单分子测序助力医学研究

单分子测序助力脆性X综合征的研究[创新技巧] 美国加州大学戴维斯分校（UC Davis）医学院及Pacific Biosciences 公司的研究人员利用单分子实时测序技术，对脆性X综合征的关键基因FMR1中的CGG片段扩增进行了测序。他们在第15届脆性X 和早发性认知缺损国际研讨会上公布了他们的研究成果。

脆性X综合征（又称Martin-Bell综合征）是一种遗传性综合征。它导致一系列特征性症状，包括生理、智力、情绪、以及行为上的异常。症状的轻重各有不同。该疾病伴随着X染色体上一段三核苷酸序列（CGG）的扩增。这种扩增导致了一种称为FMR1的蛋白质无法在病人体内表达，而该蛋白质是神经正常发育所必需的。

脆性X智力低下（FMR1）基因位于X染色体上，其5’非翻译区（5’UTR）包含了CGG三核苷酸的重复序列。大部分人的CGG 片段重复5-44次。CGG片段的扩增与认知力和生殖功能受损相关。如果一个人含有45-54个重复序列，则被认为是“灰色地带”，而55-200个重复序列被称为前突变，200个以上重复序列则被称为全突变。生物通https://www.360docs.net/doc/9211219569.html,

中度CGG重复序列扩增（55-200个CGG重复）可导致脆性X相关性震颤/共济失调综合征（FXTAS），一种以意向性震颤、步态共济失调和其他症状为特征的迟发性神经变性疾病1。而高度CGG重复序列扩增（>200个CGG重复）可引起转录沉默和FMR1编码蛋白（FMRP）的功能丧失，从而导致脆性X染色体综合征1。

由于目前的测序方法都依赖于大量相同拷贝的读取，因而大量扩增的CGG重复（>100）只能生成不连贯的信号（图1）。这阻碍了研究人员获得单碱基分辨率的测序数据。

图1：随着重复扩增数量的增多，生成大量相同的拷贝变得越来越困难。这阻碍了对大部分疾病范围(>100次重复)内重复扩增序列的准确测序。

于是，研究人员利用Pacific Biosciences公司的单分子实时（SMRT）测序技术，试图从大量扩增的CGG重复序列中产生高质量的测序数据（图2）。他们首先利用PCR从人类基因组DNA中扩增出带不同CGG重复的FMR1序列，制备出待测文库。随后加上发夹测序接头，生成闭合的环状测序模板。之后利用Pacific Biosciences RS对样品进行测序。最后采用BLASR算法将长读取装配成环状共有序列（CCS），而目标序列的覆盖度至少为3倍。

结果表明，环状共有序列的读取产生了生理相关范围的重复扩增。而对长的重复等位基因的测序能力似乎仅受读长限制。原始读长超过10 kb，使得环状共有序列覆盖了超过750个CGG重复片段。

图3：一段CGG重复片段范围内的环状共有序列读取图。接近155个重复的峰是SMRT cell被动上样偏向（passive loading bias）与较小插入片段优势的综合结果。示例：环状共有序列读取包含372个CGG 重复。

研究人员认为，通过这种方法，如今能够以单碱基分辨率完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于疾病的准确诊断。

参考文献

1. Oostra, B.A. and R. Willemsen, FMR1: a gene with three faces. Biochim Biophys Acta, 2009. 1790(6): p. 467-77.

2. Eid, J., et al., Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.

Cell：单分子测序揭示惊人的基因组重排科学家们发现，生活在池塘里的单细胞生物Oxytricha trifallax有一种非凡的能力，它们能在交配时将DNA打碎并快速重排这些片段。这项研究发表在上一期的Cell杂志上。

Oxytricha的基因重排是一个非常精密的过程，“这是大自然早期一种的复杂化尝试，”文章的资深作者，Princeton 大学教授Laura Landweber说。

从实用性的角度看，人们可以将Oxytricha当成模式生物，研究高等动物的染色体重排。在癌症早期，染色体会经历混乱的重排事件，而Oxytricha可以一步步地展现这一过程。

这项研究中的Oxytricha基因组是通过PacBio单分子测序完成的，Pacific Biosciences公司开发的这一技术可以实现超长的测序读取。

Landweber介绍道，Oxytricha与其它微生物截然不同，Oxytricha 细胞大约是人类细胞的十倍大，而且拥有两个细胞核。体细胞核含有5%的遗传信息，有转录活性，负责调节细胞的内部活动。而生殖系细胞核保存着要传递给下一代的全部遗传信息，没有转录活性。研究显示，Oxytricha在发育过程中，能通过大规模的程序化DNA重排，将生殖系细胞核转变为体细胞核。

事实上，Oxytricha交配只是为了交换DNA。在营养充足的时候，Oxytricha主要采取无性繁殖，不断地有新细胞出芽。在营养匮乏的时候，两个Oxytricha发生融合并分享遗传信息（交配），拆散并重排

生殖系细胞核的基因和DNA，共同构建拥有一套新染色体的体细胞核。这一过程能让Oxytricha焕发青春活力，也提高了遗传物质的多样性，Landweber说。

在Oxytricha的交配过程中，生殖系细胞核选出大约225,000个小DNA片段，来构建新染色体。Landweber实验室之前的工作表明（2012年的一篇Cell文章和2008年的一篇Nature文章），上一代Oxytricha的数百万非编码RNA引导着上述过程，它们以正确的顺序标记和分选DNA片段。

此外，Oxytricha庞大的基因组也令人印象深刻，Landweber说。2013年她的团队发现，这种生物的体细胞核含有大约16,000染色体，这些染色体大多只含有一个基因。

Oxytricha的独特遗传学机制为DNA提供了很好的保护，有利于将强健的遗传物质传递下去。正因如此，这种生物才能够广泛分布在世界各地。

推荐原文：

The Architecture of a Scrambled Genome Reveals Massive Levels of Genomic Rearrangement during Development

Pacbio RS II 测序平台

一，原理

1. 用4种荧光分别标记4种dNTP

2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔，特定的孔径保证了入射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物

3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部

4. 让DNA链与酶结合，进行测序

5. 测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成复合物，短暂结合

6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧光被检测到

7. 酶反应过程，一方面使链延伸，同时使dNTP上的荧光基团脱落

8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行

二，优点：

1. 测长很长，主力的测长可以达到8kb，见下图

2. 可以直接测出碱基修饰，当聚合酶遇到模板上甲基化的A、C 等碱基时，聚合的速度明显变慢，并且光谱特征发生改变。这使直接

测甲基化变得很容易，见下图：

3. 对GC含量的偏向性小，可以轻松读到高GC的区段，下图中的紫色曲线就是PacBio的覆盖度。从本质上说，是因为建库中没有PCR过程，所以也就没有因为PCR而引入的GC bias

4. 测序速度快，上机时，1秒钟测3个碱基。3个小时可以完成一个run。上机前的建库，1天完成，与Illumina或Ion Torrent的建库时间基本持平。所以，整体上，1天建库，1天上机，1天数据分析，3天可以走完一个完整流程

三，应用：

1，动植物复杂基因组测序

(1)杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分水产类和昆虫等；

(2)高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木；

(3)超大基因组：基因组大小大于3G，甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分林木；

(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。

2，真菌基因组完成图

(1) 适用于所有真菌菌株；

(2) 尤其适合超高GC/超低GC真菌;

(3) 其它用传统方法测序比较困难真菌；

(4) 真菌基因组草图或精细图补洞。

3，细菌基因组完成图

(1) 普通细菌快速完成图构建；

(2) 尤其适合超高GC/超低GC细菌;

(3) 其它用传统方法测序比较困难细菌菌株

通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。

4，BAC克隆完成图

通过PacBio RS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。再加大测序深度，PacBio序列可以产生非常均一覆盖度，在大部

分目标区域内，可以接近100%的覆盖度。

这种方式对于有超高GC含量、超低碱基复杂度等BAC克隆非常具有优势。根据PacBio公司提供的Poster,由1Pacific Biosciences 公司和University of Washington, Seattle对人类基因组一个约1.6Mb 的片段，总共8个BAC克隆进行了PacBio测序，对比了Illmina测序，总体上得到了非常好的效果。

5，从头组装（DE Novo Assembly）

PacBio RS平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型的微生物测序平台。该平台可以用PacBio数据独立完成微生物基因组的完整拼接，也可以将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。

6，甲基化检定

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶【1】。

【1】参考资料：

https://www.360docs.net/doc/9211219569.html,/templates/second/index.aspx?nodeid=293

第三代测序技术的三种技术平台介绍

第三代测序技术的三种技术平台介绍随着生物学的发展，人们对基因的功能研究更加透彻，为了进一步研究和改造基因的目的需要详细了解生物的基因组全序列，因为DNA序列是改造基因的基础，这就要求具有高效的DNA测序技术。DNA测序技术到目前为止已经发展到了第三代测序技术。最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。目前，第三代测序主要有三种技术平台。两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时(SMRT)技术。第三种Oxford Nanopore的纳米孔(nanopore)测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。最近，Oxford Nanopore T echnologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧(下图)。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。

单细胞测序技术

单细胞测序技术单细胞测序技术是一种能够在单细胞水平上对基因组或转录组进行高通量测序和分析的新技术。与传统的高通量测序相比，单细胞测序不仅可以分析相同表型细胞的异质性，还可以获得难培养微生物和有价值的临床样本的遗传信息，具有广阔的应用前景。细胞是生命的单位。目前，基因检测主要是从组织中提取DNA进行测序。实验结果通常是细胞群体中信号的平均表达，是细胞群体的整体表征，或仅代表在数量上占优势的细胞信息。单个细胞的独特细胞特征往往被忽略。大量研究发现，在同一器官或组织中，同一类型的细胞也表现出明显的异质性，而且每个细胞都有自己独特的表达模式。例如，实体肿瘤样本中超过一半的RNA来自非癌细胞(成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等)，这使得癌细胞的信号被隐藏。因此，不可能使用单个单元来表示关键信息。另一方面，传统高通量测序方法，难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域[1]。随着细胞分选和测序技术进步，单细胞测序技术应运而生。（一）单细胞测序技术颇受关注《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。《Science》杂志将单细胞测序列

为年度最值得关注的六大领域榜首。（二）单细胞测序技术流程 1. 单细胞分离针对单个细胞研究时，首先将单个细胞进行分离，并确保其生物完整性不被破坏。目前常用的单细胞分离方法有连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊子技术、荧光激活细胞分选术和微流控技术等。 2. 细胞溶解与基因组获取对细胞进行溶解来获取基因组（DNA或RNA），这步骤非常关键，应尽量保证基因组的完整性。目前细胞溶解的方法可以分为3大类: 物理法、化学法和生物酶降解法。 3. 全基因组扩增由于单个细胞中的基因含量无法达到测序仪的检测线，因此需要对基因组进行扩增，目前方法都是利用DNA 聚合酶和不同形式的引物来进行扩增的，包括特异性的、简并的或杂合的引物。 4.测序与数据分析对单个细胞进行测序，并对所得的数据结果进行分析。二单细胞测序技术应用现状单细胞测序技术能够快速确定成千上万个细胞的精确基因表

单细胞测序

单细胞测序-I 单细胞测序（single cell sequencing）被《自然-方法》（nature method）杂志评为了2013年度生物技术。2017年10月美国政府启动了以单细胞测序为基础的“人类细胞图谱计划”，这是可以与“人类基因组计划”相媲美的又一个伟大工程。要了解单细胞测序，我们首先需要了解下何为测序？ “单细胞测序技术”是基于“第二代测序技术” 上世纪70年代末，Sanger发明了双脱氧链终止法也叫做Sanger测序法，Sanger测序法为基础的DNA测序技术我们把他称作“第一代测序技术”。“人类基因组计划”就是基于“第一代测序技术”完成的，共花费了30亿美元和耗时15年的时间。“第一代测序技术”成本高和低通量的问题，逐渐满足不了生命科学领域发展的需求。经过不断的技术开发和改进，以Illumina公司为代表的“第二代测序技术”大大降低了测序的成本并且大幅度提高了测序通量，所以也被称作“高通量测序技术”。过去10几年“第二代测序技术”得到了快速发展，甚至突破“摩尔定律”的发展规律，如今完成一个人类的全基因组价格只需要1000美元和几个工作日。随着“第二代测序技术”的迅猛发展，使得对于每个细胞单独测序成为了可能。正是“第一代测序技术”的技术革命完成了“人类基因组计划”，同样的“第二代测序技术”掀起的技术革命正在推动着“人类细胞图谱计划”的进行。当我们了解了“单细胞测序”就是以“二代测序技术”为基础的测序技术，那么下一步就需要了解下什么是细胞？为什么我们要进行单细胞测序？人体的每个细胞都是独一无二的细胞是人体结构和功能的基本单位，每个人大约有40亿-60亿个独立的细胞。如果把一个人体全部细胞比作地球上的所有人类的话，那么我们的细胞就像地球上每个独立的个人，正如地球上的每个人都是独一无二的，人体的每个细胞也是独一无二的。人类生命最初只有一个受精卵细胞，从胚胎发育到个体成熟，人体内的细胞数量增加的同时，细胞与细胞间的差异也越来越大，即使来自同一个组织的细胞，最终有的分化成了神经元而有的细胞则变成了神经胶质细胞。单细胞测序技术就是通过测序技术获得不同细胞间的遗传信息，从基因遗传水平解开细胞与细胞间的遗传信息异质性问题。根据上面的对介绍，我们可以对“单细胞测序技术”下一个定义：单细胞测序技术是通过“第二代测序技术”对每个单独的细胞进行测序，获取每个独立细胞的遗传信息。

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

单细胞测序技术概览

单细胞测序技术概览 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言 2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。 1. 单细胞测序技术简介本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplification technology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonal mutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被―稀释‖或平均掉的转录特征。

1.1 选择恰当的细胞说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用毛细管（microcapillary）可以直接吸取细胞内容物，但是这项操作也需要耗费大量人力。很多组织解离之后都能够制成单细胞悬液，这种单细胞悬液很容易操作，而且可以用细胞分选器（cellsorter），根据细胞表面表达的特异性分子标志物对细胞进行分类富集操作。这种策略也被用来分离非常微量的循环肿瘤细胞。 1.2 单细胞转录组策略现在有很多单细胞RNA测序操作流程可供选择，不过不管采用何种策略，首先都需要通过逆转录反应，利用RNA合成出cDNA。然后才会有所区别，比如有一些方法是对整个转录子进行测序，有一些方法只针对转录子的5'和3'端进行测序。不论采用何种方法，目的都只有一个，那就是捕获原始的RNA分子，然后均一的、准确地对其进行扩增。核酸的捕获效率主要受到逆转录反应的影响，不过我们可以使用更小的反应体系，选择更好的逆转录酶来进行改善。另外，采用模板转换技术（template switching）也能够保证被捕获的绝大部分转录子都是全长片段。减少反应循环数也能够改善核酸扩增反应，还可以借助―抑制PCR （suppression PCR）‖技术减少引物扩增，或者将取自不同样品的cDNA（这些cDNA都是分别做好标记的）混合到一起，提高起始反应模板浓度，用体外转录技术进行线性扩增（linear amplification）。另外，还可以利用特有的分子识别序列（molecular identifier sequences）对每一个RNA分子进行标记，这样即便在经历了非均一的扩增之后，我们还是能够对原始的RNA分子数量进行绝对定量。 1.3 单细胞基因组策略全基因组扩增（whol e-genome amplification）的起始反应产物更少，只有一个DNA分子。这样在扩增反应时就难免出现不均一的问题，即可能在基因组中某些位点会扩增多次，而另外一些位点则无法扩增。解决这个问题最常用的办法就是多重置换扩增技术（multiple displacement amplification, MDA），即使用随机引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用一种特定的聚合酶，这种聚合酶能够置换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构（iterative branching structure），扩增出大段的DNA。早期循环对整个扩增反应的均一性起到了决定性作用。有一种扩增技术采用了一种独特的引物，这样能够生成闭合环状的扩增子（amplicon），而且这种扩增产物不会再进一步复制，等于是在进行PCR扩增反应之前先进行几轮线性扩增反应。将反应按比例扩大，同时对反应情况进行实时监控都有助于改善基因组扩增成功率低的问题，另外减少扩增次数，准备更少模板的测序文库也是一个比较值得发展的方向。

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

一、二、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa

technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析第三代测序技术-高通量、单分子测序被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience的SMRT技术和 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量低成本长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板

单细胞测序技术

单细胞测序技术：单细胞测序技术自2009年问世，2013年被Nature Methods 评为年度技术以来，越来越多地被应用在科研领域。 2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。单细胞在许多领域都占有一席之地，对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义。 1 为什么要做单细胞测序？初次听说单细胞测序技术，单细胞测序又是什么噱头？如果单细胞测序就能测一个细胞或几个细胞的话，这有什么意义？特别是对异质性高的肿瘤组织来讲，测一个细胞能代表什么？无论是蠕虫，蓝鲸，还是人类，自然界所有的多细胞生命都是从单个细胞发育而来开始。这样一个单细胞，鬼斧神工地构建出有机生命体所需的各种组织、器官、系统。每个新细胞在正确的时间，在正确的地方分裂、分化，并与相邻细胞协调精准发挥功能。多细胞生命的发育过程，是自然界中最引人注目的壮举之一。尽管经过数十年的研究，生物学家仍然无法完全理解这一过程。 2018年4月26日，Science杂志发表三篇超重磅研究，来自哈佛医学院和哈佛大学的研究人员使用多种技术组合，包括对发育中

斑马鱼和青蛙胚胎数千个单细胞的基因测序，以精确的方式跟踪和描绘了组织和整个机体从单细胞发育的完整历程。哈佛大学分子和细胞生物学教授Alexander Schier表示，“这几乎就像通过几颗星星看到了整个宇宙。” 使用单细胞测序技术，研究团队在胚胎发育的最初24小时内追踪单个细胞的命运，揭示出单个细胞基因开启或关闭的综合景观，以及胚胎细胞何时何地转变为新的细胞状态和类型。这些发现就好比是勾勒出胚胎发育过程中产生不同细胞类型的遗传“配方”目录，为发育生物学的深入研究和疾病的认识，提供了前所未有的资源。图|斑马鱼受精卵在4、6、8、10......小时（hpf）时的发育过程中不同器官细胞形成，最中心的深蓝色为受精卵，以时间为单位向外辐射。 “通过单细胞测序，我们可以在一天的时间里概括数十年来对细胞在生命早期阶段分化的艰苦研究。”哈佛医学院系统生物学助理教授Allon Klein表示，“通过我们开发的方法，我们正在绘制我们认为发育生物学的未来，发育生物学将会转变为定量的、大数据驱动的科学。” Alexander Schier表示，除了对生命早期阶段有所了解之外，这项工作还可以为大量疾病的新认识打开大门。“我们预见，任何复杂的生物学过程，只要是细胞随时间改变了基因表达，都可以使用这种方法重建，不仅仅是发育中的胚胎，还有癌症发生或大脑退化。”

20170301CTC单细胞mRNA测序技术路线

CTC单细胞mRNA测序技术路线从这里之后的数据分析部分都没有哦~ 单细胞转录组mRNA测序一、技术简介单细胞转录组是指某个细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。单细胞转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。转录组测序针对的是有参考基因组的物种。与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。二、MALBAC技术 1.运用Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC多重退火环状循环扩增技术，精确反转录某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息mRNA并进行扩增。解决了扩增对微量初始模板过大的扩增偏移，使得单细胞中90%的基因组能够被测序，样品起始量可低至0.5pg； 2.无物种的限定；要求mRNA有Poly A尾结构，GC％为35％-65％。 3.分辨率高：单碱基分辨率； 4.覆盖度高：能覆盖到几乎所有转录本片段序列；

5.检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定及定量正常和稀有转录本；三、技术参数 1.样品要求样品类型：已分离的单细胞样本或去蛋白并进行DNase处理后的完整Total RNA；样品需求量（单次）：使用MALBAC进行微量扩增，样品建议为单细胞或总量≥10pg，最低起始量≥0.5pg； 2.测序策略 PE151。推荐数据量 6G clean data以上。 3.项目执行周期每个样品数据量6G以下，样品量小于10个，标准流程的执行周期约为50 个工作日；样品数量多于10个时，项目的执行周期需根据项目的规模而定。 4.项目合格指标产生不低于合同规定的clean data。四、主要技术流程单细胞裂解-MALBAC扩增-文库构建-高通量测序-数据处理-生物信息分析五、信息分析标准信息分析： 1.对原始数据去除接头序列、污染序列及低质量reads； 2.测序数据统计； 3.对于有参考基因组的转录组分析，须明确具体物种，因为即使有参考，很多物种SNP或Indel等注释信息也不像人的那么全、那么规范。生物信息部需确定特定物种的某些分析是否可做。单细胞转录组建库其实是：单细胞转录组扩增+基因组建库（扩增后产物是DNA）。单细胞不能做链特异性转录组测序。

单细胞测序

第一章单细胞测序技术概览摘要: 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中... 2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言 2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。 1. 单细胞测序技术简介本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplification technology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonal mutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被―稀释‖或平均掉的转录特征。 1.1 选择恰当的细胞说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用

单分子测序PacBio技术和应用解决方案

单分子测序PacBio技术和应用解决方案一、技术原理 SMRT：single molecular real time Sequencing PacBio RS，RS表示Real time Sequencing 关键之一：DNA聚合酶基本原理：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，经过Watson配对后不同的碱基加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。和其他基本测序技术一样，在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应，怎样在其中进行单分子反应检测？周围有大量的荧光标记的游离碱基，怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来？通过一个物理现象解释：ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）。例如微波炉壁上可看到有很多密集的小孔。小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会穿透面板泄露。如果孔径小于波长，能量不会辐射外部，起保护作用。

在一个反应管（SMRTCell：单分子实时反应孔）中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20X 10-21L）里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，将背景降到最低。单个ZMW底部固定有一个结合了模板DNA的聚合酶，当加入测序反应试剂后，每个碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。一个SMRTCell中有15万个ZMW，每个孔中有一个单分子DNA链在高速合成，如众星闪烁。原始检测数据的结果，每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰，每分钟>100个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，就能实时检进行检测。关键点之二：荧光标记位点。这是影响测序长度的非常关键的因素。二代测序都标记在5…端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。这是NGS的测序读长仅能达到100多bp到200bp的一个原因。 PacBio平台的碱基荧光标记在3…端磷酸键。在DNA合成过程中正确的碱基进入时，在3?端磷酸键的标记是会随磷酸键断裂自动被打断，标记物被弃去，亦即合成的DNA链不带荧光标记，和天然的DNA链合成产物一致，可以达到很长的读长。

三代测序

第一代测序技术 1977年，Sanger发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainter?minatorsequencing）和A.M.Maxam和W.Gilbert 报道的DNA化学降解测序法(chemicaldegradationse?quencing)为代表的第一代测序技术诞生，但由于化学降解法的程序复杂，后来逐渐被Sanger测序法代替。 Sanger测序法原理：双脱氧核苷酸没有3′-OH，且DNA聚合酶对其没有排斥性。当添加放射性同位素标记的引物时，在聚合酶作用下ddNTP被合成到链上，但其后的核苷酸无法连接，合成反应也随之终止，后续再根据各个合成片段的大小不同进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后，便可根据片段大小排序及相应泳道的末端核苷酸信息读出整个片段的序列信息。通过调节加入的dNTP和ddNTP的相对量即可获得较长或较短的末端终止片段。一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。所以被广泛应用在单序列测序上。在小型的细菌基因组测序、质粒测序、细菌人工染色体末端测序、突变位点验证等研究领域中较为常见。第二代测序技术第二代测序技术也称为新一代测序技术NGS(Next Generation Sequencing)，相比第一代测序技术，总体往高通量、低成本方向发展。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定，且一般读长较短。通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库）富集了这些DNA片段。接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。第二代测序技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/HiSeq/MiSeq、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。 1、Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像主要步骤： ①DNA文库制备——超声打断加接头 ②Flowcell——吸附流动DNA片段 ③桥式PCR扩增与变性——放大信号 ④测序——测序碱基转化为光学信号 2、Roche454 油包水PCR+4种dNTP车轮大战+检测焦磷酸水解发光 ①DNA文库制备——喷雾打断加接头 ②乳液PCR——注水入油独立PCR ③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号 3、IonTorrent原理油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测 ①DNA文库制备——喷雾打断加接头 ②乳液PCR——注水入油独立PCR ③微电极pH检测——磁珠入池记录pH

三代测序原理技术比较

导从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1,发展至今三十多年时间，测导序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从读长到短，再从短到长。摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。图1 :测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson ）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam和吉尔伯特（Gilbert ）发明的化学法（链降解）?并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2' 和3'都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为san ger测序法制作了一个小短片，形象而生动。值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了San ger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2 - 4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP 图2: Sanger法测序原理

单分子实时测序

单分子测序原理利用DNA 聚合酶合成与模板互补的DNA 链, 在三围空间中记录模板位置和核苷酸序列信息, 再反向构建DNA 模板的序列。除了DNA 合成反应的三大要素(模板、酶、核苷酸)之外, 模板所处位置和反应循环中单色荧光标记的核苷酸顺序(如A、C、G、T )也是最终DNA序列能够完成的关键要素。如果反应所用的核苷酸标记着四种不同的荧光, 则每一次反应循环就需要切换不同波长的光以记录不同的碱基。单分子测序平台介绍 1．并行单分子合成测序技术 Helicos Biosciences 是第一个设计开发单分子测序方法( tSMSTM) 技术平台的公司，其基础主要来自于Braslavsky 等人的研究。主要是利用合成测序理论，测序时首先将待测序列打断成小片段并在3'末端加上polyA ，并用末端转移酶阻断，同时在玻璃芯片上随机固定多个polyT 引物( 其末端皆带有荧光标记) ，将小片段DNA 模板与检测芯片上的polyT 引物进行杂交并精确定位，通过成像来精确定位杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点; 逐一加入荧光标记的单色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，利用全内反射显微镜( total internal reflection microscopy，TIRM)进行单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，就可以实现实时测序。由于该技术采用了Cy5 ( 吲哚-5-菁) 荧光基团具有很好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率，激发波长在647nm 处) 和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。 2．单分子实时合成测序技术 SMRT 技术是基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为载体进行测序反应。SMRT 芯片是一种带有很多零模式波导孔( zero-mode waveguides，ZMW) ( 厚度为100 nm) 的金属片，ZMW 是一种直径只有几十个纳米的孔，由于其底部上的小孔短于激光的单个波长，导致激光无法直接穿过小孔，而会在小孔处发生光的衍射，形成局部发光的区域，即为荧光信号检测区，该区域内锚定有DNA 聚合酶。测序时将基因组的DNA 打断成许多小的片段，制成液滴后将其分散到不同的ZMW 纳米孔中。当ZMW 孔底部聚合反应发生时，被不同荧光标记的核苷酸会在小孔的荧光探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒，荧光标记会在激光束( Excitation) 的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP 的种类，反应完成后荧光标记会被聚合酶切除而弥散出ZMW 小孔，其它未参与合成的dNTP 由于没进入荧光信号检测区而不进入荧光信号检测区。SMRT 测序时，样品准备过程涉及到样品DNA 的打断、末端补齐、连接接头、测序这几个步骤。测序中需要的样品量很少，样品准备中所用的试剂也很少，而且测序过程中省去扫描和洗涤的过程，所以测序所花的时间较少。 3．纳米孔单分子技术 Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术完全不同于前两种测序技术，其核心就是将在某一面上含有一对电极的特殊的脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔中结合一个核酸外切酶。当DNA 模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA 分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA 分子的序列。纳米孔单分子测序技术的一大优势就是仪器构造简单使用成本低廉; 因为它不需要对核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统( 如激光发射器和CCD信号采集系统等) ，能直接对RNA 分子进行测序。同时由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流，因而能对修饰过的碱基进行测序，这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值; 缺点就是它采用的是水解测序法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序精确度。单分子测序技术的应用

单细胞测序技术大比拼

单细胞测序技术大ＰＫ随着“人类细胞图谱”计划得开展，单细胞测序技术已经进入2、0时代，尤其,基于微液滴或者微流控芯片技术得高通量单细胞分选平台得出现，引领生命科学研究进入单细胞生物学时代。目前,国内外以及各种文献报道得单细胞测序技术让人眼花缭乱,不知该如何选择。其实，国内外大规模单细胞技术得平台主要有C１?单细胞全自动制备系统、ICＥLL8 Singｌe—CelｌSysｔem、Ｉｌlumｉｎａ?Bio-Rａd?Sｉｎgｌｅ-Ceｌl Ｓeｑuencing Ｓｏluｔiｏｎ、ＢD Rhapｓody? S ingle—Cell AｎalysiｓSysｔem与10X Chrｏmiｕm Sｉngle Ceｌl Ｇｅｎe Ｅｘpｒession Soｌuｔioｎ这五种，接下来小编就带您一一了解下: 10X GENOMＩCS技术简介 CｈrｏmiumTM Singｌe Cｅll ３′Ｓolution就是基于10 X Genｏmicｓ平台,能够一次性分离、并标记50０–１0000个单细胞,并能在单细胞水平进行检测得技术,其通过微流控系统,将单细胞或长片段DNA分子快速分配到油包水得微反应体系中，每个微反应体系中得单DNA分子会获得唯一得特异性分子标签,制备生成得测序文库可以在illumina平台进行测序，并由10x Genomｉｃs提供数据分析及可视化软件,测序实验及分析流程可以与illuｍina系统无缝衔接。 1０×gｅnomｉcs技术一次可以同时得到大量大细胞数据，但只能得到ｍRＮＡ信息，LncRNA大部分信息丢失,UMI技术能很好去除认为分析引入duplicａtioｎ及PCR引入ＳＮP 位点。同样对RＮA质量要求高,降解同样会引起５'端信息丢失. 10X GEＮOＭＩCS单细胞转录组测序优缺点 10ｘGenｏｍｉcｓ单细胞转录组测序优点 1、简单便捷:集单细胞分选、扩增、建库于一体; 2、细胞通量高:每个样本细胞数可达5０0—10000个;

单细胞测序技术

单细胞测序技术全自动实验室样品处理工作平台Biomek? 4000真正实现了操作管理的智能化、流程设计的模块化、台面布局的灵活性和操作界面的图形化；其功能强大，简单高效，实验结果精确可靠，使科研人员脱离了繁杂的实验操作；标准化的实验流程的建立减少了人为误差，不断升级的实验操作和应用使得现在和将来的多种实验应用成为可能。Biomek? 4000基于模块化设计，您可以根据不断变化的实验需求变换台面布局；可更换的台面布局、不断升级的实验操作和应用使得现在和将来的多种实验应用成为可能。其Biomek软件的操作界面直观、简单，无论您是自动化的初次使用者，还是经验丰富的专家，建立、编辑或者运行自动化程序都毫不费力。 Biomek? 4000自动化液体处理工作站真正实现了操作管理的智能化、流程设计的模块化、台面布局的灵活性和操作界面的图形化，功能强大，简单高效，实验结果精确可靠，使科研人员脱离了繁杂的实验操作，建立标准化的实验流程，将更多的精力投入到实验方案的设计：Biomek? 4000基于模块化设计，您可以根据不断变化的实验需求变换台面布局；可更换的台面布局、不断升级的实验操作和应用使得现在和将来的多种实验应用成为可能。其Biomek软件的操作界面直观、简单，无论您是自动化的初次使用者，还是经验丰富的专家，建立、编辑或者运行自动化程序都毫不费力。

Biomek? 4000实验室自动化工作站可轻松精准地完成移液、梯度稀释、分液以及合并液体等液体处理工作，满足客户不断变化的需求，被广泛应用于生物工程、DNA质粒纯化、药物筛选、ELISA反应、PCR前处理、DNA测序处理、临床检验样品处理及血站系统高通量样品分析工作。其自动化的操作过程可有效减少人为操作的误差，提高实验的重复性，降低液体处理等工作中的样品处理成本，满足广大客户目前和将来科研的广泛需求。

三代测序技术的比较

一代、二代、三代测序技术张祥瑞 2013/04/22 11:43 第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把 DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析第三代测序技术-高通量、单分子测序