细菌的转化

细菌的转化

【实验原理】

（一）DNA的转化

转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态。用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细胞进入一个敏感的感受状态，以便外源DNA进入细菌内。

感受态的制备方法很多，如CaCl2法、Hanahan法、超级感受态法和电转化法，相比之下，CaCl2法操作简便，重现性好，转化率一般能达到5×106-2×107转化子/μg 质粒DNA，可以满足大多数的实验要求，为人们广泛接受，很多尖端实验室仍然在使用。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被λ噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌，其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA粘附于细胞表现，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

（二）重组子的鉴定

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，lacZ’基因编码的α肽链β-半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸），宿主编码的 片段（缺失N端的β-半乳糖苷酶）和质粒编码的α片段各自都不具有β-半乳糖苷酶活性，但它们要以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。LacZ基因编码的α肽链与失去N 端的β-半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的产物5-溴-4-靛蓝。因此，在IPTG

（异丙基硫代β-D半乳糖苷）诱导下（诱导lac启动子下游的lacZ’基因），携带着lacZ’基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着β-半乳糖苷酶突变基因（ω片段）的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β-半乳糖苷酶，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ’中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的原阅读框，从而不能合成活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

【材料、仪器和试剂】

一、材料和仪器：低温离心机，超净工作台，

二、实验材料

1. 大肠杆菌DH5α（株系）

2. 培养基

(1) LB液体培养基

(2) LB固体培养基。

3. 抗菌素

氨苄青毒素（Amp）用前在无菌试管中，用灭菌水配制，母液浓度为100

毫克/毫升。

4、50mmol/L CaCl2溶液：称取无水氯化钙2.8克，加重蒸馏水500毫升，分

装于150毫升三角烧瓶中，每瓶50毫升，灭菌20分钟。

5. X-Gal: 20mg X-Gal/1ml DMF (二甲酰胺溶解) ，－20℃保存。

6. IPTG: 24 mg IPTG/1ml （灭菌水溶解），滤菌过量，－20℃保存。

【操作方法】

一、DNA的连接

（参见T-vector实验手册）

二、受体感受制备：

1．取一环新鲜的E.coli DH 5α菌落于2毫升LB试管中，在37℃振荡培养过夜（约16小时）。

2．取0.3毫升上述菌液（O.D600 ?1.5）转接到30毫升LB三角烧瓶中（接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右），振荡培养2-2.5小时（OD600 =

0.2-0.4）。

3．取1毫升测OD，余下的菌液于冰浴10分钟，4000rpm离心5分钟，收集菌体。

4．把菌体悬浮在50mmol/L预冷的CaCl2中（约10毫升左右），冰浴10分钟，4000rpm,离心5分钟，收集菌体。

5．再将菌体悬浮在1-2毫升的50mmpl/L冷CaCl2中。使菌液浓缩15倍（30毫升→2毫升），置冰水浴上作为转化用的受体菌菌液（即感受态细胞）。

三、细菌转化：

1．用预冷的Tip头，分装200μl感受态细胞至预冷的Eppedorf管中。

2．加入10 μl（重组）质粒DNA。

3．将Eppedorf管用手弹匀，于冰水浴30分钟至1小时以上，在这个过程中，可轻轻摇动Eppedorf管2-3次，以防菌体沉积在管底，但振荡不要太激烈

和次数太多，以免影响已连接好的DNA在受体表面的吸附。

4．将Eppedorf管转入42℃水浴１分钟，这种受体菌极短暂的热刺激，有利于DNA的吸附，提高转化效率。

5．再于冰浴2分钟，然后再向管中加入900微升LB溶液混匀，37℃水浴或摇1个小时（LB培养液中不要加抗菌素，以利于转化表达）。

6．于5000rpm, 离心5分钟，弃上清，用10 μl升LB悬浮沉淀，重组转化可多加至400微升。

（四）倒皿铺平板：

1．在预制的LB琼脂的平板上（含50μg/ml氨苄青毒素），加20μl的X-gal （20mg/ml）和4μl IPTG （24mg/ml）溶液，并用灭菌玻璃推子（酒精

灯上烧后冷却），均匀涂布于琼脂凝胶表面。

2．将已转化的感受细胞均匀涂在平皿上，将平皿放置在37℃温箱30min，至菌液被培养基吸收。

3．倒置平皿37℃，培养12-16h，至菌落出现，其中白色菌落含重组DNA 质粒。

【要点提示】

1、受体菌培养时间为OD550=0.2-0.3(5-6×108细胞/毫升)最好，也是转化的关键。

2、转化所用的试剂如CaCl2要求很高，要注意试剂质量与浓度。一般50-100

mmol/L CaCl2处理可获得最高转化率。

3、菌体在溶液的pH为6.0时最适宜。

4、转化操作用的Tip头和离心管必须经4℃预冷。

5、受体菌细胞与DNA浓度之比为：1.6×108细胞：1ng。连接DNA的体积

至少是感受态细胞体积的5%，多余的连接液可存于-20℃，有需要转化时再用。

6、受体菌细胞与DNA混合培养时间为1小时最佳。

7、从-70℃贮存的原始菌种进行培养制备感受态，转化效率高。

8、感受态细胞十分的脆弱，应避免不必要的搅动、离心和震荡。

9、受体菌对表面活性剂非常敏感，用的玻璃、塑料器皿都必须严格冲洗。

10、连接后的DNA溶液与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果

温度时高时低，转化效率将极差。

11、42℃热处理也是关键，动作要快，水浴温度要准确。

12、DNA连接液的盐浓度较高，与细胞混合时要加以稀释，因为高盐浓度会影

响转化率。

13、所有的菌液涂皿操作，只需一根玻璃涂布棒，用95%酒精在火焰下灭菌冷

却后即可用。注意避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，

过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。