105-耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶和过氧化氢酶基因的克隆与功能研究
中国科学技术大学
硕士学位论文
耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶和过氧化氢酶基因的克隆与功能
研究
姓名：郑晖
申请学位级别：硕士
专业：分子生物学
指导教师：姚启智;吕星
2000.6.1
中文摘要
中文摘要
耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶和过氧化氢酶基因
的克隆和功能研究
耐辐射奇球菌（ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ），原名耐辐射微小球菌，是一种对电离辐射和紫外线具有超强耐受力的极端微生物。（自耐辐射奇球菌被发现
以来，其超强的辐射抗性引起了人们的广泛兴趣，一直是各国学者广泛关注的
课题。本项研究着重探讨了耐辐射奇球菌体内的抗氧化酶系，从生物抗氧化的角度阐述了耐辐射奇球菌抗氧化酶系与其辐射抗性的关系。）√
目的
１．探明耐辐射奇球菌体内过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，Ｃａｔ）和超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）的活性，并进一步鉴定它们
的种类。
２．扩增出耐辐射奇球菌的Ｃａｔ和ＳＯＤ的基因，阐明它们的基因结构并加以表达，进一步探讨它们的调控机理。
３．研究奇球菌的生长曲线与过氧化氢酶活性曲线的关系，并进一步研究耐辐射奇球菌的抗氧化酶的表达调控与其辐射抗性的关系。
／方法：ｔ，
（、Ｐ／
培养耐辐射奇球菌，经过超坚波破碎菌体后，对其裂解液作聚丙稀酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）。用活性染色的方法对凝胶染色，检测Ｃａｔ和ＳＯＤ的酶活性，并以活性抑制的方法鉴定ＳＯＤ的种类。依据Ｃａｔ和ＳＯＤ中的保守性氨基酸序列，设计简并引物。用ＰＣＲ的方法自奇球菌基因组ＤＮＡ中扩增出ｃａｆ和ｓｏｄ＊ｇ对应
中文摘要
的基因片段，并克隆入载体，测定其序列。将获得的扩增出的基因片段的序列同其它物种的ｃａｔ和ｓｏｄ作同源性比较，并通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以确认其来源囟为奇球菌的基因组ＤＮＡ。通过Ｉｎｔｅｒｎｅｔ将扩增的基因片段的序列信息同奇球菌基因组ＤＮＡ的序列作对比和查询，检出奇球菌的ｃａｔ和ｓｏｄ全长序列。用ＰＣＲ的方法扩增出奇球菌ｃａｔ和ｓｏｄ的全长基因并克隆入载体。通过序列测定印证了扩增序列后，将其克隆入表达载体并分别转入ｃａｔ和ｓｏｄ缺陷型大肠杆菌诱导表达。通过酶的活性染色的方法来检测转入的基因是否表达。对已表达的转化菌作药物敏感性实验来印证转入基因的功能。通过光谱学的方法，确定奇球菌的生长曲线和Ｃａｔ酶活性曲线的关系。以低浓度的Ｈ２０２对奇球菌做诱导以后，对奇球菌作氧化损伤和紫外辐射损伤处理，检测诱导后奇球菌存活率的改变，以此来检验抗氧化酶在奇球菌辐射抗性中的作用。
结果：
通过ＰＡＧＥ和酶的活性染色检测后，在奇球菌体内发现了两种Ｃａｔ酶和一种ＳＯＤ。进一步的实验表明在奇球菌体内的ＳＯＤ为Ｍｎ．Ｆｃ混合型ＳＯＤ。通过简并引物对奇球菌基因组ＤＮＡ作ＰＣＲ扩增后，成功地扩增出ｃａｔ和ｓｏｄ的对应片段。序列测定后，对这两段序列分别作的同源性分析显示这两个片段分别与其它物种的Ｃａｔ和ＳＯＤ具有高度的同源性。Ｓｏｕｔｌｌｅｍ杂交的结果表明这两个片段确实来自奇球菌的基因组ＤＮＡ。这样就确证了这两个片段是奇球菌的ｃａｔ和ｓｏｄ基因的片段。通过序列对比自奇球菌基因组ＤＮＡ序列数据库中检出了两个ｃａｔ和一个ｓｏｄ的完整基因。这两个ｃａｔ和ｓｏｄ基因被扩增、克隆入表达载体并转入大肠杆菌对应的缺陷株后，经过药物诱导，ｃａ出基因得到成功表达。而ｃ口ｆＡ和ｓｏｄ基因却未获表达，原因不明。对获得∞出基因的转化菌所作的Ｈ２０２敏感性对比实验表明，该转化菌对Ｈ２０２的敏感性显著降低，说明∞出基因已获得功能性表达。在奇球菌的生长曲线和Ｃａｔ酶活性曲线对比实验中发现，奇球菌中Ｃａｔ酶的活性与其生长的时相具有正相关的特点。通过低浓度Ｈ２０２诱导以后，奇球菌对氧化损伤和和紫外辐射损伤的抗性都有了大幅提高，表明了抗氧化酶系在奇球菌对辐射的抗性中起了重要作用。／７
中文摘要
结论：
在耐辐射奇球菌中，抗氧化酶系中的各酶有着高度的活力，它们保护着菌体免受各种氧化损伤。同时这些酶的高活力，对于奇球菌的高强度辐射耐受力有着重要的作用。
关键词：
耐辐射奇球菌辐射损伤过氧化氢酶超氧化物歧化酶简并引物
基因组ＤＮＡＰＣＲ表达载体
英文摘要
ＧｅｎｅＣｌｏｎｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎＳｔｕｄｙｆｏｒＳｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅＤｉｓｍｕｔａｓｅ
ａｎｄＣａｔａｌａｓｅｏｆＤｅｉｎＯＣＯＣＣＨＳＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ
ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（ｆｏｒｍｅｒｌｙＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）ｉｓａｋｉｎｄｏｆｓｔｒａｎｇｅｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｗｉｔｈｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｈｉｇｈｄｏｓｅｒａｄｉａｔｉｏｎ．ＳｉｎｃｅｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ，ｉｔｓｓｕｐｒｅｍｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｈａｓｂｅｅｎｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｕｂｊｅｃｔｏｆｎｕｍｅｒｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓｏｎｉｔ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｍａｉｎｌｙｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓｉｎＤｒａｄｉｏｕｒａｎｓａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｅｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒａｄｉａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓｉｎＤ阳讲ｏｕｒⅡｎｓ
Ｐｕｒｐｏｓｅ：
２３Ｔｏｆｉｎｄｏｕｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｔａｌａｓｅ（Ｃａｔ）ａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｉｎＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｕｒａｎｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｔｙｐｅｏｆｔｈｅｍＴｏｃｌｏｎｅｔｈｅｃａｔａｎｄｓｏｄｇｅｎｅｉｎＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｍｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ．Ｆｕｒｔｈｅｒｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｓｅｔｗｏｇｅｎｅｓａｎｄｓｔｕｄｙｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＳｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｉｏｎｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｃｈａｎｇｅｏｆｃａｔａｌａｓｅｉｎＤｒａｄｉｏｕｒａｎｓＴｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒａｄｉａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓｊｎ１２ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ．
Ｍｅｔｈｏｄ：
Ｄｒａｄｉｏｕｒａｎｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｌｙｓｉｓｅｄｂｙｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ．Ｔｈｅｌｙｓａｔｅｗｅｒｅ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄａｎｄｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔｓｗｅｒｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈ湍ｓｅｄｉｎｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ（ＰＡＧ）．
＾ｒＤＪ
ＴｈｅｇｅｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｔａｎｄＳＯＤ．ＡｋｉｎｄｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｔｙｐｅｏｆＳＯＤ．ＯｎｔｈｅｂａｓｅｏｆｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＣａｔａｎｄＳＯＤ，ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄＰｅＲｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｃａｔａｎｄｓｏｄ．ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒａｎｄＷａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒＣａｔｓａｎｄＳＯＤｓ．ＡＳｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｓｏｌａｒｃｅｏｆｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔ．Ａｆｔｅｒａｌｌ
ｉｎｑｕｉｒｙｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｏｆＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔＩｎｔｅｒｎｅｔ，
ｔｈｅｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏＣＧｔＳａｎｄｓｏｄｗｅｒｅｆｏｕｎｄ．Ａｆｔｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｇｅｎｅｏｆｃａｔａｎｄｓｏｄｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏａｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｍｕｔａｎｔｓ．Ｔｈｅｓｐｅｃｉａｌｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｒａｎｆｏｒｍａｎｔｔｏｄｍｇｓｗａｓｉｎｓｐｅｃｔｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｇｅｎｅ．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｃｈａｎｇｅｏｆｃａｔａｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｓｐｅｃｔｒｕｍｍｅｔｈｏｄ．ＡｄｒｕｇｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔＷａＳｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒａｄｉａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ：
ＡｆｔｅｒＰＡＧＥａｎｄｇｅｌｓｔａｉｎ．ｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｃａｔａｌａｓｅａｎｄｏｎｅｌ（ｉｎｄｏｆＳＯＤｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅ
ｔｙｐｅｏｆＳＯＤｉｎＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｉｓＭｎ—ＦｅｃｏｍｂｉｎｅｄＳＯＤ．Ａｆｔｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｓ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｃａｔａｎｄｓｏｄｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｈａｖｅｈｉ幽ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｗｉｔｈＣａｔａｎｄＳＯＤｉｎｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ．ＳｏｕｍｅｍｂｌｏｔａｌｓｏｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈｅＳＯＢＩ＇ＣＣｏｆｔｈｅｓｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓａｒｅｉｎｄｅｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆＤｒａｄｉｏｕｒａｎｓＡｆｔｅｒｉｎｑｕｉｒｙｉｎＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｄａｍｂａｓｅ，ｔｈｅｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｃａｔｓａｎｄｓｏｄｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｓｅｔｈｒｅｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．Ａｆｔｅｒｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，ｏｎｌｙｏｎｅ
ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｔｈｒｅｅＷａＳｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅｃａｔＡａｎｄｓｏｄ
ｇｅｎｅｓｄｏｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓ
ｗｉｔｈｍｌｋｔｌｏｗｎｒｅａｓｏｎ．ＡｆｔｅｒＨ２０２ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｇｒｅａｔｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＨ２０２ｗａｓｆｏｕｎｄｉｎＥｃｏｌｉｃａｔＢｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ．ＴｈｉｓｒｅｓｕｌｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈａｔｔｈｅｃａｔＢｇｅｎｅｈａｓｇｍｎｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｈｅｓｔｕｄｙＯｉｌＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｇｒｏｗｔｈｅｌｌ／ｗｅａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｃａｔａｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｃｈａｎｇｅｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｓｅｔｗｏｆａｃｔｏｒｓｈａｓｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎ．ＡｆｔｅｒｌＯＷｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＨｚ０２ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ．ｔｈｅＤ。ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ’ｓｕｒｖｉｖａｌｆｒａｃｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｈｕｎｄｒｅｄｓｆｏｌｄｓｕｎｄｅｒｔｈｅＨ２０２ｓｈｏｃｋａｎｄｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ．ｒａｄｉａｔｉｏｎｄａｍａｇｅ．Ｔｈｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈｅｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｎｔｉ．ｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒａｄｉａｔｉｏｎｏｆＤｒａｄｉｏｕｒａｎｓ．
Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎ：
ＩｎｔｈｅＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｔｈｅａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓｈａｖｅｖｅｒｙｈｉ曲ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｙｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓｆｒｏｍｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ．Ａｎｄｂｙｔｈｉｓｗａｙ，ｔｈｅｙｍａｋｅｇｒｅａｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｔｏｔｈｅｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｒａｄｉａｔｉｏｎｏｆＤ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｕｒａｎｓｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ
ｃａｔａｌａｓｅｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰＣＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ
前言
耐辐射奇球菌（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）原名耐辐射微小球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ），最初是由Ａｎｄｅｒｓｏｎ等于１９５６年从经过辐射灭菌处理后仍有腐败的罐装食品中发现的Ｉ”。该菌为一种红色、球状、非产孢子型化能异养菌，通常以二分体或四分体的形式存在。最初人们因其球状外形而将其归入微小球菌属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ），并将随后相继发现的一些该菌的亲缘菌也归入该属”。３１４】。后经过对１６ｓＲＮＡ序列同缘性分析删和细胞壁多糖结构１６，７，８，９，１０’以及细胞膜脂质成分的分析１１１，１２１，人们发现耐辐射奇球菌与微小球菌属内的各菌种的亲缘关系较远。¨３７于是１９８１，Ｂｒｏｏｋｓ等总结了陆续发现的五种耐辐射球菌的遗传学与生物学特征，建议改其属名为Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ（ｄｅｉｎｏ为奇异、陌生之义，），从而确立了该菌属是区别于一般微小球菌的独立菌属。ｌｌａ］
奇球菌是一类极端微生物，其最大的特点就是对电离辐射和紫外线具有超强耐受力。耐辐射奇球菌可以经受５０００～３００００Ｇｙ剂量的电离辐射或５００～１０００Ｊ／ｍ２紫外线照射后仍保持不失活。如以电离辐射的平均致死剂量（Ｄ。值）估算，Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ的辐射耐受力（Ｄｏ＝１７５００Ｇｙ）Ｉ”１较大肠杆菌（Ｄｏ＝２５０Ｇｙ）倍高约７０倍较大多数哺乳动物细胞（Ｄ。＝２Ｇｙ）ｍ’高２５００倍。阐明其抗辐射机理一直是各国学者广泛关注的课题。
对于耐辐射奇球菌超强辐射抗性的成因，自该菌发现以来人们己从多种角度进行了探索。最初人们认为该菌所产生的红色色素对其有保护作用１”】，但随后便发现这一推测是错误的。因为首先人们发现在微小球菌属内也有某些菌种具有红色色素，但它们并不耐辐射。［１８１其次后来人们分离到了该菌的红色突变株，这种红色的突变菌株虽然仍然保持着色素，但已失去了对辐射的高度耐
受性。１１９１接着人们又发现ＤＦ口ｄｉｏｕｒＧｎｓ在生长至平台期后，平均每个细胞内仍含有４个拷贝的基因组ＤＮＡ。１２０１人们便推想是否增加染色体ＤＮＡ的拷贝数可以提高对辐射的耐受性？但不久人们便发现这二者之间的关系并不密切。的确，增加染色体ＤＮＡ的拷贝数可以部分提高生物体对辐射的耐受性。例如。大肠杆菌在对数生长期的时候，由于基因组ＤＮＡ复制的速度要高于细菌分裂的速度，因而导致每个细胞内有多于一个拷贝基因组ＤＮＡ，而此时的大肠杆菌相对于平台期时，对辐射具有更高的耐受性。然而自然界中存在着一些微生物，如原生动物门的草履虫，它们平均每个细胞内有数百个基因组ＤＮＡ的拷贝。可是同样作为单细胞生物，它们对辐射的耐受性并不比大肠杆菌高多少。队２２’２３１在其后的研究中，人们又发现奇球菌属内各菌大都带有天然质粒。人们便推想是否象大肠杆菌所携带的质粒赋予大肠杆菌对抗生素的抗性一样，奇球菌所携带的质粒也赋予了它们对辐射的抗性？人们通过快速繁殖和不断分离的方法终于获得了已丢失了天然质粒的单克隆奇球菌落。但令人失望的是，这种丢失了天然质粒的奇球菌仍然保持了对辐射的耐受性。ｍ】这样经过多年的探索，直至近年来现代分子生物学的发展，人们才对奇球菌何以具有如此高的辐射的耐受性这一问题有了更深入的了解。首先是由人们发现了奇球菌具有极高的ＤＮＡ损伤修复能力。一般生物细胞内基因组ＤＮＡ如果出现两个以上的双链ＤＮＡ断裂，这个细胞就不能存活。［２４１而奇球菌却可以修复多达１００个以上的双链ＤＮＡ断裂。【２４】接着Ｍｏｓｅｌｅｙ等又发现奇球菌含有两套独立而完整的针对紫外辐射损伤的修复酶。［２５，２６，２７，２８ＩＭｉｔｏｎ和Ｇｕｔｍａｎ等也发现奇球菌同源重组基因ｒｅｃＡ具有超强活性。并且这个基因对于高强的辐射耐受是必须的。［２９，３０，３１，３２１但是在一个细胞内若将１００多个随机打断的基因组ＤＮＡ片段在短时间内按正确顺序完整地连接起来是难以令人想象的。为此Ｍｉｔｏｎ针对奇球菌具有４组基
因组ＤＮＡ的特点提出了一个模型。ｆ３３Ｊ该攘型认为奇球菌的４组基因组ＤＮＡ在正常状态下是相互交联在一起的，这种交联状态类似于真核生物联会复合体中的Ｈｏｌｌｉｄａｙ模型。这样当基因组ＤＮＡ某处出现双链断裂时，该处的断裂可以迅速同处于交联状态的其它基因组ＤＮＡ发生同源重组，从而得到修复。这也解释了奇球菌的同源重组基因具有超强活性的原因。然而这一假说却未得到实验的证实。特别是真核生物联会复合体中的Ｈｏｌｌｉｄａｙ模型可以在电镜下切实地观测到，而在奇球菌中，却从未观测到ＤＮＡ处于类似的联结状态。另外，人们也发现了即使在ｒｅｃＡ发生突变的菌株中，也存在着ＤＮＡ小片段连接成大片段的现象。【３４】上述的这些研究其主要方向是在ＤＮＡ的损伤修复上。
辐射对生物体的损伤作用是一种综合效应。在辐射特别是电离辐射的条件下辐射对生物体的损伤不仅仅是射线对ＤＮＡ分子的直接损伤，更重要的途径是射线作用于｝Ｌ０分子，使其发生辐解反应而产生大量的活性氧自由基，通过这些活性氧自由基来对生物体造成辐射损伤Ⅲ｛。活性氧自由基是一类极活泼的化学基团，它们可以同核酸分子中的糖苷键、硷基上的羰基或氨基、蛋白分子中的羧肽键和不饱和脂肪酸分子中的双键轻易发生反应。故此氧自由基的靶目标更具广泛性．它们可以使核酸分子发生断链、脱硷基及脱氨基反应，也可以造成蛋白分子发生分子内或分子间的交联或使不饱和脂肪酸发生氧化、加成等反应，并导致它们同其它分子发生交联。［１６１所以活性氧自由基不仅能损伤核酸，还能损伤蛋白质、生物膜等大分子和细胞器。由于高剂量辐射对细胞的损伤主要来自细胞内Ｈ２０分子发生辐解反应而大量产生的氧自由基。所以抗氧化酶无疑在抵御辐射损伤中起重要作用““。耐辐射奇球菌能够在大于５０００Ｇｙ如此高剂量的电离辐射条件下保持不失活，除了具有高效的ＤＮＡ修复系统外，必定也应具有高效的自由基清除系统。
超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）可以催化超氧自由基（０２
生成０，。它们是生物体内十分重要的两种清除自由基的抗氧化酶。。已有研究表明，Ｄｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ菌所含ＳＯＤ和Ｃａｔ酶活性明显高于其他微生物１３６），并可在辐射作用时进一步提高口”。但有关奇球菌中ＳＯＤ和Ｃａｔ酶的基因结构尚未见报道。
在本项课题中，我们克隆了奇球菌ＳＯＤ和Ｃａｔ的基因，阐明了其结构，并从抗辐射、抗氧化、生物功能表达等方面对奇球菌过氧化氢酶作了研究。从生物体抗氧化的角度探讨了奇球菌抗高剂量辐射的成因，为阐明两种抗氧化酶的功能与辐射相关的表达调控研究奠定了基础。
简称Ａｍｐ
ＡＴＰ
ｂｐ
Ｃａｔ
ＤＮＡＥ．ｃｏｌｉ
ＥＤＴＡ
ＩＰＴＧ
ＬＢ
ＮＢＴ
ＯＤ
ＰＢＳ
ＰＣＲ
ＰＡＧＥ
ｒｐｍ
ＳＤＳ
ＳＳＣ
缩略词一览表
英文全称
Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ
Ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂａｓｅｐａｉｒ
ｃａｔａｌａｓｅ
ｄｅｏｘｙ“ｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ－ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ
Ｉｓ。ｐｒ。ｐｙｌｔｈ《ｌ／ｊ—Ｄ．Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ
Ｌｕｒｉａ—ｂｅｇａｎｉｍｅｄｉｕｍ
ｎｉｔｒｏ—ｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ
ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ
中文全称
氨年青霉素
三磷酸腺苷
碱基对
过氧化氢酶
脱氧核糖核酸
大肠杆菌
乙二胺四乙酸
异丙基硫代．６．Ｄ一半乳糖苷
ＬＢ培养基
氯化硝基四氮唑蓝
光密度】
磷酸缓冲盐液
聚合酶链反应
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｓｉｓ聚丙烯酰胺凝胶电泳
ｒｏｔａｔｅｐｅｒｍｉｎｕｔｅ每分钟转数
ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ十二烷基磺酸钠
ｓｔａｎｄａｒｄｓａｌｉｎｅｃｉｔｒａｔｅ标准柠檬酸盐．氯化钠溶液
ＳＯＤｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ超氧化物歧化酶
ＴＥＭＥＤＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ＇，－ｔｅｔｒａ－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅＮ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’，－四甲基乙二胺Ｔｒｉｓｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ三羟甲基氨基甲烷
第一部分
第一部分：
ＤｅＪｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｚ＇ａｎｓ中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶
的活性及种类鉴定
引言
过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，Ｃａｔ）和超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
“。Ｏ。
ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）分别清除Ｈ２０２和超氧阴离子自由基（０２一），是生物体内十分重要的两种抗氧化酶。由于辐射对细胞的损伤主要来自细胞内Ｈ２０分子发生辐解反应时大量产生的自由基，抗氧化酶在抵御辐射损伤中起重要作用ｆ２６Ｊ。Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ中的ＳＯＤ和Ｃａｔ对其辐射抗性有何贡献，尚未见报道。目前已知道其ＳＯＤ和Ｃａｔ相对于其它物种具有很高的活性。我们采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）结合酶的活性染色，对ＤｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓＣａｔ和ＳＯＤ进行了分析，为目后开展两种抗氧化酶的基因表达及其功能分析建立了灵敏度高丽简便易行的检测手段。
一．材料
１．１菌种
Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ尺１（ＡＴＣＣ１３９３９）和Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＳａｒｋ（ＡＴＣＣ３５０７３），购自美国ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ－ｒｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。
１．２试剂
氯化硝基四氮唑蓝（ＮＢＴ），德国Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ公司产品：核黄素，美国
Ｈ。０。
Ｓｉｇｍａ公司产品；三氯化铁，铁氰化钾，氰化钾，３０％Ｈ２０２等，北京化
第一部分
工厂产品，分析纯；蛋白测定试剂盒，美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司产品。
二．方法
２．１细菌培养与裂解液制备
取少量一７０。Ｃ冻存的Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ菌液接种１００ｍｌＴＧＹ（１％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，０．１％Ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐＨ７０），于３０。Ｃ摇菌培养，４８ｈ后，离心收集菌体，用３ｍｌＰＢＳ悬浮细菌，取１ｍＩ菌液于冰浴中超声破碎，１２，０００ｒｐｍ离心去除细菌残体及不溶物，取上清液测定蛋白含量。
２．２Ｃａｔ的ＰＡＥＧ活性染色ｐｓｉ
分别取Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１和Ｓａｒｋ裂解液上清进行７．５％浓度非变性胶ＰＡＧＥ，稳流１５ｍＡ，６ｈ．，电泳后凝胶用蒸馏水洗三遍，浸泡于００６％
Ｈ∞。Ｈ。Ｏ。
Ｈ２０２，缓慢摇动２０ｍｉｎ．，弃去Ｈ２０２液，凝胶用蒸馏水洗三遍，浸泡于２％三氯化铁／２％铁氰化钾混合液（Ｉ／２，ｖ／ｖ）显色，缓慢摇动至墨绿色背景中显出Ｃａｔ透亮带，弃去染液，胶块用蒸馏水漂洗两遍，用密度扫描仪分析各带比例。
２．３ＳＯＤ的ＰＡＥＧ活性染色ｐ９１
分别取Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１和Ｓａｒｋ裂解液上清进行１Ｏ％浓度非变性胶ＰＡＧＥ，稳流１５ｍＡ，４ｈ．，电泳后凝胶用蒸馏水洗三遍，浸泡于ＳＯＤ活性染色液（２．５ｍｍｏｌ／ＬＮＢＴ，３０ｍｍｏｌ／ＬＴＥＭＥＤ，３０．５ｐｍｏｌ／Ｌ核黄素．５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾，ｐＨ７．８），避光放置３０ｍｉｎ．，弃去染液，胶块用蒸馏水漂洗两遍，置于２５Ｗ日光灯照下显色，至青紫色背景中显出ＳＯＤ透亮带。为区分Ｆｅ一和Ｍｎ—ＳＯＤ，同时作Ｆｅ—ＳＯＤ活性抑制的染色实验，即在染液
“棚。
中加入Ｆｅ—ＳＯＤ抑制剂氰化钾（终浓度：１ｍｍｏ／Ｌ）和Ｈ２０２（终浓度：２０ｍｍｏｌ／Ｌ）。
第一部分
三、结果与讨论
图１可见，Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲｌ和Ｓａ席的Ｃａｔ均显示３条带（记为Ａ、Ｂ和Ｃ带），但有所不同。密度扫描分析表明，Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１ＣａｔＡ所占比例为１０．５％，ＣａｔＢ１８，８％，ＣａｔＣ７０ｆ７％；而Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＳａｒｋＣａｔＡ占
２０．７％，ＣａｔＢ５．０％，ＣａｔＣ７４．３％。
图１．Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ尺７（Ｒ）和Ｓａｒｋ（Ｓ）Ｃａｔ的ＰＡＧＥ活性染色图
上样总蛋白量均为２００ｐ．ｇ．
图２．Ｄ．ｒａｄｉｏｕｍｎｓＳａｒｋＣａｔ活性染色总蛋白量梯度实验
Ａ～Ｈ：总蛋白量依次为０．６，１．２，２．４，４．８、９．７、１９．５，３９和７８ｐ．ｇ
第一部分
Ｃａｔ的电泳多带现象在微生物中很普遍。如，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ中含有Ａ～Ｆ多种类型的Ｃａｔ同工酶㈨。一般认为，不同带型的Ｃａｔ来自不同的编码基因。Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ是否存在编码一种Ｃａｔ同工酶的三个基因，有待证实。Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１和Ｓａｒｋ系同属同种的两个亚型（ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ），两者尽管抗辐射的生物特性相同，但核酸序列的同源性只有３３％【８Ｉ，Ｃａｔ电泳带型的差异应是基因差异的反映。
图２所示为用７８～０．６闼总蛋白量的Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＳａｒｋ裂解液上清作的梯度实验。图中可见，可检测ＣａｔＡ带的最低总蛋白量为９．７ｐ，ｇ，ＣａｔＣ带的最低总蛋白量为１２闪，说明活性染色法有较高的灵敏度。
图３．Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲＩ（Ｒ）和Ｓａ州Ｓ）总ＳＯＤ（ａ）
及Ｆｅ?ＳＯＤ抑制（ｂ）的ＰＡＧＥ活性染色图
上样总蛋白量均为２００“ｇ．
第一部分
图４．Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１ＳＯＤ活性染色总蛋白量梯度实验
Ａ～Ｈ：总蛋白量依次为６６、３３、１６．５、８．３、４．２、２．０、１．０和０．５ｐ，ｇ
ＳＯＤ的活性染色见图３ａ。如图所示，Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲＩ和ＳａｒｋＳＯＤ电泳带型略有不同，前者显示２条带（图４更明显），后者只有１条带。染色液中加入Ｆｅ．ＳＯＤ抑制剂后，ＳＯＤ带的强度大幅减弱，而带型和数目无明显变化（见图３ｂ）。密度扫描分析表明，抑制Ｆｅ—ＳＯＤ活性后，Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１ＳＯＤ带的减弱幅度为９０．８％，Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＳａｒｋ为９２．１％，说明在总ＳＯＤ中Ｆｅ—ＳＯＤ占９０％以上。
大多数微生物中存在两种类型的ＳＯＤ，即含铁离子（Ｆｅ２＋）的Ｆｅ—ＳＯＤ和含锰离子（Ｍｎ”）的Ｍｎ．ＳＯＤ。两者虽在氨基酸顺序上存在同源性，但分子量差异较大，电泳迁移率明显不同。Ｆｅ．ＳＯＤ和Ｍｎ—ＳＯＤ多为４聚体蛋白（也有２聚体），每一亚基含一个Ｆｅ２＋或一个Ｍｎ２＋离子。Ｊｕａｎ等曾对纯化的Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１ＳＯＤ进行金属离子测定，发现既含有Ｆｅ２＋离子也含有Ｍｎ“离子，提示Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲ１ＳＯＤ是Ｆｅ”和Ｍｎ２＋离子的嵌合体｜３５１。我们的实验印证了这一推断，并且表明Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ嵌合型ＳＯＤ中Ｆｅ－ＳＯＤ的成分远大于Ｍｎ—ＳｏＤ。
６６～Ｏ．５ｐｇ总蛋白量的ＳＯＤ活性染色梯度实验如图４，可检出ＳＯＤ带
第一部分
的最低总蛋白量为２＃ｇ，同样显示出较高的灵敏度。
这样我们便建立了Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ的Ｃａｔ和ＳＯＤ的高灵敏度的检测方法。
结论
第二部分：
ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ超氧化物歧化酶和过氧化氢酶
基因的克隆和表达
引言
ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的基因结构
目前尚未有报道。阐明这两个基因的结构及其表达特点对于理解Ｃａｔ与
ＳＯＤ的活性同Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ辐射抗性之间的关系具有重要意义。在大
多数物种的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶氨基酸序列中都有几段相对保守
的序列。利用这几段保守性氨基酸序列，我们设计出相应的简并核苷酸引物，利用ＰＣＲ的方法扩增出ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓＲａｄｉｏｄｕｒａｎｓ的过氧化氢酶和
超氧化物歧化酶基因片段并进一步获取其全长基因。在大肠杆菌中表达Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ的过氧化氢酶，我们发现Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ的过氧化氢酶基因可
以使大肠杆菌缺陷菌的功能得到恢复，从而实现了Ｄ．ｒａｄｉｏｕｒａｎｓ过氧化氢
酶的功能性表达。
一．材料
ｌＩｌ菌种和培养
ＤｒａｄｉｏｕｒａｎｓＲＪ（中国科学院微生物资源中心，ＡＳｌ．６３３）。Ｅ．ｃｏｌｉ野生型菌ＧＣ４４６８，Ｃａｔ缺陷型突变菌ＵＭ２，ＳＯＤ缺陷型突变菌ＱＣ７７９（美国大肠杆菌保藏中心，Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ）和工程菌ＪＭｌ０９、ＴＯＰｌ０７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）。
１．２试剂
Ｔａｑ酶、＂１－４ＤＮＡ连接酶（Ｔａｋａｒａ公司）；ＰＣＲ产物克隆试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ