应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒
《河北渔业））２０１０年第２期（总第１９４期）ｏ检验检测
１．５ＤＮＡ提取
剪取Ｓ０ｍｇ组织，剪碎后加入６００肛Ｌ组织裂解液（Ｏ．５％十二烷基肌氨酸钠，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤ—ＴＡ，ｐＨ８．０，２００ｐｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ），室温裂解至组织块完全溶解，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清加入６００ｐＬ酚：氯仿ｔ异戊醇（２５：２４；１）抽提，室温放置５ｍｉｎ后，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｒａｉｎ（反复抽提３次），取最上层液体，加入１ｍＬ无水乙醇，－－２０℃沉淀过夜。置１２０００ｒ／ｒａｉｎ离心２０ｒａｉｎ，弃上清，用７０％乙醇洗涤沉淀，１２０００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，在空气中干燥，ＴＥｂｕｆｆｅｒ溶解。所得ＤＮＡ样品通过１％琼脂糖凝胶电泳进行检测。一２０℃保存备用。
１．６ＰＣ８反应程序
反应体系
以上各成分混匀，瞬时离心。反应条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，６８℃１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环；７２℃最后延伸１０ｍｉｎ。
２结果
２．１ＤＮＡ提取
组织样品经裂解液裂解后用酚：氯仿：异戊醇抽提３次，经无水乙醇沉淀后，所得基因组ＤＮＡ样品溶解于ＴＥｂｕｆｆｅｒ中，经１％琼脂糖凝胶检测，所得基因组ＤＮＡ条带单一，无拖带现象，表明提取ＤＮＡ质量较好（见图１）。
２．２ＰＧＲ反应
所提取ＤＮＡ经１００Ｘ稀释后用作ＰＣＲ反应模板。用锦鲤疱疹病毒特异性引物进行扩增，所
一３８一得ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶检测，在４８４ｂｐ处出现特异性条带。阴性对照无条带（见图２）。对所得ＰＣＲ产物进行序列测定，结果显示，所获产物与ＮＣＢＩ上已发表的锦鲤疱疹病毒序列同源率可达９９％。
图１基因组ＤＮＡ凝胶圈
（１，２ｌ基因组ＤＮＡＭ：ＤＬ２０００／ｖｉａｒｋｅｒ）
圈２ＰＣ８产物凝胶图
（１ｌＰＣＲ产物ＩＭｌＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，２：阴性对照）
３讨论
ＫＨＶ的感染谱较小，在集约化养殖条件下仅感染框镜鲤和建鲤，框镜鲤死亡率高达５０％～８０％，病程较短。流行病学调查表明，该病毒的致病性具有水温依赖性，该病毒的最适致病温度为１８－－－２８℃，与Ａｙａｎａｐｅｒｅｌｂｅｒｇｒ６］研究结论相近。ＫＨＶ的潜伏期长，一般为１４ｄ，甚至更长。１９９８年在以色列的ＭａｇａｎＭｉｃｈａｅｌ地区首次暴发锦鲤疱疹病毒病，１９９９年确认ＫＨＶ为其真正的病原。自１９９８年以来该病在英国、欧洲大陆、美国及以色列等国家和地区暴发流行，日本也于２００３年１０月首次证实了该病的存在［７］。２００２年４
月，广东省某养殖场进口的锦鲤出现了暴发性疾
应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒
作者：闫春梅， 张雅斌， 郑伟， 熊占山， 张家松， Yan Chunmei， Zhang Yabin， Zheng Wei ， Xiong Zhanshan， Zhang Jiasong
作者单位：吉林省水产科学研究院,吉林,长春,130033
刊名：
河北渔业
英文刊名：HEBEI FISHERIES
年，卷(期)：2010(2)
被引用次数：1次
参考文献(9条)
1.Reinertsen H;Haaland H Sustainable fish farming 1994
2.Perelberg A;Smirnov M;Hutoran M Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel 2003
3.Gilad O;Yun S;Andree KB Initial characteristics of Koi herpes virus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in Koi,Cyprinus carpio Koi 2002
4.Hasegawa S;Somamoto T;Nakayasu C A cell line(CFK)from fin of isogeneic ginbuna crusian carp 1997
5.Gray W L;Mullis L;LaPatra S E;et al,Goodwin A Detection of Koi herpes virus DNA in tissues of infected fish[外文期刊] 2002(3)
6.Ayana perelberg;Maya Ilouze;Moshe Kotler Antibody response and resistance of Cyprinus carpio immunized with cyprinid herpes virus 3(CyHV-3)[外文期刊] 2008(29/30)
7.Lida T;Sano M Koi herpesvirus disease 2005(01)
8.刘荭;史秀杰;高隆英进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定[期刊论文]-华中农业大学学报 2002(05)
9.刘宗晓;刘荭;江育林锦鲤疱疹病毒病的研究进展[期刊论文]-检验检疫科学 2006(16)
本文读者也读过(10条)
1.段宏安.张睿.徐晔.周毅.姚燕林.王海涛.李金华.刘小琴.吴玉石锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定[期刊论文]-畜牧与兽医2008,40(11)
2.乌日琴.刘中勇.黄宝春.Wu Riqin.Liu Zhongyong.Huang Baochun PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[期刊论文]-检验检疫科学2005,15(2)
3.刘彦泓.郝苗.闵建.杨滴.刘岑杰.夏元凤聚合酶链式反应法检测饲料中鸡源性成分[期刊论文]-粮食与饲料工业2010(4)
4.范万红.刘荭.岳志芹.吕建强.何俊强.江育林.FAN Wan-Hong.LIU Hong.YUE Zhi-Qin.LU Jian-Qiang.HE Jun-Qiang.JIANG Yu-Lin锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[期刊论文]-中国海洋大学学报(自然科学版)2007,37(5)
5.张艳.孟庆峰.钱爱东.王伟利.ZHANG Yan.MENG Qing-feng.QIAN Ai-dong.WANG Wei-li锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立[期刊论文]-吉林畜牧兽医2010,31(4)
6.刘福莉.陈华才.LIU Fu-li.CHEN Hua-cai金华火腿中金黄色葡萄球菌的聚合酶链式反应检测[期刊论文]-中国计量学院学报2009,20(4)
7.林雪玲.乌日琴锦鲤爆发性出血病病原电镜观察和PCR检测研究[期刊论文]-黑龙江畜牧兽医2006(5)
8.石艳丽.王凤山.郭学平聚合酶链式反应技术及应用[期刊论文]-齐鲁药事2004,23(8)
9.柯浩.刘振兴.林敏.孟轩.陈棠堂.KE Hao.LIU Zhenxing.LIN Min.MENG Xuan.CHEN Tangtang锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF59的克隆、分析及其主要B细胞表位区的原核表达[期刊论文]-南方水产2010,06(4)
疱疹病毒组织灭活疫苗研制初探[期刊论文]-河北渔业2010(4)
引证文献(1条)
1.张振国.徐立蒲.王姝.王静波.王小亮.曹欢锦鲤疱疹病毒双重PCR检测方法的研究[期刊论文]-中国畜牧兽医2011(9)
本文链接：https://www.360docs.net/doc/9c13522557.html,/Periodical_hebeiyy201002013.aspx