酵母原生质体制作方案
1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。培养物在预称重的离心瓶中于4℃，1 500
g 离心5 min。
2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。
3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。
4. 于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。
5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。
6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。
7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。
8. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min回收原生质体。
9. 用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。
10. 在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。
11. 往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。于4℃在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管15~30 min。
12. 于4℃，45Ti 转子上100 000 g 离心90 min。收集上清，在100体积贮存缓冲液中透析2~4 h。将透析袋转移到100体积新鲜的贮存缓冲液中，再透析
2~4 h。
13. 取出几微升透析液，用水作1 ：1 000稀释，测定电导率。如果和类似稀释度的贮存缓冲液相等或低于一定值时（通常100~250 mmol/l NaCl），继续步骤14，否则继续透析。
14. 于4℃，10 000 g 离心10 min。收集透析液上清。分成小份放在液氮中冷冻，于-80℃贮存。
中考理化生实验操作考试方案(草稿)
中考理化生实验操作考试方案 市教育局有关初中毕业生升学及学业水平测试理科实验操作考查的精神，为做好2013年全市初中毕业生升学理化生实验操作考查工作，特制订本《实施方案》。 一、组织领导 实验操作考试工作在市、县市区教育局及全市高中阶段学校招生工作领导小组的统一领 导下，由市、县教育局具体组织实施。 二、考试范围、内容、对象 考试范围：依据《义务教育课程标准》，考查范围为学生初中阶段应掌握的分组必做实验 内容与基本实验操作规范，用开放性和探究性题目考查学生动手实践和解决问题的能力。理化生试题各1套，每科满分为10分，每套试题含6个不同实验内容、实验操作难度系数基 本相同、考查时间相同的考查题目，共18个实验考查题目。 考试内容：主要考查学生实验仪器的认识、装配、操作，实验设计，实验现象观察、数 据记录、实验结果表述等。 考试对象：2013年初中毕业生。 三、考试办法 1．由市教育局统一命题、制卷。命题将突出新课程标准教学理念，重点考查学生实验设计、实验探究、实验操作过程的规范。 2．由县市区教育局派出考务组到各考点组织学生现场测试，考生抽签确定实验测试项目；县市区考生由所在县市区教育局组织考试，市直由市教育局组织考试；考试实行封闭管理。 四、时间安排 1．4月20日前组织考生报名，以县市区为单位将参考人数报市教育局中教科；4月25日前完成考点资格审查并上报考点名单；5月4日各县市区到市教育局中教科领取试卷及考 试用品、材料；5月5日培训监考教师，5月6日至25日为全市统一考试时间。 2．考生实验操作考试时间为每场15分钟，间隔5-10分钟，每天考试场次由考务组依据 考点考生人数确定。 五、考前准备 1．报名、办理准考证 报名以学校为单位组织，4月20日前，各学校填写《佳木斯市2013年初中毕业生升学实验操作考试报名、成绩登记册》（一式3份），交县市区教育局中教科。报名时应注意与文
酵母实验操作方案
酵母实验操作方案 一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒70μl 内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl 10 x buffer 8μl 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙醇回收酶切质粒 1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA； 2）－20℃数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清； 3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）； 4）37℃烘干水分和残留乙醇； 5）用20μl ddH2O重溶； 6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量； 三．电转化 1．准备感受态细胞 1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，30℃，摇菌24 hours； 2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，30℃，250rpm，7～8 hours，直到OD600＝1.3～1.5； 3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，4℃离心5 min，弃上清； 4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清； 5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清； 6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，4℃备用，剩下的感受态细胞可以保存在－70℃冰箱大约3周。 2．转化 1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀； 2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴； 3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF 电阻200欧姆，放电时间4～5ms 4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀； 5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块； 6) 涂好的板放在30℃培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。 注：
酵母实验-学生版
酵母系列大实验设计
PCR介导的酿酒酵母基因敲除 1、实验目的 学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因一步敲除法的原理，掌握酵母的转化方法，了解酵母生长及遗传学特性。 2、实验原理 酵母菌作为最简单的真核生物，能以单倍体和二倍体两种形式稳定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以自由的在单倍体和二倍体之间进行转换，在生物学研究中有着得天独厚的优势。 首先酵母菌生长速度很快。对数期生长的单倍体菌株在YPD（富营养天然培养基）90分钟分裂一代，在合成培养基中140分钟分裂一代。其次，酵母的基因组很小，遗传背景相对简单，是一种很容易进行遗传操作的模式生物。酿酒酵母的基因组只有12052 Kb,其基因组序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报道，只有不到5%的ORF含有内含子，其中有约5700个蛋白编码基因，分散在16条染色体上。上世纪90年代末，由数个实验室联合进行的酿酒酵母基因组敲除项目的完成是酵母遗传学研究的里程碑事件。在这个项目中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌株库、杂合子二倍体菌株库以及非必需基因的纯合子二倍体菌株库。这个项目几乎完成了全部ORF的敲除，为生物学研究，特别是组学研究，提供了十分强大的系统性研究工具，为后续基因功能的研究奠定了坚实的基础。此外，酵母作为真核生物，与高等生物在很多代谢通路和蛋白表达调节等方面是高度保守的，为高等生物相关基因，例如疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。 目前，酿酒酵母已经具有一套十分灵活快速的遗传操作体系。酵母允许外源质粒以独立复制子游离于基因组之外存在，也允许其整合到基因组中。但跟其他生物相比，酵母比较独特且强大的特点是外源序列的整合依赖于同源重组机制。之前提到的基因组敲除项目的完成就是依赖于高效率的同源重组，如图-1所示。人们利用PCR的方法，在筛选标记基因两侧引入待敲除基因（YFG，your favorite gene）特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源
毕赤酵母的原生质体和分离出的丝状真菌的细胞核融合[外文翻译]
本科毕业论文外文翻译 译文： 毕赤酵母的原生质体和分离出的丝状真菌的细胞核融合 来源：Enzyme Microb. Technol., 1997, vol. 21, July *PROMI, Av. Belgrano y Pje. Caseros, Tucumdn, Argentina; ‘Universidad National de San Juan; and *Universidad National de Tucumdn, Tucumdn, Argentina 摘要：原子质体是从丝状真菌串珠镰刀菌的菌丝及里氏木霉菌中分离出来，并使用聚乙二醇作为融合剂，来融合发酵木糖酵母毕赤酵母的原生质体。混合物是似酵母的形态，当夹紧均匀电场电泳被完成时，能够表现出类似染色体模式向亲代的酵母水解木聚糖。这些杂交被孤立，同时他们的木聚糖酶活性进行定量确定。木聚糖酶活性在亲代的真菌物种在96小时时表现出最大的增长；在培养基为F 时，它到达796nkat每毫升。在120小时时，串珠菌898nkat每毫升成长为T。里氏木霉菌。木聚糖酶活动在其中的一个混合物达到350nkat每毫升时，并在9小时时，毕赤酵母本身没有显示出木聚糖酶的活动。 关键词：华赤酵母；孤立丝状真菌；细胞融合 介绍 半纤维素代表着所有木本植物资料的一个重要的部分，并像是一个大型闲置的蓄水池的碳源为微生物的生长提供环境；然而，大部份的酵母无法正常代谢木聚糖和其他半纤维素的成分。这限制了他们作为碳源，为日益增加的若干环节使用酵母来生产饮料、食品、药品以及许多其他产品。丝状真菌的许多物种产生木聚糖酶和其他的水相酶,和一些发酵产生的木糖并产生乙醇。 我们正在调查发酵木糖，通过休哈塔假丝酵母，管囊酵母，和毕赤酵母成为乙醇的研究。酵母菌株的原生质体属于上面所提到的物种与酿酒酵母的原生质体融合在一起。得到了所有的混合物与木糖相似,但没有被同化了。 无论是从其它谷草转氨酶菌株中获得的核酵母株或从不相关的生物中获得的原子核，来使酵母原生质体融合被认为是可行的已有一段时间了。并且它已应用于从大鼠肝细胞核的DNA序列中获得的酵母株的构造(布鲁斯)。哈茨木霉菌的菌株核已经从相同的菌株或也用另一个相似物种的菌株来融入原生质体；以此
(完整word版)2017实验学校理化实验操作测试工作方案
2017年会昌实验学校理化实验操作考试工作方案 为认真贯彻落实会昌县教育局《关于做好2017年中考物理、化学实验操作考查工作的通知》精神。为了确保考试的顺利进行及安全有序，特拟定会昌实验学校理化实验考试方案。 一、工作领导小组 组长：刘旭东 副组长：许德友张会明何勋邹新华蓝晶晶 成员：初三年级组成员、总务处负责人、校务办负责人、校医、各班班主任、全体理化教师、学校保卫值班人员及值周值日教师。 二、实验考试地点及时间： 物理：考场物理实验室2 侯考室：物理实验室1 化学：考场化学实验室2 候考室：生物实验室2 时间：5月22至23两天（周一、周二） 三、具体分工及主要职责 总协调：邹新华 总体负责：郑志华 各班联系人：班主任 考场布置： 胡小荣、姚立军分别组织负责物理、化学侯考室的布置。5 月19日前，胡小荣、姚立军牵头、其他理化教师协助负责物理、化学考场内实验器材和药品的分组准备布置。 候考联络组：
职责：侯考室负责各班学生考试联系、学生实验顺序抽签、纪律秩序维护、实验中应注意的事项告知等。 物理：刘香荣（组长）柯小冬吴才长刘则萍余永真 化学：吴林飞（组长）张慧慧章珏曾金凤张臣唐三根 后勤保障组：王金生、汪罗发、周玲徐翠花（开水） 保卫组：邹剑及保卫值班人员 四、考前工作安排 1、各班务必在5月18日前完成所有考试题目的训练，并指出学生在理化集训中出现的操作问题。 2、请各班相关理化老师给学生并负责好考前对学生的叮嘱交代。 3、班主任利用考试当天早读课开好考务会，强调纪律和安全，并认真学习理化实验操作考试实施细则。 五、考试期间，具体工作安排： 1、所有考生在班级上课等待考试，没有安排考试的班级在教室按课表上课。班主任随时等候联络员的电话，期间班主任确保通信畅通；轮到考试的班级，班主任服从安排带好本班学生到指定地点候考并按顺序排好队，负责清点人数，发放准考证，组织学生入场。8：00开始考试。 2、行走路线：物理从综合楼东边楼梯上，化学从综合楼西边楼梯上，考完后统一从综合楼中间楼梯下。 3、考试完毕，全体学生有序回教室上课，然后等待下一科目考试。 4、考试具体安排：
细胞原生质体的制备
细胞原生质体的制备 —植物原生质体分离和活性鉴定 一、实验目的 1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。 2.了解原生质体活性鉴定的原理。 3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程 二、实验原理 去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的 酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间
冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 三、实验用品 1．材料：绿豆，烟草幼苗叶片，油菜或菠菜或烟草等。 2．试剂： 酶解液(绿豆)：1%(W/V) 纤维素酶，1% (W/V)果胶酶，0.7mol/L 甘露醇;10mmol/L CaCl，2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 6.8～ 7.0。 13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，
酵母的筛选 (1)
．葡萄果表酵母的分离: 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制成菌悬液，吸取50μl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L 的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选 1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。 3 赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结
原生质体制备
1.影响原生质体数量和活力的因素 （1）细胞壁降解酶的种类和组合 不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。 （2）渗造压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。这种高渗液称为渗透压稳定剂。常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。 （3）质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。 （4）pH的影响 分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。分离原生质体时，酶液的pH因植物种类不同而有差异，如胡萝ト为5.5、月季为5.5～6.0、烟草为5.4～5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6～5.7。 （5）温度影响 制备生质体时，一般在26土1℃条件下酶解。 （6）植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。要得到良好的供体材料，必要时应对材料进行预处理及预培养。 2.植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法，在实际操作中一般联合运用这三种方法。 1）过滤法用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块 2）离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。 3）飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液（如蔗糖、Ficoll溶液），使原生质体漂浮在溶液表面。
拟南芥原生质体制备转化方法整理
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
2011年合肥市区初中毕业学业理科实验操作考试实施方案
2011年合肥市区初中毕业学业理科实验操作考试实施方案 为全面贯彻党的教育方针，大力推进素质教育，促进学校提高实验教学水平和质量，培养学生实验操作能力和创新精神，根据省教育厅相关文件精神，结合我市实际，制定本实施方案。 一、考试科目和分值 （一）理科实验操作考试科目为：物理、化学。考生随机抽考其中一科。理科实验操作考试按照现行教材中的学生分组实验要求命题。 （二）分值为10分，计入考生初中毕业学业考试总分；同时，考试结果分为A（10－9分）、B（8－7分）、C（6－5分）和D（4分及以下）4个等级，作为初中生综合素质评价“实践与创新”方面重要实证材料之一。 二、考试时间和地点 （一）4月11日公布理科实验操作考试具体范围。 （二）考试时间为4月19日－22日，共4天。 （三）考点分别设在合肥一中（滨湖区）、合肥五中、合肥六中（寿春路校区）、合肥七中、合肥八中（政务区）和合肥九中等6所学校。每个考点设物理、化学考场各2个。 三、对残疾和伤病考生的有关规定 因残疾丧失实验操作能力（须有残疾证）或因伤病确实不能参加实验操作考试的考生（须有病历或有关证明），由
本人申请，学校审核确认（学校应将申请免试的学生名单在学校公示栏公示，不少于3天），无异议后，在4月7日之前报区教育局（教育主管部门），并做好复查的准备。区教育局复核后，于4月8日汇总上报市教育考试院审批。免考的证明材料进入考生档案。被批准理科实验操作免试的考生按6分计算。考试时因考生本人操作因素造成事故受伤而中断考试的学生以实际已得分计算。 四、考试安排 （一）物理、化学试卷均为A、B、C、D、E、F各6套，每套8组。 （二）考生考前30分钟抽签决定考试科目和座位号，以座位定题。 （三）每场开考前30分钟，负责抽签的工作人员要核对考生理科实验操作考试准考证，安排考生抽签，考生按抽签号顺序列队等候入场。 （四）理科实验操作考试时间为每场20分钟。 （五）每个考场由8名考评教师组织考试，含1名主考教师、1名检录员。2名考评教师同时考评8名考生，分别评分后当场交给主考教师，由主考教师、检录员登录实验操作成绩并算出平均分后送交微机登录室登录、打印、公布。 （六）考生允许带钢笔（或圆珠笔）、铅笔、直尺和橡皮，不允许携带任何书籍和其他用品。 （七）考生要按指定时间到达考场，无故缺考的不予补
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化 (1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于 20ml双蒸水中）；共需叶片约90片； (2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时； (3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃， 60g，离心15min； (4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min； (5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min； (6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬； 以下操作均在23℃下进行： (7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪 去前端）轻柔混匀； (8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min； (9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5； (10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀； (11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。 (1)酶解液： cellulose R10 15% Macerozyme R10 0.3% Mannitol 1.09g KCl 0.3M MES 0.3M 调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液 CaCl20.15M β-巯基乙醇0.75mM (2)PEG溶液（40%，v/v） PEG4000 1g 0.8M Mannitol 0.625ml 1M CaCl2 0.25m (3)W5溶液
产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定
第35卷第8期东 北 林 业 大 学 学 报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007 产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1) 惠丰立 冯金荣 杨柯金 文祯中 (南阳师范学院,南阳,473061) 摘 要 从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐 病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY- 6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/ D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群, 序列同源性高达99.6%。因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。 关键词 菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育 分类号 S476 Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong (College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70 A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strain CY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenic fungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26 were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strain CY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2 t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola. Key words Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis 果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。 几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。 1 材料与方法 菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。 1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。 第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。 收稿日期:2006年10月17日。 责任编辑:潘 华。 固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH 4 ) 2 S O41.0g、M gS O4?5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼 脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H 2 O1mL。 菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。 几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。 酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。 形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。 生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。 26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG
原生质体制备方法
原生质体制备方法 培养基： ①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水 ②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、 ③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、蔗糖、1L水、 ④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、蔗糖、试剂： ①1mol/L MgSO4 ②L MgSO4 ③STC：山梨醇、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2 ④肝素 ⑤SPTC：山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2 ⑥无菌水 操作步骤： ①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days ②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG 液体培养基中，120rmp，28℃，12h ③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌 水和1mol/L MgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用 ⑤酶解体系的配制：取Dryslase 45mg+Yartlase105mg至无菌量管中，用10ml 1mol/L MgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上 ⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm， 3h ⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml L MgSO4 冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清
酵母原生质体制备实验
酵母原生质体制备实验 标签：酵母原生质体制备 原生质体由原生质分化形成，具体包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器。植物和动物的如细胞核、线粒体和高尔基体等，而细菌如核糖体、拟核等。 实验方法 实验方法基本方案 实验材料酵母 试剂、试剂盒YPD 酵母消解缓冲液山梨醇抽提缓冲液贮存缓冲液液氮 仪器、耗材摇床水浴锅转子离心机培养箱 实验步骤1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。培养物在预称重的离心瓶中于4℃，1 500 g 离心5 min。 2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。 3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。 4. 于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。 5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。 6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。 7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。 8. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min回收原生质体。 9. 用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。 10. 在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。 11. 往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。于4℃在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管15~30 min。 12. 于4℃，45Ti 转子上100 000 g 离心90 min。收集上清，在100体积贮存缓冲液中透析2~4 h。将透析袋转移到100体积新鲜的贮存缓冲液中，再透析2~4 h。
2019年初中实验操作考试工作方案.doc
2019年初中实验操作考试工作方案 为规范实验操作考试工作，确保实验考试公平、公正、安全，根据教育部、省教育厅有关规定，结合我市实际，制定本工作方案。 一、考试组织 共划分4个考区，分别为东港考区（包括东港区、日照经济技术开发区、山海天旅游度假区，由东港区组织）、岚山考区、莒县考区、五莲县考区。 各考区要成立实验操作考试工作组织机构，制定实验操作考试工作方案，报市教育局备案。 各考点要成立相应的组织机构，设置考务、检录、医务、后勤、安保等专项工作组，具体负责实验考试各个环节的组织工作。要制定实验操作考试工作手册和突发事件应急预案，报区县教育和体育局。 二、考试内容 日照市教育局《关于公布<2019年初中实验操作考试内容及评价标准>的通知（日教便字〔2019〕12号）》中确定的内容。 三、考试时间 五月底前完成，不安排补考。具体考试时间由各考区确定。每学科实验操作考试用时均为10分钟。 四、考试方式 初三物理和化学实验操作考试，每名考生在两个学科中各抽
考一个实验；初二生物实验操作考试，每名考生抽考一个实验。 每学科实验操作考试满分均为10分。各科实验操作分别按实际得分计入中考成绩。 每考场内有1名评委组长和6名评委，每名评委监考4名考生。每考场共安排24名考生，单人单桌考试。实验考试采取评委现场赋分、考生摁手印确认的方式进行。 五、考务管理 （一）考区统筹。 1．周密部署安排。根据考生人数合理安排考试日程，各考区可设置若干考试小组，每个考试小组由领队、检录员、评委组长、评委、成绩登录员等人员组成。 2．严格安全管理。各考区要组织专家对各考点的消防安全、实验设施、仪器装备等情况进行全面检查，对考场布置进行验收。达不到要求的学校一律不得安排考点。 3．严格评委培训。各考区要遴选责任意识强、业务素质高、身体状况好的教师承担考试工作, 参与人员都要签订《实验操作考试工作人员承诺书》。当年有子女、直系亲属等参加考试者不得参与考试工作。 各考区要做好评委培训工作，加强相关法律法规、职业道德、考试规程、作弊识别、安全管理、风险防范等方面的培训，确保评委准确把握实验操作考试内容及评分要点，监督考生遵守安全规程进行实验，及时处置突发情况。 4．严格证件管理。工作人员必须佩戴由各考区统一印制的工作证。考生使用由市教育局统一模板印制并由各区县教育主管