工作台、无菌室、缓冲间的紫外灯。进无菌室应先关闭紫外灯,然后打开日光灯,进入缓冲间前先用75%酒精棉球擦拭手和需使用的器皿,然后将无糖种子斜面放进用75%酒精棉球擦拭过的100ml烧杯中(烧杯内部预先放入消毒过的纱布垫好)或试管架上,一起带入缓冲间,先用消毒液洗手,然后更换无菌衣,然后将待接种的斜面和种子斜面一起带入无菌室,进入无菌间每道门应侧身迅速进入,并迅速关闭每道门。进入无菌室后动作要轻,先用消毒液洗手,关闭超净工作台上的紫外灯,打开台面日光灯,然后用消毒液擦拭超净工作台,然后将待接种的斜面和安培管用消毒液擦拭,轻轻有序的放在超净工作台台面上,然后取75%酒精棉球擦手和无糖斜面外表面,在试管背面做好标示,将包裹在斜面口上的牛皮纸拿掉,将牛皮纸整理好并放好,解去斜面口上扎纱布的绳子,准备接种。

2.3接种:在酒精灯火焰附近剥开接种环外包裹的牛皮纸,取出接种环,在酒精灯火焰上用火稍微烧一下,先在酒精灯火焰附近打开斜面的绳子,拿去纱布,然后用另一只手的小拇指和无名指夹住斜面的棉塞,轻轻拔去棉塞。然后将接种环放在试管口,同时另一人在酒精灯火焰附近轻轻取出待接种的斜面棉塞,待接种环冷却后用接种环在无糖斜面上括取一环菌种,划线涂布到待接种的有糖斜面上,接种完毕后另一人将接种好的斜面棉塞现在酒精灯火焰上用火燎一下,然后盖上棉塞,包好纱布。在接种下一支斜面。

2.4结束:将接种好的斜面及其他用品放入铁丝框内,带出无菌室,关闭超净工作台,用消毒液擦拭超净工作台台面和无菌室地面、墙面,打开紫外灯照射20分钟。出无菌室时将所有物品带出无菌室,人出了无菌室后将无菌室及缓冲间的紫外灯打开半小时。

2.5培养、保存:将接种完的斜面倒置放在事先调好温度的30o C培养箱内培养22-24小时,带斜面种子长丰满后,用消毒过的牛皮纸包裹好试管口,外面再包一层牛皮纸,放入5o C冰箱保存。

3、注意事项:○1接触斜面或安培管等其他消毒过的物品前,应先用75%酒精棉擦拭手。○2培养好的有糖斜面要认真检查,有无异常菌落或其他颜色菌落,若发现有则应剔除处理。进入无菌室后不得随便出入无菌室。○3无糖斜面为保存菌种斜面保存时间不要超过三个月,若超过三个月应重新移接一次。○4接种过程中接种环不得碰到斜面的外壁,烧过的接种环要冷却后才能刮菌种以防把菌种烫死。○5二人协作操作时要配合好,试管斜面口上方不得有任何操作。○6未接种完的无糖斜面应用纱布包好棉塞和牛皮纸。

四、液体种的纸杯

1、目的:将有糖斜面菌种扩大培养到液体种子培养基上,为生产提供优质的足够数量的菌种。

2、操作过程:

2.1进无菌室前准备工作:进无菌室前半小时,先打开无菌室超净工作台使之运行,然后将消毒过的需要使用的物品和未经接种的液体种瓶放入铁丝框,拿进缓冲间,最后依次打开超净工作台、无菌室、缓冲间的紫外灯。进无菌室应先关闭紫外灯,然后打开日光灯,进入缓冲间前应先用75%酒精棉球擦手和需要使用的器皿,然后将有糖种子斜面放进用75%酒精棉球擦拭过的100ml烧杯中(烧杯内部预先放入消毒过的纱布垫好)或试管架上,一起带入缓冲间,先用消毒液洗手,然后更换无菌衣,然后将液体种子和种子斜面一起带入无菌室,进入无菌间每道门应侧身迅速进入,并迅速关闭每道门。进入无菌室后动作要轻,先用消毒液洗手,关闭超净工作台上的紫外灯,打开台面日光灯,然后用消毒液擦拭超净工作台,然后将待接种的液体种瓶和有种斜面用消毒液擦拭,轻轻有序的放在超净工作台台面上,然后取75%酒精棉球擦手,将包裹在斜面口上的牛皮纸拿掉,将牛皮纸整理好并放入铁丝框内,解去种子斜面上扎纱布的绳子,准备接种。

2.3接种:在酒精灯火焰附近剥开接种环外包裹的牛皮纸,取出接种环,在酒精灯火焰上用火稍微烧一下,先在酒精灯火焰附近打开无糖斜面的绳子,拿去纱布,然后用另一只手的小拇指和无名指夹住斜面的棉塞,轻轻拔去棉塞。然后将接种环放在试管口,同时另一人在酒精灯火焰附近轻轻取出待接种的液体种瓶瓶盖,待接种环冷却后用接种环在种子斜面上括取二环菌种,接种到液体种液中,接种完毕后另一人将接种好的纱布瓶盖现在酒精灯火焰上用火燎一下,然后盖上纱布瓶盖,用绳子扎好纱布。在接种下一只液体种瓶。

2.4结束:将接种好的斜面及其他用品放入铁丝框内,带出无菌室,关闭超净工作台,用消毒液擦拭超净工作台台面和无菌室地面、墙面,打开紫外灯照射20分钟。出无菌室时将所有物品带出无菌室,人出了无菌室后将无菌室及缓冲间的紫外灯打开半小时。

2.5培养、保存:将接种完的液体种瓶放置到摇瓶机培养20小时左右,待液体种液颜色变黄后取出放入5o C冰箱中或转接摇瓶种子。

3、注意事项:○1液体种液接种量一定要足,要一致,否则培养时间会延长。○2培养好的液体种液要观察颜色和气味,发现异常及时处理掉。○3接种斜面要注意尽量不要括取斜面顶部的种子。○4拿去接种瓶要尽量要尽量拿去三角瓶下方,不得拿瓶口位置。○5放置到摇床上应用双手将三角瓶放好,开启摇床要逐步加快速度,以防将种液溅到瓶盖上造成污染。○6未接种完的斜面种子要处理掉,不得重复使用。

五、液体种子的制备

1、目的:将有糖斜面菌种扩大到液体种子培养基,为生产提供优质合格的足量的菌种。

2、操作过程:

2.1进无菌室前准备工作:进无菌室前半小时,先打开无菌室超净工作台使之运行,然后将消毒过的需要使用的物品和未经接种的液体种瓶放入铁丝框,拿进缓冲间,最后依次打开超净工作台、无菌室、缓冲间的紫外灯。进无菌室应先关闭紫外灯,然后打开日光灯,进入缓冲间前应先用75%酒精棉球擦手和需要使用的器皿,然后将液体种子放进铁丝框中,一起带入缓冲间,先用消毒液洗手,然后更换无菌衣,然后将液体种瓶和种子斜面一起带入无菌室,进入无菌间每道门应

侧身迅速进入,并迅速关闭每道门。进入无菌室后动作要轻,先用消毒液洗手,关闭超净工作台上的紫外灯,打开台面日光灯,然后用消毒液擦拭超净工作台,然后将待接种的液体种瓶和有种斜面用消毒液擦拭,轻轻有序的放在超净工作台台面上,然后取75%酒精棉球擦手,将包裹在瓶口上的牛皮纸拿掉,将牛皮纸整理好并放入铁丝框内,解去种子斜面上扎纱布的绳子,准备接种。

2.3接种:在酒精灯火焰附近剥开10ml吸管外包裹的牛皮纸,取出吸管,在酒精灯火焰上用火稍微烧一下,插入液体瓶中,用洗耳球将菌液吸入吸管中,同时另一人在酒精灯火焰附近轻轻取出待接种的液体种瓶瓶盖,一人将种液5ml放入待接种的种瓶中,接种完毕后,另一人将接种好的纱布瓶盖现在酒精灯火焰上用火燎一下,然后盖上纱布瓶盖,用绳子扎好纱布。在接种下一只液体种瓶。

2.4结束:将接种好的斜面及其他用品放入铁丝框内,带出无菌室,关闭超净工作台,用消毒液擦拭超净工作台台面和无菌室地面、墙面,打开紫外灯照射20分钟。出无菌室时将所有物品带出无菌室,人出了无菌室后将无菌室及缓冲间的紫外灯打开半小时。

2.5培养:将接种完的液体种瓶放置到摇瓶机培养20小时左右,待液体种液颜色变黄后取出。

2.6并瓶:将培养好的摇瓶种液放入铁丝框拿进无菌室按接种的操作要将种液并入消毒过的无菌2000ml三角瓶中,放入冰箱备用,用过的种瓶拿出无菌室后先涂片镜检,将残留的种液合并后送化验检测PH/OD。

3、注意事项:○1液体种液接种量一定要足,要一致,否则培养时间会延长。○2培养好的液体种液要观察颜色和气味,发现异常及时处理掉。○3接种斜面要注意尽量不要括取斜面顶部的种子。○4拿去接种瓶要尽量拿去三角瓶下方,不得拿瓶口位置。○5放置到摇床上应用双手将三角瓶放好,开启摇床要逐步加快速度,以防将种液溅到瓶盖上造成污染。○6未接种完的斜面种子要处理掉,不得重复使用。

六、无菌样的制作

1、目的:检查制作的摇瓶种子及发酵过程中的无菌状况。

2、操作过程:

2.1进无菌室前准备工作:进无菌室前半小时,先打开无菌室超净工作台使之运行,然后将消毒过的需要使用的物品和未经接种的液体种瓶放入铁丝框,拿进缓冲间,最后依次打开超净工作台、无菌室、缓冲间的紫外灯。进无菌室应先关闭紫外灯,然后打开日光灯,进入缓冲间前应先用75%酒精棉球擦手和需要使用的无菌平板及其他器皿,然后将无菌样液体试管放进铁丝框中,一起带入缓冲间,先用消毒液洗手,然后更换无菌衣,然后将待检样和无菌平板一起带入无菌室,进入无菌间每道门应侧身迅速进入,并迅速关闭每道门。进入无菌室后动作要轻,先用消毒液洗手,关闭超净工作台上的紫外灯,打开台面日光灯,然后用消毒液擦拭超净工作台,然后将待检无菌样和无菌平板用消毒液擦拭,轻轻有序的放在超净工作台台面上,然后取75%酒精棉球擦手,用记号笔在无菌平板背面将平板划分区域做好标示。

2.3接种:在酒精灯火焰附近剥开接种环外包裹的牛皮纸,取出吸管,在酒精灯火焰上用火稍微烧一下接种环,在接种环冷却后将接种环插入待检测液体中沾取待检液体,松开平板上盖,将待检样在无菌平板标示区域内划线,更换待检样后重复上述操作,每个样在两个平板上划线。

2.4结束:将划好的平板及其他用品放入铁丝框内,带出无菌室,关闭超净工作台,用消毒液擦拭超净工作台台面和无菌室地面、墙面,打开紫外灯照射20分

钟。出无菌室时将所有物品带出无菌室,人出了无菌室后将无菌室及缓冲间的紫外灯打开半小时。

2.5培养:将划线平板倒置放入35-37o C培养箱中培养,8小时后,每2小时检查一次并做记录。

3、注意事项:○1平板培养24小时后及时处理掉。○2拿平板检查时不要将平板上盖来回滑动,以免造成失误。○3若检查过程中连续三个样都有杂菌可判定染菌,摇瓶中有杂菌即判定染菌,判定染菌后要及时通知发酵岗位做染菌处理。

七、灭菌

空消压力0.12Mpa,温度121-123o C,时间1小时,斜面培养基湿消压力0.12Mpa,温度121o C,时间10分钟,种子液体培养基湿消压力0.12Mpa,温度122o C,时间12分钟,无菌平板消毒压力0.12Mpa,温度121o C,时间15分钟,消毒过程中要注意消毒柜压力稳定,总蒸汽压力是否有变化以便随时调整。

八、显微镜涂片

先取一片在75%酒精溶液中浸泡的洁净载玻片,在酒精灯火焰上点燃,放在干净的滤纸上冷却,然后在去离子水中把接种环清洗一下,然后在酒精灯火焰上将接种环烧红,再待涂片培养及内冷却后挑取一环液体,在载玻片上由大到小涂环,再将涂布的培养基干燥固定,滴上一滴结晶紫溶液,用适量的自来水将结晶紫冲洗干净,在酒精灯火焰附近将载玻片上的水以低于40o C的温度下烘干,滴一滴香柏油放显微镜下作镜检。

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增,然后对扩增片段进行序列分析比对,快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析,以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种,分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中,约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA分子中,可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16S rDNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大,包含有丰富的细菌种属的特异性信息,所以对于绝大多数菌株来说,只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况,需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序,得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列,为了结果的可靠性,通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材 移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL);涡旋振荡器;Eppendorf MixMate;离心机;水浴锅;电泳仪;制冰机;低温冰箱;PCR仪:Veriti 96 Well Thermal

菌种管理规程

1. 目的 规范微生物学检定用菌种的管理,最大限度降低变异率,确保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2. 适用范围 适用于微生物实验用菌种管理,包括菌种的申购、传代、使用及销毁等。 3. 引用/参考文件 ChP2015 实用药品微生物检验检测技术指南 4. 职责 质量控制实验室负责菌种的申购、传代、使用、销毁等工作,QA负责监控和参与OOS调查。 5. 程序 5.1术语和定义 5.1.1 标准菌株 由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌。 5.1.2 传代菌株 用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种,用于传代及制备工作用菌种,3代后的传代菌株在需要时可以作为工作菌株使用。 5.1.3 工作菌株 用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。 5.1.4 菌种的代 将菌种接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 5.2 菌种来源 5.2.1 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(CMCC)或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌种。 5.2.2质量控制实验室涉及到的菌种种类、代码、保存方法及保存条件如下。

5.3.1菌种的申购 5.3.1.1 微生物室QC依据菌种的库存及菌种的使用情况,提出采购申请,申请需明确菌种的名称,标准编号以及申购数量等信息。 5.3.1.2 质量部经理对申购计划进行审批,审批后由公司的商务部按要求进行采购,采购过程执行《采购控制程序》。 5.3.1.3 菌种的采购需向法定的业务部门或者认可的机构采购。 5.3.1.4 购买菌种的同时应保留相关证明资料,说明菌种的名称、代数、数量等。 5.3.2 菌种的验收 5.3.2.1 微生物室QC负责对采购回的菌种以及相关的证明资料进行验收; 5.3.2.2 验收应包括菌种外包装的完好性、具体验收的依据为批准后的申购计划。 5.3.2.3 验收符合后签字确认并领回菌种,及时填写《菌种验收、入库记录》,并将菌种的相关证明资料贴在菌种接收登记表当页背面留存。如验收不符合则拒绝签字领用,商务部负责退货处理。 5.3.3 菌种的保存 5.3.3.1验收合格的冷冻干燥菌种,应保存在温度设定为-20℃冰箱中保存,有效期可至1年。 5.3.3.2 验收后的菌种需在验收合格接收后14天内完成转种。

标准菌种确认标准操作规程完整

一目的 建立标准菌种确认标准操作规程,以减少菌种污染和生长特性的改变,保证实验结果的可靠性和准确性。 二围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501] 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)64941] 黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104] 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后,即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1. 2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1. 2.2 工作菌株的传代次数应严格控制,不得超过 5 代(从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代),以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时,应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容

1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测:是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态:在特定的培养基上,将待检测培养物稀释涂布或平板划线,适宜培养后,同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似;对于两种或以上形态的出发菌株,应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养,检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征:对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性;细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验:各种微生物具有各自的独特的酶系统,因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同,这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征,利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物,在相应的培养基平板上划线分离单个菌落,并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一纯菌落,进行革兰氏染色、镜检,观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中,经35℃培养18~24h后,形成菌膜,管底有粘液状沉淀,培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上,35℃培养18~24h后,观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑、湿润,常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1. 2.1 革兰染色

02微生物实验室菌种管理规程

1、目的:规范微生物试验用菌种的管理,确保菌种的有效使用。 2、适用范围:微生物试验用菌种的管理。 3、责任者:质检科负责人、微生物试验人员、菌种管理人员 4、正文: 概念 a、标准菌株:由国内或国际菌种保藏机构保藏的,遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 b、标准储备菌株:由标准菌株经一次传代得到的培养物。 c、商业派生菌株:由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。 d、工作菌株:由标准储备菌株经传代得到的培养物。

e、代:将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养,并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式,新培养物对接种培养物而言就称为一代。 菌种的采购和接收 菌种的采购 从药检所或菌种保藏中心等外单位购入菌种斜面或冻干菌种。 根据工作需要对购买国内保藏中心提供的菌种斜面提前1个月填写采购申请单,冻干菌种提前2个月申请购买,国外保藏中心提供的菌种应提前3个月申请购买。 菌种的接收 检定菌应设专人保管,管理人员应接受过专业培训,有足够的菌种保存经验。 接收菌种时,应核实菌种的名称、编号、传代代数、数量、有效期等,并调查清楚菌种的保存条件和注意事项。 接收时应填写菌种接收登记表。内容包括:菌种名称、菌种保藏中心编号、传代次数、接收日期、菌种来源等。 对新购入的冻干菌种在使用前应按要求对其进行生物形态确证试验和纯度鉴定,由于新购买的菌种斜面已由菌种提供单位做过生物形态确证试验和纯度鉴定,所以传代5代以内的菌种斜面不需要进行纯度鉴定。 对新购入的斜面菌种应在2~8℃保存,并应在1周内转接。 菌种的复苏 使用人员根据需要应向菌种管理人员领取菌种,仔细核对标签上菌名、编号,并在《菌种接收及领用登记表》上记录菌名、数量、领用人、领用日期等信息。 菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用。 菌种复苏应在生物安全柜内操作。 常用菌种接种用培养基和培养条件表 菌种的传代 每株菌种应建立菌种使用及传代记录,斜面菌种应根据其特性决定传代时间间隔。

菌种的确认标准操作规程

1.目的 建立菌种确认标准操作规程,以减少菌种污染和生长特性的改变,保证实验结果的可靠性和准确性。 2.依据 《中国药典》2010版二部 3.范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 4.责任 质量管理部,质量控制实验室 5.内容 5.1试验菌株 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501] 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001] 黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 5.1.1标准菌株 5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后,即为标准储备菌株。 5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2工作菌株 5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制,不得超过5 代(从菌种收藏机构获得的标准菌

株为第0代),以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时,应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2菌种确认试验的主要内容 5.2.1菌种的纯度确认 5.2.1.1纯度检测:是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2试验内容 ①菌落形态:在特定的培养基上,将待检测培养物稀释涂布或平板划线,适宜培养后,同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似;对于两种或以上形态的出发菌株,应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养,检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征:对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性;细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2菌种的特性确认 5.2.2.1生化试验:各种微生物具有各自的独特的酶系统,因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同,这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征,利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物,在相应的培养基平板上划线分离单个菌落,并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一纯菌落,进行革兰氏染色、镜检,观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1大肠埃希菌的确认 5.3.1.1菌落形态 5.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中,经35℃培养18~24h后,形成菌膜,管底有粘液状沉淀,培养物有粪臭味。 5.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上,35℃培养18~24h后,观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑、湿润,常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润。

菌种抗生素的抗性检查标准操作规程

菌种抗生素的抗性检查标准操作规程 依据:《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围:适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的:验证该菌种的抗生素抗性是否与原始菌株相符。 原理:该菌种所携带的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因,在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上能够生长。 责任:检定人员。 内容: 1 材料 1.1 材料 1.1.1 菌种:PBV 888/DH 5α ,来源于主种子批或工作种子批。 1.1.2 注射用水:符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1.1.3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 OXOID 蛋白胨 OXOID 氨苄青霉素 C 16H 19 N 3 O 4 S 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1.1.4 器皿 三角烧瓶(1L)、量筒(500ml、1000ml)、烧杯(500ml)、平皿、盐水瓶(250ml、500ml、1000ml)。 1.1.5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯、脱脂棉。 1.2 设备 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 扭力天平TN-100B 上海第二天平厂

2 方法 2.1 准备工作 2.1.1 生产环境:在十万级洁净间中进行。场地摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。 2.1.2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经本室洗刷组处理后,用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好,用线绳系紧,送高压灭菌(121.3℃,60分钟)。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好,121.3℃60分钟高压灭菌。 2.1.3.1 确认扭力天平运行状态良好,已挂有“备用”标志牌。 2.1.3.2 确认恒温培养箱运行状态良好,已挂有“运行”标志牌。 2.1.3.3确认生物安全台运行状态良好,已挂有“备用”标志牌。 2.1.4 配液 2.1.4.1 LB琼脂培养基的配制(500ml) 摘下扭力天平“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。用扭力天平准确称取酵母粉2.5克,蛋白胨5克,NaCl 5克,琼脂粉10克,倒入500ml烧杯中,加入400ml 注射用水,用玻棒搅匀溶解,定容至500ml,混匀,倒入1L三角瓶中,分别用二层硫酸纸和一层牛皮纸包瓶口,用线绳系紧,115.6℃,30分钟高压灭菌。贴上标签,标明液体名称、批号、配制日期,备用。 2.1.4.2 75%酒精1000ml 用量筒量取750ml无水乙醇,加入250ml无菌注射用水,置1000ml盐水瓶中,摇匀,标明液体名称、批号、浓度、日期,室温备用。 2.1.5 LB琼脂平板培养基的制作 摘下生物安全台“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌,用75%酒精棉擦拭台内,接通电源。打开电机,无菌风吹30分钟,待已灭菌LB琼脂培养基500ml冷却到50℃左右,加入25mg氨苄青霉素,轻轻摇匀,倒平板,每皿20-30ml,待培养基冷却后,贴上标签,并注明名称、批号、配制日期,置37℃孵箱中孵育,判定合格后置于4℃冰箱中保存,待用。 2.3 操作步骤 2.3.1 在生物安全台中,将接种环用火焰灭菌并冷却后,用接种环取一环菌

标准菌种管理规程

标准菌种管理规程 目的:规范药品微生物学检定用菌的管理,最大限度降低变异率,确 保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责: QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发,微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围:本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容: 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种,用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后,作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发一次即 称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准: 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要),提出购 买计划,交由质量管理部部长审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省(市)药检所购

买传代用菌种,购买时,需询问与确定菌种的代数,以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种,检查其名称和数量,以及 每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《检定菌接收记录》(附表 1)上,内容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种 的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上,待菌生长充分以后,转移至2~8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同, 细菌: 1 个月;酵母菌: 2 个月;霉菌及芽胞: 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1.甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10 号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度 20%),

标准菌株使用标准操作规程

标准菌株使用标准 操作规程

标准菌株使用标准操作规程 1 检验目的 对实验室的标准菌株进行合理的保存,并规范合理的使用流程,保证菌株的性能稳定可靠。 2 范围 微生物实验室保存的标准菌株。 3 职责 微生物组工作人员正确执行本操作规程。 4 术语和定义 4.1标准菌株 其特征进行了分类和描述,有明确的来源。ATCC(American Type Culture Collection)美国标准菌株收藏中心。 4.2标准储备菌株 标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。 4.3 工作菌株 标准储备菌株传代后得到的同种菌株。 4.4 标准培养物 标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。 4.5质控菌株 ATCC最佳,但当无法获得时能够使用ATCC演化的菌株或中国国家菌种库储存的标准菌株。特殊情况,例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌

株。室间质评的菌株即可。 5 保存程序 5.1标准菌株 5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉,-80℃低温保存,能够2年以上。安瓿真空包装的,-80℃可长期稳定保存。将标准菌株进行编号和登记。 5.1.2复苏 用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。根据菌种的生长特点,接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。酵母菌要求3天,形成孢子的微生物宜保存孢子。 5.2标准储备菌株 5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。复苏后的标准菌株要检查其纯度,必要时进行生化试验检查。刮取培养物上的菌体,用足量的菌悬浮于防冻培养基中。防冻液能够是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。储存足够量的标准储备菌株,可用1-2年。一年52周需要52支以上。 5.2.2甘油肉汤保存法 成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。相当于20%的甘油。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。保存期限1-5年。 5.2.3全血保存法 成分为脱纤维羊血。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。保存期限1-5年。

BJ-SOP-WJ013-A1菌种保存、传代、使 用、销毁标准操作规程

菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程,规范微生物学检定用菌种的管理,最大限度降低变异率,确保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏 管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定 保存的菌种,用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面 培养后,作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发 一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况,提出年度购买计划(包括临时检验需要),填写申购流程,经审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌株)或传代用菌种,购买时,需确定菌种的代数,以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后,由部门主管接收菌种,检查其名称和数量,以及每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《标准菌株库存记录》上,内容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,并将其暂贮存于4~8℃冰箱中,在一周内必须完成转种。

5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上,待菌生长充分以后,转移至4~8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同,细菌:每个月转种一次;酵母菌及芽胞:3~6个月转种一次;丝状真菌每年转种一次。 5.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 5.3.2.1甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度20%),即为10%甘油菌悬液,轻轻振摇,使内容物充分混合,分装于无菌小试管,在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代(G2)。可以每隔2年转种一代。使用时,取出一支放至室温,转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏,挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏(如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌)。 5.3.2.2液体石蜡保存法 5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备:选用优质化学纯液体石蜡,将液体石蜡分装加塞,用牛皮纸包好,在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分,经无菌检查后备用。 5.3.2.2.2液体石蜡管的制备:将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中,在适宜条件下培养结束后,在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内,并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝,并将试管直立,置于-20℃冷冻或2~8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存(如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等)。 5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限,见下表1 表1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限

标准菌种确认标准操作规程范文

标准菌种确认标准操作规程 一目的 建立标准菌种确认标准操作规程,以减少菌种污染和生长特性的改变,保证实验结果的可靠性和准确性。 二范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三内容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌(Escherichia coli )[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B)26003] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501] 白色念珠菌(Candida albicans ) [CMCC(F)64941] 黑曲霉(Aspergillus niger ) [CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) [CMCC(B)10104] 生抱梭菌 (Clostridium sporogenes ) [CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。

1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后,即为标准储备菌 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.121 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.122 工作菌株的传代次数应严格控制,不得超过5代(从菌种收藏 机构获得的标准菌株为第0代),以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时,应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要内容 1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测:是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验内容 ①菌落形态:在特定的培养基上,将待检测培养物稀释涂布或平板划线,适 宜培养后,同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似;对于两种或以上形态的出发菌株,应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布 培养,检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征:对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性;细胞形状、大小、荚膜、芽抱等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验:各种微生物具有各自的独特的酶系统,因而在代谢过 程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同,这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征,利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的

菌种生化反应检查标准操作规程

菌种生化反应检查标准操作规程 依据:《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围:适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的:通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。 原理:枸椽酸盐利用试验原理:枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源(铵盐)和唯一碳源(枸椽酸钠)一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源,但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源,因此可否利用该盐,能将不同细菌鉴别。 吲哚试验原理:有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚,吲哚本身没有颜色,不能直接观察,所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂,使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。 甲基红试验原理:大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇,故培养物中形成酸类较少,使酸碱度PH可在5.4以上,因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色,是为甲基红试验阴性,而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸,产生酸类较多,使培养物的酸碱度在PH4.5或更低,故甲基红指示剂呈红色,是为甲基红试验阳性。 V-P试验原理:测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇,产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇,在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰,后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用,生成红色化合物,称为U-P试验阳性。 内容: 1 材料、设备 1.1 材料: 1.1.1 菌种:PBV 888/DH 5α ,来源于主种子批或工作种子批。 1.1.2注射用水:符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1.1.3 试剂 蛋白胨 氯化钠 NaCl 分析纯 葡萄糖 C 6H 12 O 6 分析纯 溴麝香草酚兰 C 27H 28 Br 2 O 5 S 分析纯 对二甲基氨基苯甲醛 C 9H 11 NO 分析纯 戊醇 C 5H 15 O 分析纯 浓盐酸 HCl 分析纯 甲基红 C 15H 15 N 3 O 2 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯α-萘酚 C10H7OH 分析纯 硫酸镁 MgSO 4?7H 2 O分析纯 磷酸氢二钾 K 2HPO 4 分析纯 磷酸二氢铵 NH 4H 2 PO 4 分析纯 枸椽酸钠 C 6H 5 Na 3 O 7 ·2H 2 O 分析纯 琼脂粉分析纯 1.2 器皿 盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒(100ml、500ml、1000ml)、吸管(10ml)、试剂瓶(250ml、500ml)。 1.3 仪器、设备 PH计 PHC-3C型上海大中分析仪器厂 电子秤 ES-200A型沈阳腾龙电子仪器公司 电子天平 ACS 太原 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 水浴箱 6 Liter LKB 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 1.4 其它材料 硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球(1ml及10ml)玻棒、接种环、透气栓。

标准菌种管理规程

标准菌种管理规程目的:规范药品微生物学检定用菌的管理,最大限度降低变异率,确保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责:QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发,微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围:本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 内容: 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种,用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准: 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要),提出购买计划,交由质量管理部部长审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省(市)药检所购

买传代用菌种,购买时,需询问与确定菌种的代数,以便传代时控制代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种,检查其名称和数量,以及每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《检定菌接收记录》(附表1)上,内容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上,待菌生长充分以后,转移至2~ 8C冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同,细菌:1个月;酵母菌:2个月;霉菌及芽胞:3个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1.甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10 号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度

不同生物安全级别微生物菌种操作规程复习课程

不同生物安全级别微生物菌种操作规程 国家自然科技资源平台 不同生物安全级别微生物菌种操作规程(试行) 《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》 项目组 二〇〇四年十二月十日 目次 前言 (2) 引言 (3) 1 范围 (4) 2 规范性引用文件 (4) 3 术语、定义、符号、缩写语 (4) 4 确定微生物的危害等级时必须考虑的因素 (6) 4.1 微生物本身的致病特征 (6)

4.2 其它因素 (6) 5. 微生物实验室生物安全防护的基本原则 (6) 6. 不同生物安全级别微生物菌种操作规程 (6) 6.1 生物安全等级Ⅰ级微生物菌种操作规程 (6) 6.1.2 实验室设计和建造的特殊要求 (7) 6.2 生物安全等级Ⅱ级微生物菌种操作规程 (7) 6.2.2 特殊要求 (8) 6.3 生物安全等级Ⅲ级微生物菌种操作规程 (9) 6.4 生物安全等级Ⅳ级微生物菌种操作规程 (10) 前言 本规程由自然科技资源平台建设项目提出。 本规程起草单位:中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。 本规程主要起草人:叶强、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、张月琴、陈敏、程池等。

引言 微生物可根据其自身或其所产生的毒素的危害程度分为四个不同的生物安全等级。对健康成年人(动物)已知无致病作用的微生物的生物安全级别为一级;对人(动物)或环境具有中等潜在危害的微生物的生物安全级别为二级;主要通过呼吸途径使人(动物)传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物(通常已有预防传染的疫苗)的生物安全级别为三级;对人体(动物)具有高度的危险性,通过气溶胶途径传播或传播途径不明,目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物的生物安全级别为四级。 不同生物安全级别微生物菌种的操作,如分离、培养、鉴定和保藏,应在相应生物安全防护的条件下进行。本规范根据当前国家自然科技资源平台建设的总体要求,结合微生物菌种资源的特点制定,便于在微生物菌种资源的收集、保存、鉴定、评价、研究和利用过程中,尽量避免环境和人员受到微生物本身及其代谢产物的危害,实现菌种资源的高效共享和可持续利用。 不同生物安全级别微生物菌种操作规程 1 范围 本规程规定了微生物生物安全分类标准,以及不同生物安全级别防护级别进行微生物的操作规程。 本规程适用于各菌种保藏单位所保藏的菌种资源的操作,如分离、培养、鉴定和保藏。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改(不包括勘误内容)或修订版均不适用于本规范,然而,鼓励根据本规范达成的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本规范。 《病原微生物实验室生物安全管理条例》(国务院第424条令) 《兽医实验室生物安全管理规范》(2003年农业部302号公告) WS233-2002 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 OIE 2003 国际动物卫生法典 WHO《实验室生物安全手册》第二版

菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程

菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程

菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程 依据:《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围:适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的:检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致,并检查是否染有杂菌。原理:将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养,以检查菌落形态以及是否染有杂菌。 内容: 1 材料 1.1 材料 1.1.1 菌种:PBV 888/DH 5α ,来源于主种子批或工作种子批。 1.1.2 注射用水:符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1.1.3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 蛋白胨 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1.1.4 器皿 平皿、三角烧瓶(3L)、量筒(1L)、玻棒、试剂瓶。1.1.5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。 1.2 仪器设备 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂 2 方法

2.1 准备工作 2.1.1 生产环境:在十万级洁净间进行。场地摘下“清场合格”标志牌,挂“使用中”标志牌。 2.1.2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经洗刷组处理完毕后,用硫酸纸及牛皮纸包好,用线绳系紧,送高压灭菌(121.3℃60分钟)。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好,高压灭菌121.3℃60分钟。 2.1.3 调试仪器设备 2.1.3.1确认扭力天平运行状态良好,已挂有“备用”标志牌。 2.1.3.2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。 2.1.3.3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。 2.2 溶液的配制 2.2.1 LB琼脂培养基的配制1000ml 摘下扭力天平“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。用扭力天平称取酵母粉5克,蛋白胨10克,NaCl 10克,琼脂粉20克,倒入三角烧瓶中,加注射用水1000ml,用玻棒搅匀,分别用硫酸纸、牛皮纸包口,用线绳扎紧,标明名称、配制时间, 115.6℃30分高压灭菌。 2.2.2 75%酒精溶液1000ml 取750ml无水乙醇,加注射用水定容1000ml,混匀,装入试剂瓶中,贴标签,标明液体名称、浓度、配制日期,室温备用。 2.3操作步骤 2.3.1 摘下生物安全台“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内,接通电源,打开风机,无菌风吹30分钟,待已灭菌LB琼脂培养基冷却至50℃左右,倒平板,每皿20-30ml,待凝固后,放入恒温培养箱中,37℃倒置培养24小时,如无杂菌生长,即可继续实验用。 2.3.2 划线分离:用接种环(经火焰灭菌,冷却后)取1环菌种于LB平板上划线分离。 2.3.3 将划线分离的平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。 2.3.4操作结束后,场地摘下“使用中”标志牌,挂上“待处理”标志牌。 3 结果判定 3.1判定标准:菌落形态如为圆形,湿润、光滑,中等大小(直径约2-3mm),即为典型大肠杆菌菌落。

标准菌种管理规程

标准菌种管理规程 目的:规药品微生物学检定用菌的管理,最大限度降低变异率,确保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责:QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发,微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 围:本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 容: 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种,用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基,每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 2.标准: 2.1检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要),提出购买计划,交由质量管理部部长审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省(市)药

检所购买传代用菌种,购买时,需询问与确定菌种的代数,以便传代时控制代数。 2.2检定菌的接收 菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种,检查其名称和数量,以及每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《检定菌接收记录》(附表1)上,容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌生长充分以后,转移至2~8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同,细菌:1个月;酵母菌:2个月;霉菌及芽胞:3个月。 2.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1.甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度20%),

菌种传代标准操作规程

目的:保证微生物检定试验的正常进行。 范围:适用于本公司产品检验中需用的检定用菌种。 责任:质量检验科、菌检室。 内容 1原则 1.1检定用标准菌种。按规定使用由福州市检验所提供的菌种。 1.2应按现行版中国药典附录,传代和制备。 2.菌种的传代 2.1准备需用的培养基,标记上菌名及接种日期。 2.2接种前用1:1000新洁尔灭擦拭工作台面并用紫外光灯照射30分钟以上进行灭菌。 2.3自冰箱取出菌种斜面,应在室温放置20分钟,待其至室温。 2.4进入缓冲间换鞋、戴帽和口罩,用1:1000新洁尔灭洗手,并将培养基及菌种移入接种室。 2.5点燃酒精灯,将菌种斜面的硅胶囊塞通过火焰转动使其松动,以免接种时粘住打不开。酒精灯应放在铺有1:1000新洁尔灭布的糖瓷方盘内,接种操作应在盘上进行,以防止细菌洒出,避免污染。 2.6接种操作,左手握住菌种斜面,将管口靠近火焰旁,右手持接种棒后端,将白金耳烧红约3-6分钟,随后将全部白金丝及金属棒部份在火焰上烧灼,往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住硅胶囊,左手将管口在火焰上旋转烧灼,右手再轻轻拨开硅胶囊,夹在无名指、小指及掌部间并勿使其与任何物品接触,用右手的拇指、食指、中指操作接种棒,将白金耳伸入菌种管内,先在近管壁的琼脂表面靠一下,以稍冷却,再移至菌苔上刮取少量菌苔随即取出接种棒,并使菌种试管口在火焰旁将塞堵上,然后取培养基斜面,照上法在火焰旁打开塞,将白金耳伸入管内至规定的培养基斜面的底部,由底向上,将白金耳轻贴斜面的表面曲折移动,使细菌划在斜面的表面上,注意只划动一次,切勿重复划动。 2.7取出接种棒,在火焰旁将培养基管的塞堵上,然后将接种过细菌的白金耳在火焰上烧灼灭菌,注意烧灼时,先将白金耳离粘有细菌端的白金丝烧灼至红,使其传热至白金耳,使白金耳上残留的苔烧枯焦,炭化后,才将白金耳移至火焰中直接强热烧灼至红约30分钟。2.8接种完毕后,将菌种及已接种的培养基置于试管架的同一排上,排列整齐,便于操作完毕后进行核对。 3.注意事项 3.1无芽孢的菌种可每月移种一次。 3.2每周必须检查保藏菌种的冰箱的温度、湿度、一次检查菌种管的塞是否松动,如有异常应及时处理。 3.3每次移植培养后,应与原种的编号、名称逐一核对,检查培养特征无误时,在继续保藏。 3.4凡用琼脂斜面保藏菌种时,须用连续三代的培养物对照检查。 3.5保藏细菌的培养基应无糖,其他菌类含糖应≤2%为宜,以免产酸过多,影响菌种保藏。

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