RT-PCR原理与实验操作步骤
RT-PCR原理与实验操作步骤
关键词：RT-PCR 逆转录酶reversetranscriptase 聚合酶链式反应引物设计DNA 聚合酶
一、知识背景：
1、基因表达：DNA RNA Protein
单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；
B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；
3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
二、RT-PCR的准备：
1、引物的设计及其原则：
1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c、3'端要求：3'端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3'端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过2个。
f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g、5'端无严格限制：5'末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。
3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。
实验操作步骤
一、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）
1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
三、试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：
Tris 54g
硼酸27.5g
0.5M EDTA 20ml？pH8.0
蒸溜水1000ml
5×TBE （贮存液）
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液450ml水
--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：
1、1.0%：
1.0g琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭
2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:
同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的RT-PCR材料：
（生工. Tel. 2236106.）
Taq酶（含MgCl2 Buffer）200u 70.00
dNTP: 1支
Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
正义：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′反义：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′2、par-4:
正义：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反义：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火温度计算
2（A T）4（G C）
正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、引物稀释：
加DEPC水量为（μl）
= ? nmol / OD ×管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
TRIzol法抽提总RNA
细胞1×107
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
匀浆（要彻底，后转至EP管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500g，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
注：
1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解
2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
两步法RT-PCR
（第一步：逆转录反应）
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl （稀释10倍后用）
↓
混匀，离心，70℃5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓
试剂浓度体积终浓度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
总体积40μl（20μl）
↓
混匀，离心，42℃60min
↓
95℃10min（破坏MLV）
↓
4℃保存
两步法RT-PCR
（第二步：PCR反应）
总体积20μl(50μl)
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol 下游引物10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol cDNA模板X (?) (1-10μl)
DEPC水20μl-4.3μl-X
数据库原理与技术实验报告
南华大学计算机科学与技术学院 实验报告 （ 2011 ~2012 学年度第二学期） 课程名称数据库原理与技术实验名称数据库实验 姓名谢志兴学号20104030342 专业电气信息类班级1003班 地点8—209教师刘征海
实验 1 认识DBMS
一、利用管理工具创建数据库、表和表间关系 （一）实验目的和注意事项 实验目的：熟悉SQL Server Management Studio的基本操作，进一步理解数据库、表、表间关系的概念。 注意事项：创建数据库和数据表时应认真，如果出现错误，应相应地修改结构或删除。 （二）实验内容 (1) 利用SQL Server Management Studio 创建数据库，名称为【学生选课XXXX】。XXXX为各位同学的学号中的最后四位 (2) 在【学生选课XXXX】中建立数据表，表的定义如下所示。 学生XXXX(学号，姓名，性别，出生日期，院系名称，备注)； 课程XXXX(课程号，课程名，选修课，学分)； 选修XXXX(学号，课程号，分数)。 要求定义每张表的主码，为属性选择合适的数据类型，决定是否允 许为空，为【性别】和【学分】属性定义默认值。 (3) 定义表之间的关系。 (4) 分别为表录入几行数据记录，同时练习数据的修改和删除操作。 （三）实验步骤 (1) SQL Server Management Studio，连接数据库服务器，进入SQL Server Management Studio 主界面。 (2) 右击【对象资源管理器】|【数据库】，选 择快捷菜单中的【新建数据库】命令，弹出【新建数据库】窗口,在各属 性页中设置新建数据库的属性，包括设置数据库逻辑名、所有者、文件 的逻辑名、文件的物理名、文件类型、文件增长方式、文件的路径、文 件组等属性，如图下所示。
RT-PCR的实验原理与操作步骤复习课程
R T-P C R的实验原理与 操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研https://www.360docs.net/doc/9817821046.html, 二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR 扩增反应的操作 第一节PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5'→ 3'方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成（见图）。 1．模板DNA 的变性 模板DNA加热到90~95 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA 中G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而A-T 间只有两个氢键相连，所以G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起 始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复 合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1?2min。 3．引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72 C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40?60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2?4min, —次PCR 经过30?40次循环，约2?3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y =（1 + X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不
数据库原理实验报告
南京晓庄学院 《数据库原理与应用》 课程实验报告 实验一SQL Server 2005常用服务与实用工具实验 所在院(系):数学与信息技术学院 班级：14软工5班 学号：14551204 14551206 姓名：花元凯罗文波 １.实验目的 (1)了解Microsoft 关系数据库管理系统SQL Server的发展历史及其特性。 (2)了解SQL Server 2005的主要组件、常用服务和系统配置。 (3)掌握Microsoft SQL Server Management Studio 图形环境的基本操作方法。了解使用“SQL Server 2005 联机从书”获取帮助信息的方法；了解“查询编辑器”的使用方法；了解模板的使用方法。 2.实验要求 (1)收集整理Microsoft关系数据库管理系统SQL Server的相关资料，总结其发展历史及SQL Server 2005主要版本类别和主要功能特性。 (2)使用SQL Server配置管理器查看和管理SQL Server 2005服务。 (3)使用Microsoft SQL Server Management Studio连接数据库；使用SQL Server帮助系统获得 所感兴趣的相关产品主题/技术文档。
(4)使用Microsoft SQL Server Management Studio“查询编辑器”编辑并执行Transact-SQL查 询语句。 (5)查看Microsoft SQL Server 2005模板，了解模板的使用方法。 (6)按要求完成实验报告。 3.实验步骤、结果和总结实验步骤/结果 (1) 简要总结SQL Server系统发展历史及SQL Server 2005主要版本类别与主要功能特性。 SQL Server是由Microsoft开发和推广的关系数据库管理系统（DBMS），它最初是由Microsoft、Sybase和Ashton-Tate三家公司共同开发的，并于1988年推出了第一个OS/2版本。1996年，Microsoft 推出了SQL Server 6.5版本；1998年，SQL Server 7.0版本和用户见面；SQL Server 2000是Microsoft公司于2000年推出，该版本继承了SQL Server 7.0 版本的优点，同时又比它增加了许多更先进的功能。SQL Server 2005 是一个全面的数据库平台，使用集成的商业智能(BI) 工具提供了企业级的数据管理。SQL Server 2005 数据库引擎为关系型数据和结构化数据提供了更安全可靠的存储功能。SQL Server 2008是一个重大的产品版本，它推出了许多新的特性和关键的改进，使得它成为至今为止的最强大和最全面的SQL Server版本。目前最新版本是SQL SERVER 2014。 1，SQL Server 2005学习版当保护和管理应用系统内外部的信息变得至关重要时，通过提供一套免费、易于使用和健壮的数据库，学习版帮助开发人员建立强健的和可靠的应用系统。
RT-PCR实验方法总结大全.
RT-PCR实验方法总结大全 RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 要求: 1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须 在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?https://www.360docs.net/doc/9817821046.html,问题: 在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教! 解答: 1.RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE;引物的(最好产物短点;若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样;体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法,而另一个基因的3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无 RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。 有关内参: RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些,最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。 问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just
RT-PCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR
数据库理论与技术实验报告六
数据库理论与技术课程实验报告 学院：电子与信息工程学院专业：计算机科学与技术年级：计科 实验时间： 2012年4月26日 组长：学号：组_______ 姓名：学号：组_______ 姓名：学号：组_______ 姓名：学号：组_______ 指导教师签字：成绩： 实验六、视图、存储过程和触发器实验 一、实验目的和要求 1、实验目的：理解视图的概念和相关命令，并掌握视图相关的SQL语句；理解存储过程的概念和相关命令，并掌握存储过程相关的SQL语句；理解触发器的概念和相关命令，并掌握触发器相关的SQL语句 2、实验要求：掌握视图存储过程和触发器的使用 二、实验内容与步骤 1、利用数据库jxgl完成实现下列查询的视图。（在SQL SERVER2005上附加数据库jxgl），并运行该视图。 安装好的SQL Server2005没有用户数据库，如果磁盘上有数据库文件，可以将其附加到数据库服务器中。 （1）创建视图，实现查询03物流1班学生的详细信息 （2）创建视图，实现查询“入学成绩”在350到400分之间的学生的姓名和班级（3）创建视图，实现查询students表中现有的班级 （4）创建视图，实现查询具有“教授”或“副教授”职称的教师的教师编号和姓名（5）创建视图，实现查询姓“陈”，且籍贯是“宁波”的学生的姓名，出生日期，入学成绩。 （6）创建视图，实现查询课程名称中包含“DB_”的课程的信息
（7）创建视图，实现查询教师上课情况表中还没有安排好上课教师的班级和对应的课程号 （8）创建视图，实现查询全体学生情况，查询结果按所在班级名升序排列，同一班级中的学生按出生日期降序排列 （9）创建存储过程，实现统计03物流1班学生“入学成绩”的平均分、最高分、最低分 （10）创建存储过程，实现统计各个班级的学生人数，按统计结果做降序排列（11）创建存储过程，实现统计各部门教师的人数，筛选出教师人数在指定人数（参数）以上的部门 （12）创建储存过程，实现查询平均分在指定分数（参数）以上的课程编号 2、将上述查询以存储过程实现，并在后面写出运行该存储过程的语句。 注意：在实验报告中说明查询的目的和对应的语句。 三、实验过程及数据记录 （1）创建视图，实现查询03物流1班学生的详细信息 create view v1 as select * from Students where class='03物流1' select * //查询视图v1 from v1 （2）创建视图，实现查询“入学成绩”在350到400分之间的学生的姓名和班级create view v2 as select sname,class from Students where mgrade between 350 and 400 select * //查询视图v2 from v2 （3）创建视图，实现查询students表中现有的班级 create view v3 as select distinct class //加上distinct能消除重复选项 from Students select * //查询视图v3 from v3
PCR扩增实验操作步骤
PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程
二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总DNA 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 3. 美国MJ公司PCR仪,
4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品 DNA提取试剂盒； EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒； Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer; 琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? ? cm 2. 其他实验需要物品 微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。 四、实验流程 1、总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品 EcoR1 1ul
(待分)rtpcr原理和实验步骤
原理与实验步骤 一、知识背景： 、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 、技术( )：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 、逆转录酶和 逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性： 、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。 、水解活性：水解杂合体中的。 、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。 、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。 、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。 、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。 、耗材：
数据库原理与应用技术实验
实验一数据库管理系统(DBMS)使用初步 姓名：学号： 专业：网络工程班级： 同组人：无实验日期： 【实验目的与要求】 1．掌握SQL Serve 2005 服务器的安装方法 2．了解SQL Serve 2005 的环境 3．了解数据库及其对象 【实验准备】 1．了解SQL Server 2005的版本 2．了解SQL Server 2005各版本对硬件和软件的需求 【实验内容】 1.安装SQL Server 2005 2.练习启动、停止和暂停服务管组件的服务，了解SQL Server 2005中包括的服务器 组件，掌握服务管理器和使用。 3.练习Microsoft SQL Server Enterprise Manager的使用。 4.练习Microsoft SQL 查询分析器的使用。 【实验步骤】 1.0.准备工作: 测试数据库的加载 本实验需用到测试数据库db_shopping，请按以下步骤完成测试数据库的加载，以便完成后面实验。 (1)将数据库备份文件复制到某一文件夹(如：C:\TestDB)下 （2）启动SQL Server 服务管理器。 通过“开始=>程序=>Microsoft SQL Server 2005=>管理向导”打开“SQL Server
服务管理器”，启动“SQL Server 服务管理器”，并记录当前运行的服务器名。 （3）启动企业管理器。 (4)在对象资源管理器中，右击数据库->选择还原数据库，如下图： 在出现的对话框中选择”源设备”，如下图
在源设备选项的右边，点击”…”图标，会出现下图所示对话框： 单击添加按钮，在如下图所示对话框中根据备份文件的存储位置选中备份数据库文件，而后点确定。 在弹出对话框的下拉列表中选择数据库db_shopping，同时在选择用于还原的备份集选项相应位置的复选框中打上勾，如下图：
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。 2. 震荡30s。 3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000×g，4℃离心，15min。 5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。 6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。 7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀 8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。 9. 7500×g，4℃离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。 11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。 二、逆转录合成cDNA第一链 反应体系如下
混匀快速离心一次反应条件如下 -20℃ 冰箱冻存三、PCR反应 混匀快速离心一次反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存 取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。 RT-PCR实验方法总结1,2 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.360docs.net/doc/9817821046.html, 问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR 的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应
凯氏定氮仪原理及操作步骤
凯氏定氮仪原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成(NH4)2SO4 反应式为： 2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤： (一)消化
1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂，浓硫酸，30%过氧化氢。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。 2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。 (二)蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。 1、仪器的洗涤 仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。 仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道
数据库原理及技术实验报告2
《数据库原理及技术》实验报告 姓名：莫鸿斌学号：201601030137 班级：2016级计算机科学与技术实验日期：2018-3-16 一、实验项目 了解SQL Server2012常用组件 二、实验目的 1.掌握SQL Server Management Studio的运用； 2.掌握SQL Server 2012常用组件； 3.如何使用SQL Server Management Studio创建数据库及表。 三、实验内容 1.了解SQL Server2012常用组件； 2.使用SQL Server management studio创建数据库factory，要求将数据库文件 factory_data.MDF存放在E:\data下面，其文件初始大小5MB，自动按5MB增长，将事务日志文件factory_log.LDF存放在E:\data目录下，其文件大小按1MB自动增长。 3.在数据库factory下创建如下表： 职工表(职工号（int），姓名（char(10)）,性别(char(2)),出生日期（datetime），党员否（bit），参加工作时间（datetime），部门号（int）)，其中职工号作为主键。 部门表（部门号（int），部门名（char（10）），其中部门号作为主键。 工资表（职工号（int），发放年份（int），发放月份（int），工资（decimal（6,1））），其中职工号、年份、月份作为主键。 4.建立第三步创建的表之间的参照完整性规则。 5.在上述表中输入数据，每个表至少10条记录。 6.备份数据库，考走以备下次试验使用。 四、实验环境 安装有SQL Server2008的PC一台。 五、实验步骤及结果 1.了解SQL Server2012常用组件； 2.使用SQL Server management studio创建数据库factory；要求将数据库文件 factory_data.MDF存放在E:\data下面，其文件初始大小5MB，自动按5MB增长，将事务日志文件factory_log.LDF存放在E:\data目录下，其文件大小按1MB自动增长。