0.25%胰酶-EDTA的配制

细胞消化胰酶的配制

对一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)

配方：100ml PBS,0.25g胰酶

步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O

/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)

2 称胰酶0.25g

3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜

低速搅拌0.5h冰浴中

4 调PH7.4

5 仍在冰浴中

6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完

tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，

酶就变性了。低温，防止酶失活

对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)

tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力

问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。急用！多谢！

答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA 并不是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。

3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。

4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。

6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。

7、可配2－3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。

8、储存液放在－20度冰箱冻存，使用液放在4度，用的时候不要放在27度水浴锅温浴，因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会，因为加的量很少，所以一般不会冻坏细胞。

9、消化时，向培养瓶中加入适量胰酶，个人经验，一般10cm培养皿加入0.5ml 足已，加入后，立刻摇晃培养皿，使胰酶铺满，一旦铺满，立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶，再放入37度培养箱消化。

10、注意，过量的胰酶对细胞是有害的，而EDTA过多也会影响贴壁，所以没必要把细胞泡在胰酶里面消化。

11、胰酶37消化效果最好，低于37度也有消化能力，有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。注意，不可消化过久。

乙二胺四乙酸二钠(EDTA)标准溶液配制标定

乙二胺四乙酸二钠(EDTA)标准溶液配制标定各浓度EDTA标准滴定溶液的配制按表1所示，称取乙二胺四乙酸二钠二水物(C 10H 14 N 2 O 8 Na 2 · 2H 2 O)溶于足够量的水中，稀释至1L，贮存在聚乙烯容器内。表 1 称取EDTA质量

氧化锌基准溶液按表2所示，称取已于800℃灼烧1h的基准氧化锌置于100mL烧杯中，用少量水湿润，滴加盐酸溶液(1+1)至氧化锌溶解，移入250mL量瓶中，稀释至刻度，混匀。表 2标定所需氧化锌质量

标定氨-氯化铵缓冲溶液(pH≈10) 1、称取54g氯化铵溶于水，加350mL氨水，稀释至1L。 2、称取氯化铵溶于水，加36mL氨水，稀释至1L 铬黑T指示液(5g/L) 称取铬黑T和氯化羟胺，溶于乙醇中，用乙醇稀释至100mL，贮存于棕色瓶中。可保持数月不变质。标定时，用单标线吸管吸取25mL氧化锌基准溶液于250mL锥形瓶中，加75mL水，用氨水(1+1)中和至溶液pH7～8(溶液出现微混浊)，加10mL氨-氯化铵缓冲溶液，5滴铬黑T指示液，用EDTA溶液滴定至溶液由紫红色变成纯蓝色为终点。计算乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液浓度按式(1)计算： c(EDTA)＝m/×V (1) 式中：乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液之物质的量浓度，mol/L ； c(EDTA)── m──氧化锌基准溶液中所含氧化锌的质量，g； V──滴定用去乙二胺四乙酸二钠溶液的实际体积，mL； ──与乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液〔 c( EDTA) = L〕相当的以克表示的氧化锌的质量。精密度做五次平行测定，取平行测定的算术平均值为测定结果。

常用抗凝剂的配制及用法

常用抗凝剂的配制及用法 Prepared on 22 November 2020

在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝。对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质。一、肝素（1）肝素抗凝作用原理肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时,常用它作动物全身抗凝剂，肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固。（2）配制和用量纯的肝素10mg能抗凝65~125 ml血液(按lmg等于125U，10~20U能抗1 ml血液计)。但由于肝素制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，因而其抗凝效果也不相同。一般可配成1％肝素生理盐溶液，用时取0．1毫升于试管内，100℃烘干，每管能抗凝5～10ml血液。也可将抽血注射器用配好肝素湿润一下管壁，直接抽血至注射器内而使血液不凝。在动物实验作全身抗凝时，一般剂量为：大白鼠2．5～3．0mg/200～300g体质量，兔10mg ／kg体质量，狗5～10mg／kg体质量。肝素可改变蛋白质等电点，因此当用盐析法分离蛋白质作蛋白质各部分的测定时，不可采用肝素。市售的肝素钠溶液每毫升含肝素12500U，相当于100mg。二、草酸盐合剂（1）原理草酸胺能使血细胞略为膨大，而草酸钾能使血细胞微缩小，因此草酸铵与草酸钾按3：2比例配置，可使血细胞体积保持不变；加福尔马林则能防止微生物在血中繁殖。此抗凝剂最适于作红细胞比积测定。（2）配制方法及用量草酸铵1．2g、草酸钾0．8g、福尔马林1．0ml、蒸馏水加至100ml每毫升血加草酸盐合剂0．1ml(即相当草酸铵1．2mg，草酸钾0．8mg)。根据取血量将计算好的草酸盐剂量加入玻璃容器内烤干备用。如取0．5ml于试管，烘干后每管可使5ml血不凝固。（3）注意事项草酸的作用在于能够沉淀血凝过程中所必需的钙离子，而达到抗凝目的。用时注意加的量应适中，不能过多，以免妨碍去蛋白质血滤液的制取。不适用于血液内钙或钾的测定，也不能用于血液非蛋白氮测定。三、枸橼酸钠常配成3～5%水溶液。也可直接加粉剂，每毫升血加3～5mg，即可达到抗凝目的。枸橼酸钠可使钙失去活性，防止凝血。但其抗凝作用较差，碱性较强，不宜作化学检验之用。仅可用于红细胞沉降速度测定。急性血压测定实验所用枸橼酸钠为5～6％溶液。四、草酸钾（一）原理和注意事项草酸钾为最常用的抗凝剂。其与血液混合后可迅速与血液中的钙离子结合，形成不溶解的草酸钙，使血液不凝固。常用于非蛋白氮测定，但不适用于测定钾和钙。草酸盐能抑制乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和淀粉酶的活性，故应注意。（二）配制及使用方法

实验十一0.02M EDTA标准溶液的配制与标定

实验十一乙二胺四乙酸二钠（EDTA）标准溶液的配制与标定 [C EDTA=0.02mol/L] 一、配制：称取乙二胺四乙酸二钠8g，加1000毫升水，加热溶解，冷却，摇匀，备用。二、标定：（一）以基准氧化锌（ZnO）标定（指示剂：0.5%铬黑T指示剂）标定流程：准称于800±500C度高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂氧化锌（0.3~0.4g）于100mL烧杯中 ↓←少量水湿润，盖上表面皿滴加盐酸溶液（20%）使之刚好完全溶解 ↓ 转移入250毫升容量瓶中，加水至刻度，混匀 ↓ 准确移取25.00毫升（含Zn2+溶液）于锥形瓶 ↓←加甲基红指示剂一滴滴加氨水（10%）至微黄色（此时PH=7~8） ↓←加蒸溜水25mL 加10毫升氨~氯化铵缓冲溶液（PH≈10） ↓←加5滴铬黑T指示液（0.5%）用EDTA溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，即为终点。 ↓

记录EDTA溶液消耗的体积 ↓ 同时做空白实验计算：C EDTA=[m X(V1/250)X1000]/[(V2-V0)X M ZnO] 式中： m--------氧化锌的质量，g V1---------含Zn2+标准溶液所取的体积 V2----------------滴定时，EDTA标准溶液所消耗的体积，mL V0-----------------空白滴定时，EDTA标准溶液所消耗的体积，mL M------------------氧化锌的摩尔质量，g/mol，即M ZnO=81.39g/mol （二）以基准碳酸钙（CaCO3)标定（指示剂：钙指示剂）标定流程：准称工作基准试剂碳酸钙（0.35~0.4g）于100mL烧杯中 ↓←少量水湿润，盖上表面皿滴加盐酸溶液（20%）使之刚好完全溶解（可加热助溶） ↓冷却转移入250毫升容量瓶中，加水至刻度，混匀 ↓ 准确移取25.00毫升（含Ca2+溶液）于锥形瓶 ↓←加甲基红指示剂一滴滴加氨水（10%）至微黄色 ↓

抗凝剂对白细胞分类的影响

抗凝剂对分类的影响这是一个医院最近出的问题，现象是ADIVA60中间细胞过高，经过检查试剂和仪器没有问题，结果是抗凝剂引起的，浓度是2%的EDTA2K100ul烘干,血液采集量是50--100ul之间，这个比例将近超过标准10倍。去掉大部分抗凝剂后正常，对抗凝剂不做处理，标本静置时间延长也会降低中间细胞，这里说明一点的是wbc总数没有大的变化，下面是一个病人的标本，在cd3700上中间细胞为10。5（真空管，进口原装试剂和质控），镜检是10。3，在ADIVA60上，用2%100ulEDTA2K,采血量100ul,混匀后，静置10分钟的结果如下： 20分钟后结果如下： 30分钟后结果如下：请注意图形的变化和数值的对应关系.这种现象好像只发生在固定界标的仪器上，对于浮动界标的仪器来说好像没有影响。所以在这类仪器上都有关于标本采集静置时间的要求。形成机理我说不清楚，因为我既不是搞检验的也不是搞细胞形态的，我只是一个电子工程师。但我可以用

证据证明。这种试验我从99年起已经做过上百次了，在ABX,ABBOTT1700上非常的明显，首先要排出仪器和试剂的原因。大多故障出现在采指血而且是用离心管（小炮弹）的地方。抗凝剂多是自己添加的，而且烘干的抗凝剂尤为明显。仔细计算它们配制的比例就可以知道，这些配制远远大于每毫升血液1.5-2.2mg 的抗凝剂比例，一般都要高出10倍甚至更多，有时候一瓶配制好的抗凝剂添加两次，第一次正常，相隔很久再添加第二批就会出现问题，原因大概是水分挥发造成浓度增高，或者加样疏忽造成的。这种情况经常发生，所以许多医院为了避免出现也是为了省事，干脆购买已经加好。我的实验是这样做的，静脉采血3毫升，2毫升加入真空采血管（BD公司的），0.5毫升加入他们自制的离心管（0.5毫升的），0.2毫升；0.1毫升；0.08毫升分别加入自制的离心管中，，另外，将一只离心管的抗凝剂取出2/3后再加入0.08毫升的静脉血，同时充分混匀，静置15分钟后开始测试，每5分钟测试一遍，（这个时间短于仪器要求的时间，连续计数5次，也就是25分钟，观察中间细胞的变化。真空管在5次中没有变化，0.5毫升的也没有变化，0.2毫升的第一、二次是降低的态势，以后正常。0.1毫升和0.08毫升的每次都是降低态势，图形变化明显。取出部分抗凝剂的管子第一次和第二次图形不同而且数值也呈下降态势但以后三次都跟第二次一样，非常稳定。分析直方图，真空管和0.5毫升的管子做出来的图形很理想，其他四种图形的中间和中性图形过高压不下来，，特别是0.1毫升和0.08毫升的没有取出部分抗凝剂的，就像上面的图那样，而且没有足够的拉宽。造成这种现象的原因只能是抗凝剂，没有别的解释。当然配合镜检会更有说服力。但需要检验人员配合。作为维修人员我们的原则是找到问题所在，解决问题，并能给检验人员一个能够令他们信服的理由就算完成任务，至于机理除非是硬件或者软件本身的，否则我们无法作出合理的阐述，我们不是专家，我们只是为专家服务的。关于EDT2K对血液的影响有很多报道，都是针对PLT的，因为他们的阐述这个观点的时候举例仪器都是浮动界标的仪器，例如SYSMEX,MEK,等，但在ABBOTT和ABX，DANMA等固定界标的仪器对于分类的影响确是很大的，这也许是这两种界标之间的区别或者利弊吧，没有作更深的研究不好说，在5分类的仪器上却不会发生分类问题，主要集中在PLT上。

血液抗凝剂的特点及应用

实验室常用血液抗凝剂的特点及应用在实验室检验中，有许多检测项目的血液标本是需要抗凝才可以检测的。而抗凝剂种类较多，实际应用中要根据不同的需要进行选择，才能获得理想的效果。实验室中常用的抗凝剂有肝素、乙二胺四乙酸盐（EDTA盐）、枸橼酸盐、草酸盐等4种，现将它们的特点及应用分别叙述如下：一、肝素抗凝是用于血液化学成分检测的首选抗凝剂。肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖，是分散相物质平均分子质量为15000。其抗凝原理主要是通过与抗凝血酶Ⅲ结合引起抗凝血酶Ⅲ构型发生变化，加速凝血酶-凝血酶复合体形成而产生抗凝作用。此外，肝素还能借助血浆辅助因子（肝素辅助因子Ⅱ）来抑制凝血酶。常用肝素抗凝剂是肝素的钠、钾、锂、铵盐，其中以肝素锂最好，但其价格较贵，钠、钾盐会增加血液中的钠、钾含量，铵盐会增加尿素氮的含量。通常用肝素抗凝的剂量为10.0～12.5 IU/ml血液。肝素对血液成分干扰较少，不影响红细胞体积，不引起溶血，适用于做红细胞渗透性试验、血气、血浆渗透量、红细胞压积及普通生化测定。但肝素具有抗凝血酶作用，不适合做血凝试验。另外，肝素过量可引起白细胞聚集和血小板减少，所以不适合做白细胞分类和血小板计数，更不能用于止血检验。此外，肝素抗凝血不能用于制作血涂片，因为Wright染色后出现深蓝色背景，影响显微镜减产。肝素抗凝血应于短时间内使用，否则放置过久血液又可凝固。二、乙二胺四乙酸盐(EDTA盐) EDTA能与血液中Ca2+结合成螯合物，凝血过程被阻断，血液不能发生凝固。EDTA盐有钾、钠、锂盐，国际血液学标准化委员会推荐使用的是EDTA-K2，其溶解度最高，抗凝速度最快。EDTA盐通常配成质量分数是15%的水溶液，每ml血液加1.2mgEDTA,即每5ml血液加0.04ml 15%EDTA溶液。EDTA盐可在100℃下干燥，抗凝作用不变。此抗凝剂不影响白细胞计数及大小，对红细胞形态影响最小，并且可以抑制血小板的聚集，适用于一般血液学检测。但如果抗凝剂浓度过高，渗透压上升，会造成细胞皱缩。EDTA溶液pH与盐类关系较大，低pH可使细胞膨胀。EDTA-K2可使红细胞体积轻度膨胀，采血后短时间内平均血小板体积非常不稳定半小时后趋于稳定。EDTA-K2使 Ca2+、Mg2+下降，同时使肌酸激酶、碱性磷酸酶降低，EDTA-K2的最佳浓度为1.5mg/ml血液，如果血少，中性粒细胞会肿胀分叶消失，血小板会肿胀、崩解，产生正常血小板的碎片，使分析结果产生错误。EDTA由于能抑制或干涉纤维蛋白凝块形成时纤维蛋白单体的聚合，不适于血凝和血小板功能检测，也不适用于钙、钾、钠及含氮物质的测定。此外，EDTA能影响某些酶的活性和抑制红斑狼疮因子，故不适合制作组化染色和检查红斑狼疮细胞的血涂片。三、枸橼酸盐枸橼酸盐主要是枸橼酸钠，其抗凝原理是能与血液中的Ca2+结合形成螯合物，使Ca2+失去凝血功能，凝血过程被阻断，从而阻止血液凝固。枸橼酸钠有Na3C6H5O7·2H2O和2Na3C6H5O7·11H2O两种晶体，通常用前者配成3.8%或3.2%的水溶液，与血液按照1:9体积混合。大部分凝血试验都可用枸橼酸钠抗凝，它有助于Ⅴ因子和Ⅷ因子的稳定，并且对平均血小板体积及其他凝血因子影响较小，可用于血小板功能分析。枸橼酸钠细胞毒性较小，也是输血中血液保养液的成分之一。但是，枸橼酸钠6mg才能抗凝1ml血液，碱性强，不适用于血液化验和生化测验。四、草酸盐草酸盐也是常用的抗凝剂，优点是溶解度大，作用原理是溶解后解离的草酸根与标本中的Ca2+形成草酸钙沉淀，使Ca2+失去凝血功能，凝血过程被阻断。常用的草酸盐抗凝剂种类有草酸钠、草酸钾和草酸铵，草酸钠的常用浓度为O.1 mol/L，与血液按1:9比例使用。但是，高浓度k+或Na+易使血细胞脱水皱缩，而草酸铵则可使血细胞膨胀，故测定血细胞比容时用草酸铵与草酸钾或草酸钠两者适当比例混合的抗凝剂，恰好不影响红细胞的形态和体积。常用于血液生化测定，但不适用于K+、Ca 2+的测定。由于生成草酸钙沉淀，红细胞会出现锯齿状，白细胞出现空泡，淋巴细胞及单核细胞会变形，不宜做血片检查。草酸盐可使血小板聚集，并影响白细胞形态，不能用于白细胞和血小板分类计数。附录四常用抗凝剂的配制及用法在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝。对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质。一、肝素（1）肝素抗凝作用原理肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时,常用它作动物全身抗凝剂，肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固。

EDTA标准溶液的配制与标定实验报告

EDTA标准溶液的配制与标定一、实验目的（1）、掌握EDTA标准溶液的配制与标定方法。（2）、掌握铬黑T指示剂的应用条件和终点颜色变化。二、实验原理 EDTA（Na 2H 2 Y）标准溶液可用直接法配制，也可以先配制粗略浓度，再用金属Zn、 ZnO、CaCO 3或MgSO 4 · 7H 2 O等标准物质来标定。当用金属锌标定时，用铬黑T(H 3 In) 做指示剂，在pH=10的款冲溶液中进行，滴定到溶液呈蓝色时为止。滴定反应式：指示剂反应 Hln2- + Zn2+ = Znln- + H+ ）滴定反应 H2Y2- + Zn2+ = ZnY2- + 2H+ 终点反应 Znln- + H2Y2-? ZnY2- + Hln2- + H+ 二、实验注意事项（1）、称取EDTA和金属时，保留四位有效数；（2）、控制好滴定速度；（3）、加热锌溶解时，用表面皿盖住以免蒸发掉。？三、主要仪器与药品仪器：酸式滴定管、25ml移液管、250ml容量瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、表面皿。药品：EDTA二钠盐、金属锌、1:1的氨水、1:1的HCl 、铬黑T指示剂、氨水—NH4Cl缓冲液（PH=10）四、实验过程及原始数据记录（1）、称取分析纯EDTA二钠盐左右，配制成500ml溶液。（2）、称取～金属Zn，加入1:1 HCl 5ml，盖好表面皿，使锌完全溶解，用水冲洗表面皿及烧杯内壁，然后将溶液移入250ml容量瓶中，再加水至刻度摇均，用25ml移液管吸此溶液置于250ml锥形瓶中，滴加1:1 氨水至开始出现Zn(OH) 2白色沉淀，再加PH=10的缓冲溶液10ml ，加水稀释至100ml ，加入少许（约）铬黑T指示剂，用待标定的EDTA溶液滴定至溶液由酒红色变为纯蓝色，即为滴定终点。（ EDTA的标定[ m(Zn) = ]

胰酶配制

胰酶配制一、器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体步骤： (1)水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。 (2)PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2 HPO4 ?H2 O 1.56g，KH2 PO4 0.2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 2、移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 (3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于20℃保存以备使用。

EDTA标准溶液的配制与标定(铬黑T)

实验八EDTA溶液的配制与标定（铬黑T法）一、实验目的 1、学习配制Zn2+标准溶液,EDTA标准溶液； 2、学会以Zn为工作基准试剂,铬黑T为指示剂标定EDTA标准溶液； 3、巩固直接称量、准确配制溶液、准确移取溶液、滴定等基本操作。二、实验原理 1、用EDTA二钠盐配制EDTA标准溶液的原因； EDTA是四元酸，常用H4Y表示，是一种白色晶体粉末，在水中的溶解度很小，室温溶解度为0.02g/100g H2O。因此，实际工作中常用它的二钠盐Na2H2Y·2H2O, Na2H2Y·2H2O 的溶解度稍大,在22℃（295K）时，每100g水中可溶解11.1g. 2、标定EDTA标准溶液的工作基准试剂，基准试剂的预处理；实验中以纯金属Zn为工作基准试剂。预处理：称量前一般应先用稀盐酸洗去氧化层，然后用水洗净，烘干。 3、滴定用的指示剂，指示剂的作用原理；实验中以铬黑T作为指示剂。作用原理：在pH=l0的条件下，滴定前，Zn2+与指示剂反应: HIn2- + Zn2+ ZnIn- + In3- 纯蓝色酒红色滴定至终点时，反应为： ZnIn- + H2Y2- HIn2- + ZnY2- + H+ 酒红色纯蓝色此时，溶液从酒红色变为纯蓝色，变色敏锐。 4、用何种缓冲溶液及其原因；实验是以NH3·H2O-NH4Cl为缓冲溶液。原因：实验中所用的指示剂是铬黑T， p K a2=6.3 p K a3=11.55 H2In-HIn2-In3-

紫红蓝橙若pH<6.3或pH>11.5，由于指示剂本身接近于红色而不能使用。根据实验结果，使用铬黑T的最适宜酸度是pH=9～10.5，pH=10的缓冲液符合要求。 5、计算式。 C EDTA=mV Zn/0.25M Zn V EDTA 三、实验步骤

常用抗凝剂的配制及用法

在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝。对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质。一、肝素（1）肝素抗凝作用原理肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时,常用它作动物全身抗凝剂，肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固。（2）配制和用量纯的肝素10mg能抗凝65~125 ml血液(按lmg等于125U，10~20U能抗1 ml 血液计)。但由于肝素制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，因而其抗凝效果也不相同。一般可配成1％肝素生理盐溶液，用时取0．1毫升于试管内，100℃烘干，每管能抗凝5～10ml血液。也可将抽血注射器用配好肝素湿润一下管壁，直接抽血至注射器内而使血液不凝。在动物实验作全身抗凝时，一般剂量为：大白鼠2．5～3．0mg/200～300g体质量，兔10mg／kg体质量，狗5～10mg／kg 体质量。肝素可改变蛋白质等电点，因此当用盐析法分离蛋白质作蛋白质各部分的测定时，不可采用肝素。市售的肝素钠溶液每毫升含肝素12500U，相当于10 0mg。二、草酸盐合剂（1）原理草酸胺能使血细胞略为膨大，而草酸钾能使血细胞微缩小，因此草酸铵与草酸钾按3：2比例配置，可使血细胞体积保持不变；加福尔马林则能防止微生物在血中繁殖。此抗凝剂最适于作红细胞比积测定。（2）配制方法及用量草酸铵1．2g、草酸钾0．8g、福尔马林1．0ml、蒸馏水加至100ml每毫升血加草酸盐合剂0．1ml(即相当草酸铵1．2mg，草酸钾0．8mg)。根据取血量将计算好的草酸盐剂量加入玻璃容器内烤干备用。如取0．5ml于试管，烘干后每管可使5ml血不凝固。（3）注意事项草酸的作用在于能够沉淀血凝过程中所必需的钙离子，而达到抗凝目的。用时注意加的量应适中，不能过多，以免妨碍去蛋白质血滤液的制取。不适用于血液内钙或钾的测定，也不能用于血液非蛋白氮测定。三、枸櫞酸钠常配成3～5%水溶液。也可直接加粉剂，每毫升血加3～5mg，即可达到抗凝目的。枸櫞酸钠可使钙失去活性，防止凝血。但其抗凝作用较差，碱性较强，不宜作化学检验之用。仅可用于红细胞沉降速度测定。急性血压测定实验所用枸櫞酸钠为5～6％溶液。四、草酸钾（一）原理和注意事项草酸钾为最常用的抗凝剂。其与血液混合后可迅速与血液中的钙离子结合，形成不溶解的草酸钙，使血液不凝固。常用于非蛋白氮测定，但不适用于测定钾和钙。草酸盐能抑制乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和淀粉酶的活性，故应注意。（二）配制及使用方法

液体配制及实验方法

（一）液体配制 1.完全培养基 DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液）若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺 2.PBS 1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4 3.胰酶用之前调节PH值至7.6 4.CaCl2 将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性 5.双抗终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml 青霉素0.6μg为1个单位链霉素 1.2195μg为一个单位称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml 6.两性霉素B 100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml 7.细胞冻存液 20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS) 8STZ溶液 STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕. 9油红O 原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99% ）100ml 。稀释液：油红O 原液20ml ，蒸馏水20ml ，过滤后使用。 10茜素红称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.

常用标准溶液的配制和标定

标准溶液的配制与标定实训一氢氧化钠标准溶液的配制和标定一、目的要求 1.掌握NaOH标准溶液的配制和标定。 2.掌握碱式滴定管的使用，掌握酚酞指示剂的滴定终点的判断。二、方法原理 NaOH有很强的吸水性和吸收空气中的CO2，因而，市售NaOH中常含有Na2CO3。反应方程式：2NaOH + CO2→ Na2CO3+ H2O 由于碳酸钠的存在，对指示剂的使用影响较大，应设法除去。除去Na2CO3最通常的方法是将NaOH先配成饱和溶液（约52%，W/W），由于Na2CO3在饱和NaOH溶液中几乎不溶解，会慢慢沉淀出来，因此，可用饱和氢氧化钠溶液，配制不含Na2CO3的NaOH溶液。待Na2CO3沉淀后，可吸取一定量的上清液，稀释至所需浓度即可。此外，用来配制NaOH溶液的蒸馏水，也应加热煮沸放冷，除去其中的CO2。标定碱溶液的基准物质很多，常用的有草酸（H2C2O4?2H2O）、苯甲酸（C6H5COOH）和邻苯二甲酸氢钾（C6H4COOHCOOK）等。最常用的是邻苯二甲酸氢钾，滴定反应如下： C6H4COOHCOOK + NaOH →C6H4COONaCOOK + H2O 计量点时由于弱酸盐的水解，溶液呈弱碱性，应采用酚酞作为指示剂。三、仪器和试剂仪器：碱式滴定管（50ml）、容量瓶、锥形瓶、分析天平、台秤。试剂：邻苯二甲酸氢钾（基准试剂）、氢氧化钠固体（A.R）、10g/L酚酞指示剂：1g酚酞溶于适量乙醇中，再稀释至100mL。四、操作步骤 1.0.1mol/L NaOH标准溶液的配制用小烧杯在台秤上称取120g固体NaOH，加100mL水，振摇使之溶解成饱和溶液，冷却后注入聚乙烯塑料瓶中，密闭，放置数日，澄清后备用。准确吸取上述溶液的上层清液5.6mL到1000毫升无二氧化碳的蒸馏水中，摇匀，贴上标签。

胰酶得配制

查看文章细胞消化胰酶的配制2008-12-10 12:46适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin) 配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O /2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水) 2 称胰酶0.25g 3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中 4 调PH7.4 5 仍在冰浴中 6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完 tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%) tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。急用！多谢！答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。 2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。 3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。 4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。 5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。 6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。 7、可配2－3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。

实验室中常用的抗凝剂

实验室中常用的抗凝剂有肝素、乙二胺四乙酸盐（EDTA盐）、枸橼酸盐、草酸盐等4种，实际应用中要根据不同的需要进行选择，才能获得理想的效果。现将它们的应用特点分述如下：一、肝素抗凝是用于血液化学成分检测的首选抗凝剂。肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖，是分散相物质平均分子质量为15000。其抗凝原理主要是通过与抗凝血酶Ⅲ结合引起抗凝血酶Ⅲ构型发生变化，加速凝血酶-凝血酶复合体形成而产生抗凝作用。此外，肝素还能借助血浆辅助因子（肝素辅助因子Ⅱ）来抑制凝血酶。常用肝素抗凝剂是肝素的钠、钾、锂、铵盐，其中以肝素锂最好，但其价格较贵，钠、钾盐会增加血液中的钠、钾含量，铵盐会增加尿素氮的含量。通常用肝素抗凝的剂量为10.0～12.5 IU/ml血液。肝素对血液成分干扰较少，不影响红细胞体积，不引起溶血，适用于做红细胞渗透性试验、血气、血浆渗透量、红细胞压积及普通生化测定。但肝素具有抗凝血酶作用，不适合做血凝试验。另外，肝素过量可引起白细胞聚集和血小板减少，所以不适合做白细胞分类和血小板计数，更不能用于止血检验。此外，肝素抗凝血不能用于制作血涂片，因为Wright 染色后出现深蓝色背景，影响显微镜减产。肝素抗凝血应于短时间内使用，否则放置过久血液又可凝固。二、乙二胺四乙酸盐(EDTA盐) EDTA能与血液中Ca2+结合成螯合物，凝血过程被阻断，血液不能发生凝固。EDTA盐有钾、钠、锂盐，国际血液学标准化委员会推荐使用的是EDTA-K2，其溶解度最高，抗凝速度最快。EDTA盐通常配成质量分数是15%的水溶液，每ml血液加1.2mgEDTA,即每5ml血液加0.04ml 15%EDTA溶液。EDTA盐可在100℃下干燥，抗凝作用不变。此抗凝剂不影响白细胞计数及大小，对红细胞形态影响最小，并且可以抑制血小板的聚集，适用于一般血液学检测。但如果抗凝剂浓度过高，渗透压上升，会造成细胞皱缩。EDTA 溶液pH与盐类关系较大，低pH可使细胞膨胀。EDTA-K2可使红细胞体积轻度膨胀，采血后短时间内平均血小板体积非常不稳定半小时后趋于稳定。EDTA-K2使Ca2+、Mg2+下降，同时使肌酸激酶、碱性磷酸酶降低，EDTA-K2的最佳浓度为1.5mg/ml血液，如果血少，中性粒细胞会肿胀分叶消失，血小板会肿胀、崩解，产生正常血小板的碎片，使分析结果产生错误。EDTA由于能抑制或干涉纤维蛋白凝块形成时纤维蛋白单体的聚合，不适于血凝和血小板功能检测，也不适用于钙、钾、钠及含氮物质的测定。此外，EDTA能影响某些酶的活性和抑制红斑狼疮因子，故不适合制作组化染色和检查红斑狼疮细胞的血涂片。三、枸橼酸盐枸橼酸盐主要是枸橼酸钠，其抗凝原理是能与血液中的Ca2+结合形成螯合物，使Ca2+失去凝血功能，凝血过程被阻断，从而阻止血液凝固。枸橼酸钠有Na3C6H5O7·2H2O和2Na3C6H5O7·11H2O两种晶体，通常用前者配成3.8%或3.2%的水溶液，与血液按照1:9体积混合。

EDTA标准溶液的配制和标定(氧化锌标液)

EDTA标准溶液的配制和标定（氧化锌标液）一、目的：1、学习EDTA标准溶液的配制和标定方法。 2、学习配位滴定法的原理，了解该滴定法的特点。二、原理：标定EDTA的基准物质有Zn、CaCO 3、Bi、Cu、MgSO 4 ·7H 2 O等。（M EDTA =372.2g/mol）指示剂：EBT 1%（称取1克EBT加入三乙醇胺75ml、无水乙醇25ml）。在PH=10.0的缓冲溶液中：Zn2++In3- ZnIn- （酒红色） ZnIn-+HY3-←→ ZnY2-+HIn2- （蓝色）三、用ZnO作为基准物质时所需试剂： EDTA ZnO（烘干） NH 3—NH 4 Cl缓冲液（PH=10.0） 1+1 氨水EBT 1% 6mol·L-1的HCl （M ZnO =81.37）四、实验步骤： 1、配制0.02mol·L-1EDTA500mL 在台称上称取EDTA二钠盐3.5—3.8g溶入150—200mL温水中，稀释至500mL，装入试剂瓶中、待标定。 2、配制ZnO标准溶液250mL 在分析天平上准确称取ZnO 0.3—0.4g于小烧杯中。滴加6mol·L-1的HCl至全部溶解（约5～10mL），转移至250mL的容量瓶中。 3、准确取三份各25.00mL+25mL蒸馏水入三角锥瓶中。慢慢滴加NH 3 水，至刚好出现白色浑浊，加入10mL缓冲液，滴加3—4

滴铬黑T。 4、0.02mol·L-1EDTA滴定，由酒红色→蓝色为终点。五、数据及计算：公式：C EDTA =（m ZnO /M ZnO ×25/250）/ （V EDTA /1000）样品号 1 2 3 ZnO的质量（g） ZnO基准溶液用量（mL） EDTA终读数（mL） EDTA初读数（mL） V EDTA （mL） C EDTA （mol·L-1） C EDTA 平均值（mol·L-1）绝对偏差相对平均偏差（%）二、思考题： 1、配位滴定中为什么需要采用缓冲溶液？ 2、为什么在ZnO中加入HCl？ 3、通过计算说明为什么称取0.32—0.4g ZnO？怎么标定0.05mol/L的EDTA标准溶液基准物是氧化锌指示剂是铬黑T固体？

胰酶的配制

胰酶的配制过程姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制 1、专用PBS缓冲液配方： 1000mlPBS: 7.000g NaCl 1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose 0.3700g KCl 0.2g Na2PO4H 3.000g Tris 0.2400g KH2PO4 0.4000g EDTA 超纯水1000ml 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 0.0010g 酚红 5ml PS 2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤： 1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。 2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。 3）加入5ml双抗（PS）。 4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。 5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。 6）调PH至7.2-7.4。 7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。-20℃保存。 9）不可反复冻存。每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项： 1）整个分装过程在无菌条件下进行。 2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。低温可防止酶失活。 3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。 4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。 5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。 6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制 1、250ml胰酶配制方法 Tryspin 0.625g PS 2.5ml 苯酚红0.1g 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 2、实验步骤 1）实验之前将所用试剂瓶泡酸12小时自来水清洗至无色后再用超纯水冲洗并进行高压灭菌。 2）按前面要求准确称取所需试剂，在容量瓶中用0.01M PBS定容至250ml。3）调节PH至7.4。 4）将所配制的胰酶在细胞间用0.22um的过滤器过滤并分装。 3、注意事项 1）在溶解、分装和过滤过程中要轻轻混匀，避免产生气泡。否则酶的活性会受到影响。 2）为保持酶的活性，应尽量在低温下操作。 3）胰酶配好后应避免反复冻融。因此在过滤后将其分装到1.5ml离心管中。三．胶原酶的配制方法 1、50ml体系配方组成

常用抗凝剂的配制和使用

常用抗凝剂的配制及用法在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝。对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质。一、肝素（1）肝素抗凝作用原理肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时,常用它作动物全身抗凝剂，肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固。注意事项：做全血DNA提取的时候抗凝剂不能采用肝素！因为肝素是聚合酶链式反应的抑制剂！（2）配制和用量纯的肝素10mg能抗凝65~125 ml血液(按lmg等于125U，10~20U能抗1 ml血液计)。但由于肝素制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，因而其抗凝效果也不相同。一般可配成1％肝素生理盐溶液，用时取0．1毫升于试管内，100℃烘干，每管能抗凝5～10ml血液。也可将抽血注射器用配好肝素湿润一下管壁，直接抽血至注射器内而使血液不凝。在动物实验作全身抗凝时，一般剂量为：大白鼠2．5～3．0mg/200～300g体质量，兔10mg／kg体质量，狗5～10mg／kg体质量。肝素可改变蛋白质等电点，因此当用盐析法分离蛋白质作蛋白质各部分的测定时，不可采用肝素。市售的肝素钠溶液每毫升含肝素12500U，相当于100mg。二、草酸盐合剂（1）原理草酸胺能使血细胞略为膨大，而草酸钾能使血细胞微缩小，因此草酸铵与草酸钾按3：2比例配臵，可使血细胞体积保持不变；加福尔马林则能防止微生物在血中繁殖。此抗凝剂最适于作红细胞比积测定。（2）配制方法及用量草酸铵1．2g、草酸钾0．8g、福尔马林1．0ml、蒸馏水加至100ml每毫升血加草酸盐合剂0．1ml(即相当草酸铵1．2mg，草酸钾0．8mg)。根据取血量将计算好的草酸盐剂量加入玻璃容器内烤干备用。如取0．5ml于试管，烘干后每管可使5ml血不凝固。（3）注意事项草酸的作用在于能够沉淀血凝过程中所必需的钙离子，而达到抗凝目的。用时注意加的量应适中，不能过多，以免妨碍去蛋白质血滤液的制取。不适用于血液内钙或钾的测定，也不能用于血液非蛋白氮测定。三、枸櫞酸钠常配成3～5%水溶液。也可直接加粉剂，每毫升血加3～5mg，即可达到抗凝目的。枸櫞酸钠可使钙失去活性，防止凝血。但其抗凝作用较差，碱性较强，不宜作化学检验之用。仅可用于红细胞沉降速度测定。急性血压测定实验所用枸櫞酸钠为5～6％溶液。四、草酸钾（一）原理和注意事项草酸钾为最常用的抗凝剂。其与血液混合后可迅速与血液中的钙离子结合，形成不溶解的草酸钙，使血液不凝固。常用于非蛋白氮测定，但不适用于测定钾和钙。草酸盐能抑制乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和淀粉酶的活性，故应注意。

EDTA标准溶液的标定

EDTA标准溶液的标定 1．实验目的（1）掌握络合滴定的原理，了解络合滴定的特点；（2）学习EDTA标准溶液的配制和标定方法；（3）了解金属指示剂的特点，熟悉二甲酚橙、钙黄绿素指示剂的使用及终点颜色的变化。 2．实验原理乙二胺四乙酸（简称EDTA），难溶于水，通常用EDTA二钠盐，并采用间接法配制标准溶液。标定EDTA溶液的基准物有Zn、ZnO、CaCO 3、Cu 、MgSO 4 ·7 H 2 O等。用于测定Pb2+、 Bi3+含量的EDTA溶液可用ZnO或金属Zn作为基准物进行标定。以二甲酚橙作指示剂，在pH=5~6的溶液中，二甲酚橙指示剂（XO）本身显黄色，而与Zn2+的络合物呈紫红色。EDTA与Zn2+形成更稳定的络合物，当用EDTA溶液滴至近终点时。EDTA会把与二甲酚橙络合的Zn2+置换出来而使二甲酚橙游离，因此溶液由紫红色变为黄色。其变色原理可表达如下： XO（黄色）+ Zn2+__ZnXO（紫红色） ZnXO（紫红色）+EDTA__ZnEDTA（无色）+XO（黄色） EDTA溶液若用于测定石灰石或白云石中CaO、MgO的含量及测定水的硬度，最好选用CaCO 3 做基准物标定。这样基准物和被测组分含有相同的组分，使得测定条件一致，可以减少误差。首先将CaCO 3 用盐酸溶解后，制成Ca2+标准溶液，调节酸度至pH>12.5时，以钙黄绿素-百里酚酞作混合指示剂，用EDTA标准溶液滴至由绿色荧光色消失。 3．仪器和药品仪器：电子天平、酸式滴定管、移液管、锥形瓶、容量瓶、烧杯、试剂瓶。药品：（1）以ZnO为基准物时所用试剂：ZnO（A.R）、乙二胺四乙酸二钠（A.R）、六次甲基四胺：20%（m/v）、二甲酚橙指示剂（0.2%）、盐酸（1+1）。（2）以CaCO 3 为基准物时所用试剂：碳酸钙：固体，一级试剂（G.R）；盐酸（1+1）；钙黄绿素-百里酚酞混合指示剂(1g钙黄绿素和1g百里酚酞与50g固体硝酸钾（A..R）磨细，混匀后，贮于小广口瓶中)；氢氧化钾溶液：20%（m/v）;乙二胺

胰酶胶原酶的配制

胰酶-EDTA的配制 1、专用PBS缓冲液配方： 1000mlPBS: 7.000g NaCl 1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose 0.3700g KCl 0.2g Na2PO4H 3.000g Tris 0.2400g KH2PO4 0.4000g EDTA 超纯水1000ml 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 0.0010g 酚红 5ml PS 2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018） 2、配制步骤： 1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。 2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。 3）加入5ml双抗（PS）。 4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。 5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。 6）调PH至7.2-7.4。 7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。-20℃保存。 9）不可反复冻存。每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项： 1）整个分装过程在无菌条件下进行。 2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。低温可防止酶失活。 3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。 4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。 5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。 6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。 0.25%胰酶（无EDTA）的配制 1、250ml胰酶配制方法 Tryspin 0.625g PS 2.5ml 苯酚红0.1g 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 2、实验步骤 1）实验之前将所用试剂瓶泡酸12小时自来水清洗至无色后再用超纯水冲洗并进行高压灭菌。 2）按前面要求准确称取所需试剂，在容量瓶中用0.01M PBS定容至250ml。3）调节PH至7.4。 4）将所配制的胰酶在细胞间用0.22um的过滤器过滤并分装。 3、注意事项 1）在溶解、分装和过滤过程中要轻轻混匀，避免产生气泡。否则酶的活性会受到影响。 2）为保持酶的活性，应尽量在低温下操作。