SDS蛋白电泳相关试剂配方
高低分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol ................................................................... - 2 - 1实验材料........................................................................................................................... - 2 -
1.1标本采集................................................................................................................ - 2 -
1.2主要试剂：............................................................................................................ - 2 -
1.3主要仪器设备及软件：........................................................................................ - 3 -
2实验方法........................................................................................................................... - 3 -
2.1标本采集................................................................................................................ - 3 -
2.2主要溶液配制........................................................................................................ - 3 -
2.3蛋白质样品制备.................................................................................................... - 7 -
2.4Bradford法蛋白质定量 ......................................................................................... - 8 -
2.5SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 ......................................................................... - 9 -
2.6等浓度混合低分化腺癌组（Pp）高分化腺癌组（Wp） ................................ - 10 -
2.7双向凝胶电泳（IEF+SDS-PAGE）................................................................... - 10 -
2.7.1第一向是等电聚焦电泳（isoclectric focusing，IEF）.................................. - 10 -
2.7.2第二向SDS-PAGE电泳.................................................................................. - 11 -
2.8图像分析.............................................................................................................. - 13 -
2.9差异蛋白点的切取.............................................................................................. - 13 -
高低分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析
Protocol
1实验材料
1.1标本采集
3例人高分化胃腺癌及3例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本（2009年4月-10月），并经病理检查确诊（WHO分型），所取组织没有出血和坏死。临床资料及存储见表一。
表一：6例胃癌标本病例资料
1.2主要试剂：
超纯尿素（urea）, 十二烷基磺酸钠(SDS)，丙烯酰胺(acrylamide)，甲叉-双丙烯酰胺(Ｎ, Ｎ’-methylenebisacrylamide)，pH 3-10固相化非线性17 cm干胶条(IPG strip), IPG缓冲液（PH3-10NL，17cm）、两性电解质（Bio-Lyte,pH3-10）、甘氨酸(glycine)、Tris碱、CHAPS(两性离子去垢剂)购自美国Bio-Rid公司；硫脲（sulfocarbamide）均购自sigma公司；蛋白酶
抑制剂complete EDTA –free购自美国罗氏公司；过硫酸铵(APS)，，二硫苏糖醇(DTT),碘乙酰胺(indoacetamide),，均购自上海生工。考马斯亮蓝G-250购自鹏程分装Amersco、四甲基乙二胺(TEMED)购自鹏程Sigma分装,小牛血清蛋白（BSA）购自北京索莱宝封装Roche。甘油、甲醇、乙醇、冰乙酸、盐酸、磷酸等均购自国产分析纯试剂。
1.3主要仪器设备及软件：
Bio-Rad proteinIEFcell型等电聚焦仪（Bio-Rad公司产品）
Bio-Rad proteinⅡXI cell型垂直电泳槽（Bio-Rad公司产品）
PDQuest 7.0软件（Bio-Rad公司产品）
低温循环水浴箱
凝胶成像系统（）
台式低温高速离心机
水平脱色摇床
电子精密天平（国产）
液氮罐
超低温冰箱（-80℃）（Thermo公司产品）
超声破碎仪
酶标仪
去离子水系统
高温高压消毒锅
电热恒温鼓风干燥箱
磁力搅拌器
PH测定仪
去离子水系统
可调式微量移液器：1000ul、200ul、20ul、2.5ul规格各两支
2实验方法
2.1标本采集
3例人高分化胃腺癌及3例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本。胃癌手术中取下肿瘤组织后，切取约2g(2×2×3cm3)大小的胃癌组织，所取组织剔除结缔组织，于冰盐水或预冷的PBS液清洗干净，滤纸吸去多余液体，分切成5份装入2mL冻存管内，标记后立即放入液氮罐内，此过程在组织离体30分钟内完成。实验前转移至-80℃冰箱备用。记录患者姓名、性别、年龄、住院号、取材时间、癌灶位置、组织分型、TNM分期、临床分期。
2.2主要溶液配制
PBS缓冲液
试剂含量
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44
KH2PO4 0.27
超纯水定容至1000ml
HCl调PH至7.4，高压消毒，室温保存。
蛋白酶抑制剂Complete EDTA-free 分装：
25×cocktail：
试剂含量
cocktail 1片（泡50ml）
去离子水2ml
-20℃保存
10ml蛋白质裂解液（lysis buffer）
试剂浓度含量
尿素8M 4.8048g
硫脲2M 1.522g
CHAPS 4% 0.400g
Tris 40mM 0.0485g
超纯水定容至10ml
溶解混匀后每EP管分装1ml, -20℃保存,使用时不可反复冻融，用时每1ml分装管中现加: 试剂浓度含量
25×cocktail 4% 40ul
DTT 65mM 0.01g
BioLyte 2% 5ul(0.2%)
Bradford染色液（储备液）
试剂含量
95%乙醇50ml
88%磷酸100ml
考马斯亮蓝G250 100mg
4℃避光保存，使用前滤纸过滤
Bradford染色液（工作液）
试剂含量
Bradford储备液30ml
超纯水定容至200ml
滤纸过滤后避光室温保存
牛血清白蛋白（BSA）储存液（1mg/ml）
试剂含量
牛血清白蛋白10mg
超纯水定容至10ml
溶解混匀后每EP管分装1ml,- 20℃保存。
30%聚丙烯酰胺贮液
试剂含量
丙烯酰胺150g
甲叉双丙烯酰胺4g
超纯水500ml
滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存
1.5mol/L Tris碱pH8.8
试剂含量
Tris碱90.75g
超纯水400ml
用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。
1M Tris-HCl pH6.8
试剂含量
Tris碱121.1g
超纯水800ml
用1mol/L HCl调pH至6.8，加MilliQ水定容至1000ml。4℃冰箱保存。
0.5mol/L Tris碱pH6.8
试剂含量
Tris碱12g
超纯水120ml
用1mol/L HCl调pH至6.8，加MilliQ水定容至200ml。4℃冰箱保存。
10% SDS
试剂含量
SDS 10g
超纯水100ml
混匀后，室温保存。
10% Ap
试剂含量
过硫酸铵（APS）0.1g
超纯水1ml
溶解后，4℃冰箱保存。
10×电泳缓冲液（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）
试剂含量
Tris碱30g
甘氨酸144g
SDS 10g
超纯水1L
混匀后，室温保存。
1%溴酚蓝
试剂含量
溴酚蓝0.01g
超纯水1ml
避光室温保存
2×SDS-PAGE上样缓冲液
试剂含量
0.5M pH6.8 Tris碱 2.0ml
10% SDS 4.0ml
甘油 2.0ml
1% 溴酚蓝0.05ml
超纯水定容至10ml
DTT 0.154g(用时现加)
水化上样缓冲液
试剂浓度含量
尿素7M 4.0g
硫脲2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g
超纯水定容至10ml
溶解混匀后每EP管分装1ml, -20℃保存,使用时不可反复冻融，用时每1ml分装管中现加: 试剂浓度含量
DTT 65mM 0.01
Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5μl（40%）
溴酚蓝0.001% 1ul(1%溴酚蓝)
胶条平衡缓冲液母液
试剂浓度含量
尿素6M 36g
SDS 2% 2g
Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油20% 20ml
超纯水定容至100ml
分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存
胶条平衡缓冲液I
试剂含量
胶条平衡缓冲液母液10ml
DTT 0.2g
充分混匀，用时现配。
胶条平衡缓冲液II
试剂含量
胶条平衡缓冲液母液10ml
碘乙酰胺0.25g
充分混匀，用时现配
低熔点琼脂糖封胶液
试剂浓度含量
低熔点琼脂糖0.5% 0.5g
Tris 25mM 0.303g
甘氨酸192mM 1.44g
SDS 0.1% 1ml（10% SDS）
溴酚蓝0.001% 100μl（1%溴酚蓝）
超纯水定容至100ml
加热溶解至澄清，室温保存
考马斯亮蓝G250染色液
试剂浓度含量
Coomassie Blue G-250 0.1% (w/v) 1.0 g
甲醇40% (v/v) 400 ml
冰醋酸10% (v/v) 100 ml
超纯水定容至1000ml
避光室温保存
考马斯亮蓝染色脱色液
试剂浓度含量
甲醇40% (v/v) 400 ml
冰醋酸10% (v/v) 100 ml
超纯水定容至1000ml
室温保存
2.3蛋白质样品制备
实验用品：眼科剪、镊子、组织匀浆器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP管、冰盒、冰袋、玻璃培养皿、电子天平、超声破碎仪、超速低温离心机、水平摇床、可调式微量移液器：1000ul、200ul、20ul、2.5ul规格各两支
实验试剂：尿素、硫脲、CHAPS、Tris、超纯水、蛋白酶抑制剂Complete EDTA-free、DTT、Bio-Lyte
实验标本：低分化腺癌组（poorly）3例：以住院号后四位标记2007、3253、4423，高分化腺癌组（well）3例：以住院号后四位标记：6003、0010、1295
将干净的眼科剪、镊子、组织匀浆器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP管、冰盒、冰袋、玻璃培养皿-20℃冰箱预冷。
从-80℃取出2007号标本，室温下解冻，冰盒上放置玻璃培养皿眼科剪剪取米粒大小，称取约100mg组织，放置在冰浴状态下的EP管中，加入500ul蛋白质裂解液，眼科剪迅速将组织剪成肉糜状，再用一次性塑料小研磨棒快速充分研磨1min，直至管内物质变成组织悬浊液。
应用超声细胞破碎仪在冰浴下进行细胞破碎，运行120S（80w,超声1s,间隙3s，30个循环）。尽可能少产生泡沫，4℃保存。
裂解完毕后，4℃下，18000rpm,离心40min。
用微量移液器小心吸取上清注入EP管中，混匀后，50ul分装，-80℃冻存备用。
其他5例样本3253、4423、6003、0010、1295依次按照上述步骤提取蛋白，注意提取每例样本时要用75%酒精将培养皿，眼科剪、镊子等接触样本的器械擦洗干净。用超纯水清洗超声探头，滤纸擦拭干净。
2.4Bradford法蛋白质定量
实验用品：12各清洁的EP管、12支清洁的15ml离心管、离心管架、96孔板，可调式微量移液器：1000ul、200ul各一支、电子天平
实验试剂：牛血清白蛋白（BSA）储存液（1mg/ml）、Bradford染色液（工作液）、超纯水
实验标本：50ul分装的2007、3253、4423、6003、0010、1295六例标本各一管
在12支EP管上和12支离心管上标记：1、2、3、4、5、6、2007、3253、4423、6003、0010、1295，各管按下表所示依次加入各试剂
序号BSA（ul）超纯水(ul) 混匀取出量
(ul) Bradford染色
工作液(ml)
浓度(mg/ml)
1 0 1000 100 5 0
2 200 800 100 5 0.2
3 400 600 100 5 0.4
4 600 400 100
5 0.6
5 800 200 100 5 0.8
6 1000 0 100 5 1 200
7 5 95 100 5
3253 5 95 100 5
4423 5 95 100
6003 5 95 100 5
0010 5 95 100 5
1295 5 95 100 5
轻微摇匀加入Bradford染色工作液的离心管，静置约20min后，各管吸取吸3次，每次吸取200ul纵行排列加入到96孔板中的3个孔中。
将加好蛋白样品的96孔放入酶标仪中，读取OD595的吸光值。计算每管的平均值。
在EXCEL中以标准管的蛋白量为Y轴，吸光值为Y绘制标准曲线。
2.5SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验用品：“六一”大槽电泳仪、100ml烧杯3个、水平摇床、电子天平、可调式微量移液器：5ml、1000ul、200ul、20ul、2.5ul规格各两支、EP管若干、水浴锅、染色盘、脱色盘、长针头、滤纸
实验试剂：30%聚丙烯酰胺贮液、1.5mol/L Tris碱pH8.8、1mol/L Tris碱pH6.8、10%SDS、10% Ap、TEMED、10×电泳缓冲液、1%溴酚蓝、2×SDS-PAGE上样缓冲液、考马斯亮蓝G250染色液、考马斯亮蓝染色脱色液
实验样品：2007、3253、4423、6003、0010、1295蛋白各300g、Mark100ul
温水浴溶解结晶的10%SDS；洗净晾干电泳槽、玻璃板（干净透光不挂水珠）、安装固定电泳装置，用5ml移液器加入20ml水，观察是否漏水，若装置严密不漏水，将水倒尽，开始配胶。
配制12%分离胶
试剂含量（80ml）
超纯水26.4
30%聚丙烯酰胺贮液32
1.5M Tris(pH 8.8) 20
10%SDS 0.8
10%AP 0.8(现加)
TEMED 0.032（现加）
灌分离胶：混匀分离胶后，每侧玻璃板中灌40ml，用5ml移液器沿玻璃板一侧缓缓加入，避免气泡产生（若有气泡可用长针头挑去）。
封胶：用正丁醇（或异丙醇、或超纯水水）封胶，用5ml移液器沿玻璃板一侧缓缓加入，加满。
聚合：静置40min-60min(可过夜)。待分离胶凝固后，将正丁醇（或异丙醇、或超纯水）倒尽，用超纯水清洗胶顶部数次，滤纸吸净水。
配制5%积层胶
试剂含量（20ml）
超纯水13.6
30%聚丙烯酰胺贮液 3.4
1M Tris(pH6 .8) 2.5
10%SDS 0.2
10%AP 0.2(现加)
TEMED 0.02（现加）
灌积层胶：混匀分离胶后，每侧玻璃板中灌10ml，用5ml移液器沿玻璃板一侧缓缓加入，灌满，避免气泡产生（若有气泡可用长针头挑去）。插入梳子。
聚合：室温静置聚合30min。
变性：从-80℃冰箱中取出2007、3253、4423、6003、0010、1295蛋白样品各300g，等体积1：1加入样品及2×SDS上样缓冲液（或4：1加入样品及5×SDS上样缓冲液），将加好上样缓冲液的蛋白样品及Mark沸水浴煮3min变性（插入冰浴冷却后加样）。
拔梳子，超纯水清洗加样空，用针头拨正加样空。
将10×电泳缓冲液稀释成1×电泳缓冲液，加满电泳槽内槽，外槽加至槽的1/5。
加样：将2007、3253、4423、Mark、6003、0010、1295自左向右加入加样空，其余孔加入等体积的上样缓冲液。
检查一下电路连通状况（注意正负及），接通电源，以电压为标准：起始时用低电压（80V），待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后(约30min)，再加大电压(350v)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到25mA/gel。
电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，在左上角切角以作记号，取出凝胶（将玻璃板斜立在盛有超纯水的染色盘中，用铲胶器撬起一小块凝胶浸入水中，靠水的张力缓慢取出凝胶，防止凝胶破碎），（戴手套，防止污染胶面）。
染色：加入足量的考马斯亮蓝G-250染液，于水平摇床上染色60分钟。染色结束后弃去染色液。
脱色：加入脱色液，在水平摇床上脱色，直至背景脱净为止（注意观察，防止脱色过渡或不全）。
保存：可用10%的冰醋酸保存。
成像：凝胶成像系统成像并保存图像（tif、jpg两种格式）。
2.6等浓度混合低分化腺癌组（Pp）高分化腺癌组（Wp）
低分化腺癌组（poorly）3例：2007、3253、4423，以蛋白浓度最低的样本为标准，用蛋白质裂解液稀释其余两管，使3管样本蛋白浓度一致，等体积混合800ug，以Pp(poorly pooling)表示。
高分化腺癌组（well）3例：：6003、0010、1295，按上述方法等体积混合800ug,以Wp(well pooling)表示。
2.7双向凝胶电泳（IEF+SDS-PAGE）
2.7.1第一向等电聚焦电泳（isoclectric focusing，IEF）
实验用品：Bio-Rad proteinIEFcell型等电聚焦仪、聚焦盘、水化盘、镊子、可调式微量移液器：1000ul、200ul、规格各一支、电子天平、EP管
实验试剂：水化上样缓冲液、DTT、Bio-Lyte、IPG预制胶条（pH3-10,17cm）、矿物油
实验样品：Pp组800ug ；Wp组800ug
洗净、晾干聚焦盘或水化盘。
从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。
在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 5μl（40%），充分混匀。
从小管中取出水化上样缓冲液，加入800μg样品、并加入1.75ul IPG Buffer,共350ul充分混匀。
从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 3-10），于室温放置10分钟.
沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
等电聚焦程序设置
17cm胶条
水化50V 12-16小时（20℃）主动水化
S1 250V 线性30min 除盐
S2 1000V 快速1h 除盐
S3 10000V 线性5h 升压
S4 10000V 快速60,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
设置每根胶条的极限电流。（20μA/根）（注意：17cm胶条的极限电流不超过50μA/根，最
好也在30μA/根以下）
设置等电聚焦时的温度。（20℃）
聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-80℃冰箱保存。
2.7.2第二向SDS-PAGE电泳
实验用品：Bio-Rad proteinⅡXI cell型垂直电泳槽、低温循环水浴箱、溶胀盘、镊子、100ml
烧杯3个、水平摇床、电子天平、可调式微量移液器：5ml、1000ul、200ul、20ul、2.5ul规
格各一支、EP管若干、水浴锅、染色盘、脱色盘、长针头，滤纸
实验试剂：实验试剂：30%聚丙烯酰胺贮液、1.5mol/L Tris碱pH8.8、10%SDS、10% Ap、TEMED、胶条平衡缓冲液母液、DTT、碘乙酰胺、低熔点琼脂糖封胶液、10×电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250染色液、考马斯亮蓝染色脱色液
实验样品：第一向等电聚焦好的Pp组胶条；Wp组胶条
温水浴溶解结晶的10%SDS；洗净晾干制胶器、溶胀盘、玻璃板（干净透光不挂水珠）、安装固定电泳装置，用5ml移液器加入20ml水，观察是否漏水，若装置严密不漏水，将水倒尽，开始配胶。
配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用超纯水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
试剂含量（80ml）
超纯水26.4
30%聚丙烯酰胺贮液32
1.5M Tris(pH 8.8) 20
10%SDS 0.8
10%AP 0.8(现加)
TEMED 0.032（现加）
待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的超纯水、乙醇或水饱和正丁醇，用超纯水冲洗。
从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
配制胶条平衡缓冲液I。
在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用超纯水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。
将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
配制胶条平衡缓冲液II。
第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完
全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
检查一下电路连通状况（注意正负及），接通电源，以电压为标准：起始时用低电压（80V），待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后(约30min)，再加大电压(350v)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到25mA/gel。
电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，在左上角用200ul枪头打孔以作记号（Pp组打1个孔，Wp打2个孔），取出凝胶（将玻璃板斜立在盛有超纯水的染色盘中，用铲胶器撬起一小块凝胶浸入水中，靠水的张力缓慢取出凝胶，防止凝胶破碎），（戴手套，防止污染胶面）。
染色：加入足量的考马斯亮蓝G-250染液，于摇床上染色60分钟。染色结束后弃去染色液。
脱色：加入脱色液，在摇床上脱色，直至背景脱净为止（注意观察，防止脱色过渡或不全）。
保存：可用10%的冰醋酸保存。
成像：凝胶成像系统成像并保存图像（tif、jpg两种格式）。
2.8图像分析
凝胶经成像后经Pdquest图形分析软件对2-DE图谱进行了分析
通过蛋白点自动检测(spot detection)和手工标记取点获得蛋白质点检测图;
利用背景扣除(background deduction)消减部分背景条纹;
进行第一向等电点校正(correction)和第二向分子量校正;
选取一张凝胶图作为参考凝胶(refrence gel),其余图谱与之进行配比,生成凝胶分析报告,并进行手工修正.从凝胶分析报告中可以获得蛋白点的等电点,分子量,蛋白质表达量及凝胶之间的点匹配率等信息.。
2.9差异蛋白点的切取
结合软件分析和手工筛选，从有或无和表达差异蛋白质点中的选取若干个清晰且表达水平改变明显的蛋白质点作为最终质谱鉴定的对象。
将200ul的枪头按蛋白点的大小剪掉枪头尖，垂直对准差异点切取，放入洁净的EP管中，标记好，4℃冰箱保存。尽快送公司鉴定。
其余胶放入干净的保鲜袋4℃冰箱保存。
将保存差异蛋白点的EP管封口膜分好，装在封口袋中，放在装有冰袋的保温盒中尽快寄送往上海博苑质谱鉴定公司鉴定。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
sds-page蛋白电泳分析
实验二SDS－PAGE 蛋白电泳分析 一、目的 掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法 二、电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 三、试剂配制 1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。 2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。 1.5M：Tris 碱18.15g 去离子水80ml 浓盐酸调PH 值8.8 加去离子水定容至100ml 3．1 M DTT：称取3.09 g DTT，加入到50 ml 塑料离心管内，加20 ml 的0.01 M NaOAc （pH5.2)，溶解后使用0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。 4．10% SDS: 20g SDS 溶于200ml 纯水中。
SDS-PAGE电泳标准操作流程
SDS-PAG电泳标准操作规程（网上） 3. 程序: 端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2分离胶的配置 3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板 梳齿下缘约1cm）。 3.1 . 2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面 变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸 吸干残留的水液。 3.1.3浓缩胶的配置 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。 3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹 形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与 贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 pl的样品，依次加上20Q 5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。 对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。 3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10 p l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加 入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移 动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时, 完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间 约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5. 拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到 扫描仪上，拍照。 4. 注意事项 4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%交；50KD-30KD选用12%胶； 30KD-10KD选用15%交。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。 4.6 分离胶高度控制得当，确保 有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。 4.7 电泳染色液注意进行回收再利用， 一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，
加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作
SDSPAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂 1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH 2 O， 37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH 2 O溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH 2 O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，?-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g， 甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰 1.0 mL，ddH 2 O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R 2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH 2 O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH 2 O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH 2 O 4mL，30%储备胶5 mL， 4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH 2 O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL， 10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
血清蛋白电泳操作规程
血清蛋白电泳 一．项目名称 血清蛋白电泳（HYDRAGEL PROTEIN） 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶区带电泳 三．方法学原理 蛋白电泳是临床实验室中一种常用的蛋白质剖析技术。它可以对血清或其他体液中的异常蛋白质进行筛选。它是以区带电泳为基础在一种合适的支持介质—琼脂糖上进行的电泳。血清蛋白质在给定的PH条件下主要根据其所带电荷数将其分离成五种片段：白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白，每一区带含有一种或多种血清蛋白质。 四．方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。血清蛋白区带电泳是在临床实验室中常用的技术之一，可定性和/或半定量各条正常或异常蛋白区带。 五．仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二）分析和计算参数： 1．处理量：约162个样本/小时 2．所需样本量：10ul 3．检验时间：约半小时 4．重复性：有良好的批内和批间重复性 5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 15 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 30 PROTEIN(E)试剂盒 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：70测试/150测试/300测试 （3）货号：PN4100/ PN4120/ PN4140 2．脱色液 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 10×100ml （3）货号：PN4540 (4) 成分：柠檬酸
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 简介： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE)，其原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE 凝胶，也可配制非变性(native)PAGE 凝胶，具体配制的量应根据器具大小决定。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制10%过硫酸铵：直接在Ammonium Persulfate 中加入蒸馏水，充分溶解，分装 成小份储存于-20℃或4℃。注意：一般用1.5mlEP 管分装成0.5-1ml 每支，-20℃保存，每支使用2-3次即弃用。短期使用时，可保存于4℃，1周有效。 2、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶(下层胶)： 不同浓度的SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围： SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 成分 配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积(ml) 编号 名称 PE0018 30T Storage 试剂(A): 30% Acr-Bis(29:1) 100ml 4℃ 避光 试剂(B): 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 100ml RT 试剂(C): 10% SDS 5ml RT 试剂(D): Ammonium Persulfate 0.5g RT 试剂(E): TEMED 2×1ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
SDS-PAGE试剂配方
SDS-PAGE电泳所用溶液： 30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL) 丙烯酰胺(Arc) 29 g N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1 g 用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放 丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。 5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L) Tris碱15.1 g 甘氨酸(电泳级) 94 g 10 %SDS 50 mL 使用时稀释5倍使用 2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL) 0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL 10％(W/V)SDS 4 mL 甘油 2 mL β-巯基乙醇 1.0 mL (DTT（二硫苏糖醇）0.31g) 溴酚兰0.02g 双蒸水0.5 mL 室温存放备用 考马斯亮蓝染色液 考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g 甲醇450 mL 冰醋酸100 mL ddH2O 450 mL 0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用 考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性） 甲醇100 mL 冰醋酸100 mL ddH2O 800 mL 医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)
SDS-PAGE所需溶液: A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。 B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约 3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。 C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。 D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。 E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。 F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳 一简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选
TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上
SDS-PAGE-蛋白电泳分析
SDS－PAGE 蛋白电泳分析 一、目的 掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法 二、电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 三、试剂配制 1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。 1.5M：Tris 碱18.15g 去离子水80ml 浓盐酸调PH 值8.8 加去离子水定容至100ml 3．1 M DTT：称取3.09 g DTT，加入到50 ml 塑料离心管内，加20 ml 的0.01 M NaOAc （pH5.2)，溶解后使用0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。 4．10% SDS: 20g SDS 溶于200ml 纯水中。 5．10% 过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于10ml 纯水中，现用现配。 6．2×SDS 上样缓冲液：1.0 mol/L Tris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS 40ml，50%甘油40ml，0.2g 溴芬蓝，定容至100ml。 7．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，3g Tris 碱和18.8g 甘氨酸，加入10ml 10%SDS，用去离子水补至100ml，配制成10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液；取50ml 10×缓冲液，稀释至500ml，配制成工作浓度1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 8．考马斯亮蓝R250 染色液：1gR250 溶于250ml 异丙醇、100ml 冰乙酸和650ml 去离子水的混合液中，过滤去除颗粒状物。 9．脱色液：乙醇/水/冰乙酸分别为50ml,850ml 和100ml。 四、实验方法 1．10%分离胶的配制7ml(小板为5ml)：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，加水封胶待凝固。
SDSPE电泳试剂配制
S D S P E电泳试剂配制集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
SDS-PAGE电泳试剂 1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀 O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 后加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至,定容至 2) 1.5M Tris-HCl(pH ：Tris 18.17g加ddH 2 100mL； O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100 3) 1M Tris-HCl(pH ：Tris 12.11g加ddH 2 mL； 4) 4分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HCl(pH ，定容至100mL； 5) 4浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HCl(pH ，定容至100mL； O溶解, 6) 10电泳缓冲液(pH ： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH 2 定容至100mL； O至10mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH 2 8) 2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH ，-巯基乙醇，SDS 0.6g，甘油mL，%溴酚兰 mL，ddH O ； 2 1.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R 250 ddH O 225mL； 2 O以2∶1∶7配制而成； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH 2 11) 分离胶%): ddH O 4mL，30%储备胶5 mL， 4分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 2 (现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； O ，30%储备胶，4浓缩胶缓冲液， 10%Aps 50μL，12) 浓缩胶（5％）：ddH 2 TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
SDS-PAGE凝胶电泳
蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二原理 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三试剂和器材 试剂：1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液） 3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用 4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED） 8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2×样品稀释液：SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四操作步骤 1分离胶制备： 凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵ml 0.1 TEMED (μL) 20 将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形
小分子蛋白电泳技术分享
Tricine SDS-PAGE实用方案 Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。 一、试剂配配制： 1．Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C） Acylamide 48.0g Bis 1.5g Water make up to 100ml 2. High Bis acrylamide (49.5% T, 6% C) Acrylamide 46.5g Bis 3.0g Water make up to100ml 3. Gel Buffer (3M Tris/cl, PH8.45, 0.3% SDS) SDS 0.3g Tris 36.4g Water make up to 100ml PH to 8.45 with HCL 注: 3M Tris 配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2M Tris,配方如下: Tris 36.4g SDS 0.3g Water make up to 150ml 4. Anode (Lower) buffer 阳极缓冲液(0.2M Tris/cl, PH8.9) Tris 12.11g Water make up to 500ml PH to 8.9 with HCL 5. Cathode (Upper) buffer 阴极缓冲液(0.1M Tris/cl, 0.1M Tricine, 0.1% SDS, PH 8.25) Tris 6.06g Tricine 8.96g SDS 0.5g Water make up to 500ml
注:不用调PH值 6. 4×Tricine SDS Sample buffer 4×上样缓冲液 (Final concentration: 0.05M Tris/cl, 4% SDS, 12% glycerol, 200mM DTT, 0.01% Commasie G 250) 8×Tris.cl/SDS PH 6.8 2ml Glycerol 4.8ml SDS 1.6g Commasie Blue G 250 4mg Water make up to 10ml 注:8×Tris.cl/SDS PH 6.8配方 Tris 6.05g SDS 0.4g Water make up to 100ml PH to 6.8 with HCL 二、胶的配制 1. 16.5% T 6% C separating gel 30ml 49.5% T 6% C 10ml Gel buffer 15ml Glycerol 3.2ml Water 1.8ml 2. 10% T 3% C spacer gel 30ml 49.5% T 3% C 6.1ml Gel buffer 15ml Water 8.9ml 3. 4% T 3% C stacking gel 12.5ml 49.5% T 3% C 1ml Gel buffer 4.65ml Water 6.85ml 注: 用Bio-Rad系统, 0.75mm的胶,separating gel 配3ml, 加2.5ml; Spacer gel 配1ml,加0.7ml; Stacking gel 配1.25ml. 灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED. 胶配制的通用配方:
SDS-PAGE电泳实验步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH 的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 实验 原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE 是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、 快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来 进行分离的。 SDS 是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折 叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。 SDS 蛋白质复 合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂 和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分 子量。 试剂和器材： 试剂： 1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基 乙醇， 1ml 1% 溴酚蓝， 0.9ml 蒸馏水。可在 4℃保存数周，或在 －20 ℃保存数月。 2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺 30g ，甲叉双丙烯酰胺 0.8g ，加重蒸水溶解后，定容到 100ml 。过滤后置棕色瓶中， 4℃ 保存，一般可放置 1个月。 3. pH8.9 分离胶缓冲液：Tris 36.3g，加1mol/L HCl 48ml，
加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH8.9 ，定容至 100ml ， 4℃保存。 4. pH6.7 浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加 1mol/L HCl 48ml ，加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH 6.7 ，定容至 100ml ， 4℃保存。 5.TEMED （四乙基乙二胺）原液 6.10% 过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7.pH8.3 Tris- 甘氨酸电极缓冲液：称取 Tris 6.0g ，甘氨酸 28.8g ， 加蒸馏水约 900ml ，调 pH8.3 后，用蒸馏水定容至 1000ml 。置4℃保存，临用前稀释 10 倍。 8.考马斯亮蓝G250 染色液：称100mg 考马斯亮蓝G250 ，溶于200ml 蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70% 的过氯酸，最后补足水到250ml ，搅拌 1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作
SDS-PAGE电泳分析表达蛋白
试验三SDS-PAGE电泳分析表达蛋白 一、实验目的与要求 1. 掌握SDS-PAGE电泳的操作步骤。 2. 学会用电泳图分析原核表达效果 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小。 三、实验材料与试剂 诱导表达后的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳试剂，蛋白上样缓冲液等。 四、实验仪器设备 伯乐蛋白电泳仪，细菌振荡培养箱、高压灭菌锅、电子天平，电炉，量筒等。 五、实验步骤 1、SDS-PAGE凝胶电泳试剂 1）1.0 M Tris/HCl溶液（pH 6.8）：121 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至6.8，定容至1 L； 2）1.5 M Tris/HCl溶液（pH 8.8）：182 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至8.8，定容至1 L； 3）30 %丙烯酰胺溶液：292 g丙烯酰胺和8 g甲叉双丙烯酰胺溶于900 mL蒸馏水中，定容至1 L，4 ℃避光贮存待用； 4）5×电泳缓冲液（pH 8.3）：94 g 甘氨酸和15.1 g Tris溶于800 mL蒸馏水中后，加入50 mL 10 % SDS溶液，定容至1 L，常温贮存，用时用蒸馏水稀释至1倍缓冲液； 5）上样缓冲液：4 mL 10 % SDS溶液，0.2 mL巯基乙醇，1 mL 1.0 M Tris缓冲液，然后加入2 g甘油，20 mg溴酚蓝，充分溶解后定容到20 mL，4 ℃贮存待用； 6）染色液：1.0 g 考马斯亮蓝（R250），100 mL冰醋酸，450 mL 甲醇混合，定容至1 L，充分混匀备用； 7）脱色液：乙酸100 mL，甲醇300 mL，加水定容到1 L； 8）10 %过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵加入1 mL 蒸馏水充分溶解，需现配现用。 2、SDS-PAGE凝胶电泳试剂 1）利用12 %的分离胶进行SDS-PAGE进行电泳 2）配制12 %的分离胶（10 mL）
sdspage电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂 1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0, 定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备 1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。 2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。 3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M