几种优质产油真菌的筛选及发酵工艺研究

分类号TQ920.6

密级GK 学位代码307学校代码10298

学号3060103

南京林业大学研究生硕士学位论

文

论文题目:几种优质产油真菌的筛选及发酵工艺研究

作

者:耿青伟专业:微生物学

研究方向:资源微生物

指导教师:吴小芹

教授李纪元研究员

二○○九年六月

致谢

时光如水、岁月如梭，三年的时光转瞬即逝。三年来，备受老师、同学的厚爱，谨在此表达我的感激之情。

本文是在导师吴小芹教授的悉心关怀和指导下完成的。导师渊博的学识，独特的见解，严谨的治学态度，对事业和理想的执着追求给我留下了深刻的印象,这些都将使我受益终生。三年来,无论在学习上,还是生活上,都得到了导师无微不至的帮助。在论文完成之际，谨向导师表示无比的敬意和衷心的感谢！

本研究是在中国林科院亚热带林业研究所园林植物遗传育种与分子生物学课题组完成的，试验过程中得到了本课题组李纪元研究员和吴开云副研究员的悉心指导和帮助，同时田敏副研究员、范正琪老师和李辛雷老师等都给予我各方面的支持，为我顺利完成学业提供了很大的帮助，在此向他们送上我最真挚的感谢和祝福。感谢有幸同在一个研究小组里共同学习和工作的范妙华师姐、张晓庆师姐、刘明静、平秀敏、陈东亮、王凌给与我的帮助和支持，在此一并祝愿他们学业有成，前程似锦！

在论文研究中遇到很多问题和困难，病理组的任嘉红博士提供了无私的帮助，在此表示衷心的感谢！

特别感谢我的亲人和朋友，他们对我的希望和爱是我永远的动力，陪伴我度过了这充满艰辛、充满收获的三年。

感谢所有给予我关心和帮助的人！

作者：耿青伟

2009年5月于南京

摘要

本研究对12种真菌的产油能力进行了筛选，根据油脂得率和脂肪酸提取效果确定了一种简单高效的油脂提取方法，并在此基础上对筛选获得的2种高效产油真菌的发酵工艺条件进行了优化研究。结果表明，在供试的12种真菌中，有5种真菌的产油能力较高，其中深黄被孢霉（Mortierella isabellina）和拉曼被孢霉（Mortierella ramanniana）油脂含量分别为24.25%和21.66%，总枝毛霉（Mucor racemosus）含油量为18.74%，斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）和胶粘红酵母（Rhodotorula glutinis）的油脂含量分别为19.07%和18.01%，其它各菌种含油量均低于11%。对四种真菌脂肪酸成分分析表明，脂肪酸以C16和C18为主，其中油酸（C18:1w9）含量最高，C16~C18系脂肪酸含量均超过90%。以高效产油的深黄被孢霉和斯达氏油脂酵母为试验菌株，分析比较了酸热法、索氏提取法和有机溶剂法的油脂提取效果。结果表明，酸热法操作简单，样品处理能力强，对C16~C18系脂肪酸提取效果最好，有机溶剂法油脂提取效果最差。通过单因素和正交试验方法对深黄被孢霉和斯达氏油脂酵母的发酵培养条件（碳源、氮源、接种量、pH值、无机盐离子、温度、培养时间等）进行了优化。优化条件下，可获得菌体生物量分别为20.25g/L和16.35g/L，油脂产量分别为为9.82g/L和4.94g/L，菌体油脂含量分别为48.49%和30.21%。本研究通过发酵工艺的优化，有效提高了供试真菌的产油能力。

关键词：产油真菌；深黄被孢霉(Mortierella isabellina)；斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）；发酵

Study on the screening and fermentation technology of several

high-yield Lipid fungi

Abstract

As a kind of new oil resource with good prospectand , microbial oils has being a research focus.In this study,a preliminary selection on lipid producing capability of twelve fungi was made.According to the lipids contents and extraction effect of fatty acid composition,a simple and efficient method was determined,on this basis of which, we studied the fermentation technology of lipid with two fungi which had been selected.The results were as follows:The lipids contents of M.isabellina and M.ramanniana were 24.25% and 21.66% separately,the lipids content of M.racemosus was 18.74%.There were L.starkeyi and R.glutinis which lipids contents were 19.07% and 18.01% ,and the other species were all lower than 11%. Gas chro- matography analysis shows that the lipid acids of four of them are mainly C16~C18 which have the maximum content of oleic acid and C16~C18 contents are over 90%. Using M.isabellina and L.starkeyi as the test strains,the extraction effect of lipid by thermal-acid method,soxhlet extraction method and organic solvent method were analyzed comparatively. The results show that thermal-acid method was a simple and efficient method which have excellent effect on extraction of C16~https://www.360docs.net/doc/af3408043.html,anic sol- vent extraction was less efficient.On the basis of the single factor experiment and orthogonal design, the Optimization of fermentation of M.isabellina and L.starkeyi were studied.Under the optimum culture conditions,the biomass yields were 20.25g/L and 16.35g/L separately,the lipid yields were 9.82g/L and 4.94g/L separately,and the lipid contents were 48.49%and 30.21% separately.

Keywords: Oleaginous fungi; Mortierella isabellina; Lipomyces starkeyi;

Fermentation

目录

前言 (1)

第一章产油微生物研究综述 (2)

1微生物油脂的研究概况 (2)

1.1国外微生物油脂的研究概况 (2)

1.2国内微生物油脂的研究概况 (3)

2产油微生物的种类 (3)

2.1产油细菌 (3)

2.2产油真菌 (3)

3.3产油藻类 (4)

3 微生物油脂的生物合成与代谢调控机理 (4)

4 影响微生物油脂合成的因素 (7)

4.1 碳源、氮源及碳氮比对微生物产油脂的影响 (8)

4.2 温度对微生物产油脂的影响 (8)

4.3pH值对微生物产油脂的影响 (8)

4.4 培养时间对微生物产油脂的影响 (8)

4.5 通气量对微生物产油脂的影响 (9)

4.6 无机盐对微生物产油脂的影响 (9)

4.7 其他因素对微生物产生油脂的影响 (9)

5 微生物油脂的制备工艺研究 (9)

5.1 微生物油脂的生产原料 (9)

5.2 微生物菌体的预处理 (10)

5.3 油脂的提取 (10)

5.4 微生物油脂的分析 (11)

6 微生物油脂生产的展望 (11)

参考文献 (12)

第二章几种真菌产油能力的测定及筛选 (15)

1材料与方法 (15)

1.1供试产油菌株： (15)

1.2培养基 (16)

1.2.1 斜面培养基的制备 (16)

1.2.2 种子液培养基制备 (16)

1.2.3 发酵培养制备 (16)

1.3 主要仪器 (16)

1.4 试验方法 (16)

1.4.1 真菌的培养 (16)

1.4.2 菌体生物量的测定 (17)

I

1.4.3 菌株油脂提取及其含量测定 (17)

1.4.4 脂肪甲酯化方法 (17)

1.4.5 油脂脂肪酸组成及相对含量的气相色谱分析测定 (17)

2 结果与分析 (18)

2.1 12种真菌发酵培养生物量及产油脂能力比较 (18)

2.2 四种高效产油真菌油脂脂肪酸组分分析 (18)

3 结论与讨论 (21)

参考文献 (22)

第三章产油真菌油脂提取方法的比较研究 (23)

1 材料与方法 (23)

1.1 供试菌株 (23)

1.2 培养基 (23)

1.3 主要仪器 (23)

1.4 油脂提取方法 (23)

1.4.1 酸热法 (23)

1.4.2 索氏提取法 (23)

1.4.3 有机溶剂法 (24)

1.5 油脂组分的分析 (24)

1.5.1 脂肪甲酯化方法 (24)

1.5.2 油脂脂肪酸组成及相对含量的测定 (24)

2 结果与分析 (24)

2.1 三种方法提取不同真菌油脂效果的比较 (24)

2.2 三种方法提取的真菌油脂脂肪酸组分分析 (25)

2.2.1 三种方法提取的深黄被孢霉油脂脂肪酸组分分析比较 (25)

2.2.2 三种方法提取的斯达氏油脂酵母油脂脂肪酸组分分析比较 (27)

3 结论与讨论 (29)

参考文献 (30)

第四章深黄被孢霉高产油发酵培养条件的优化 (31)

1 材料与方法 (31)

1.1 材料 (31)

1.2 方法 (31)

1.2.1 菌株培养 (31)

1.2.2 菌丝体脂肪颗粒染色 (32)

1.2.3 菌体生物量的测定 (32)

1.2.4 菌体油脂提取及其含量测定 (32)

1.2.5 发酵液残糖量的测定 (32)

1.3 数据处理 (32)

2 结果与分析 (32)

II

2.1 深黄被孢霉菌丝体形态观察 (32)

2.2 不同碳源对深黄被孢霉产油脂的影响 (33)

2.3 不同氮源对深黄被孢霉产油脂的影响 (33)

2.4 pH值对深黄被孢霉产油脂的影响 (34)

2.5 硫酸镁添加浓度对深黄被孢霉产油脂的影响 (35)

2.6 磷酸二氢钾添加浓度对深黄被孢霉产油脂的影响 (35)

2.7 葡萄糖、硫酸铵浓度及接种量和培养温度对深黄被孢霉产油脂的影响 (36)

2.8 发酵时间对深黄被孢霉产油脂的影响 (37)

3 结论与讨论 (38)

参考文献 (40)

第五章斯达氏油脂酵母高产油发酵培养条件的优化 (41)

1材料与方法 (41)

1.1材料 (41)

1.2方法 (41)

1.2.1 菌株培养 (41)

1.2.2 菌体脂肪颗粒染色 (41)

1.2.3 菌体生物量的测定 (42)

1.2.4 菌体油脂提取及含量测定 (42)

1.2.5 发酵液残糖量的测定 (42)

1.3 数据处理 (42)

2 结果与分析 (42)

2.1 斯达氏油脂酵母种子液培养时间的确定 (42)

2.2 不同碳源对斯达氏油脂酵母发酵产油脂的影响 (43)

2.3 氮源对斯达氏油脂酵母发酵产油脂的影响 (43)

2.4 初始pH值对斯达氏油脂酵母发酵产油脂的影响 (44)

2.5 硫酸镁浓度对斯达氏油脂酵母发酵产油脂的影响 (44)

2.6 磷酸二氢钾浓度对斯达氏油脂酵母发酵产油脂的影响 (45)

2.7 葡萄糖、硫酸铵浓度及接种量、培养温度对斯达氏油脂酵母产油脂的影响45

2.8 发酵时间对斯达氏油脂酵母生长及油脂积累的影响 (47)

3 结论与讨论 (48)

参考文献 (50)

第六章全文总结与讨论 (51)

1 全文总结 (51)

1.1 12种真菌产油能力的测定及筛选 (51)

1.2 真菌油脂提取方法的比较研究 (51)

1.3 深黄被孢霉产油脂发酵条件的优化研究 (52)

1.4 斯达氏油脂酵母产油脂发酵条件的优化研究 (52)

2 讨论与展望 (52)

III

前言

随着石油资源的日益紧缺、石油价格的不断上涨、油品供需矛盾的日渐显现及环境污染问题的更加突出，多渠道开发可再生油脂资源成为必然。生物柴油作为一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源日益受到人们的重视。然而，高成本问题是限制生物柴油规模化生产和广泛使用的主要问题。当前利用动植物油脂生产生物柴油，原料成本占总生产成本的70-85%，经济可行性差。所以开辟微生物油脂这一新的油脂资源的研究开发领域将是工业化生产油脂的一个重要途径。

微生物油脂(Microbial oils)又称单细胞油脂(Single cell oil，SCO)，是由真菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源，辅以无机盐生产的油脂。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用谱广等特点，开发潜力大，所以微生物油脂具有良好的发展前景，可在未来生物柴油产业中发挥重要的作用。

在碳源充足而其他营养成分缺乏的状况下，微生物菌株可将过量的碳水化合物转化为脂类。微生物菌种的培养条件直接影响到油脂产量的高低，影响微生物合成油脂的因素有很多。首先是菌种问题，不同的微生物，其产生油脂的含量及油脂脂肪酸组成均不同。另外，菌种培养过程中C/N比、氮源浓度、温度、培养时间、pH值、氧气、微量元素和无机盐类浓度等因子均对油脂的生产率和积累量有影响。微生物生产油脂可分为两个阶段，即菌体增殖期和油脂积累期，两阶段碳氮比要求不同。氮源促进细胞生长，因此培养前期要求低碳氮比，可以获取大量菌丝体，产油阶段要求高碳氮比，以积累更多脂肪。

微生物产生油脂的过程本质上与动植物产生油脂的过程相似，都是从乙酰CoA 羧化酶催化羧化的反应开始，然后经过多次链延长，或再经过去饱和作用等完成整个生化过程。产油酵母菌和霉菌合成的油脂主要是甘油酯和磷脂，甘油酯约占80%以上，磷脂约占10%以上。磷脂主要含有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等。微生物油脂有多种脂肪酸组成，以油酸、棕榈酸、亚油酸含量最高，其它脂肪酸，如亚麻酸、花生酸、花生油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸及一些特殊脂肪酸存在于一些变异菌株中，且含量差异较大。不饱和脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸，因具重要生理功能和较高经济价值，已成为当今产油微生物定向育种发展方向。

本课题对12株产油真菌在限氮发酵培养基中的产油能力进行了初步筛选，并对三种微生物油脂提取方法进行了比较研究，在此基础上，重点研究了发酵培养基的碳源、氮源及其浓度、无机盐离子浓度、发酵初始pH值，接种量和温度等对2种高效产油真菌生长及产油能力的影响，确定其发酵产脂的最佳培养条件，以期为微生物产油脂的小型化工业生产奠定基础，这对未来生物柴油产油产业的发展具有重要的理论和实践意义。

1

第一章产油微生物研究综述

1微生物油脂的研究概况

微生物油脂(Microbial oils)又称单细胞油脂(Single cell oil,SCO)，是由真菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源，辅以无机盐生产的油脂。在适宜条件下，某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的 20%以上，具有这样表型的菌株称为产油微生物(Oleaginous microorganisms)(Ratledge et al.,2002)。真菌、细菌和藻类中都有产油菌株，但以真菌类的真核微生物居多。在真菌等真核微生物中，某些产油种属能积累占其生物总量70%以上的油脂，其中以甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)为主，约占80%以上，磷脂约占10%以上(刘波等，2005)。

产油微生物资源丰富，能在多种培养条件下生长，进行工业规模生产和开发有着巨大的潜力。目前，微生物油脂已成为获取高附加值脂肪酸(Certik et al.,1999)，如γ-亚麻酸(GLA)(Somashekar et al.,2002)、花生四烯酸(ARA)(朱法科等，1999)、二十碳五烯酸(EPA)(Bajpai et al.,1991)、二十二碳六烯酸(DHA)(Singh et al.,1997)等的重要原料。而且，由于某些微生物油脂在脂肪酸组成上同植物油，如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似，富含饱和和低度不饱和的长链脂肪酸，是生产生物柴油(Bio-diesel)的潜在原料(刘波等，2005)。

1.1国外微生物油脂的研究概况

微生物油脂的研究开始于第一次世界大战期间，德国利用产脂内孢霉(Endomyces vernalis)生产油脂以解决当时的油源匮乏。随后，美国对微生物生产油脂也进行了研究工作，但因为经济、技术等各种原因，研究曾一度中止，直到第二次世界大战前夕，德国科学家才筛选出适合于深层培养的菌株，开始在德国工业化生产食用油。利用微生物生产油脂的研究，从20世纪40年代发现高产油脂的斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、曲霉属(Aspergillus)及毛霉属(Mucor)等微生物开始。从 1986 年起，英、日等国已相继投人工业化生产，日本成功建立发酵法工业化生产长链二元酸的新技术，结束用蓖麻油裂解合成十三碳二元酸历史。英国 John & Sturge 公司发酵法生产γ-亚麻酸的年产量为100 t 以上。

自20世纪90年代以后，特种油脂的发展愈来愈受到重视，而且相继从丝状真菌、细菌、酵母和微藻类中，寻找到能生产许多特种油脂的菌种，并取得突破，为进一步形成生产力提供了技术依据(蒲海燕等，2003)。在国外，以深黄被孢霉及其突变株研究最多。每升发酵液含干菌体15～40g，干菌体中油脂含量30%～60%，脂肪酸中GLA含量3%～11%。培养基成份不一，如含不可溶性物质、饼

2

类、淀粉类等均对干菌丝体生物量有较大影响(赵人俊等，1995)。

1.2国内微生物油脂的研究概况

国内上世纪60年代就有过用霉菌和酵母生产油脂的报导，但研究较多的是在90年代，其研究重点集中在开发微生物功能性油脂方面。其中国内利用微生物生产多不饱和脂肪酸油脂是从上世纪80年代末期开始的(费栓琴，1998)。国内一些研究单位如上海工业微生物研究所已完成中试，干菌体生物量为3-5%，总脂肪得率40～50%(梁西爱等，2006)；福建师范大学与工厂合作在60M3发酵罐中试生产，利用菌株以(Mortierella isabellina)AS.3.3410为出发菌株的突变株M018株，采用三级发酵(即两级液体种子)，使生物量达到37.8g/L，油脂产量达79.2%(黄建忠等，1998)。据1998年报道，以拉曼被抱霉(Mortierella ramanniana)SM541为原始菌株，经过紫外线复合氯化锂诱变处理，得到突变株SM541.9，其生物量由12.6g/L提高到28.8g/L，油脂含量由5.8g/L提高到15.7g/L，传代试验表明，SM541.9具有良好的遗传稳定性(薛照辉，2002)。2003年施安辉、周波通过对粘红酵母GRL513生产油脂最佳小型工艺发酵条件的探讨发现，最终油脂产量可达菌体干重的67.2%。油脂成分分析结果为:33.31%的棕榈酸；3.80%的油酸；0.20%的γ-亚油酸；2.60%的二十碳五烯酸(EPA)和3.60%的二十二碳六烯酸(DHA)(施安辉等，2003)。清华大学吴庆余、缪晓玲通过异养转化细胞工程技术获得了脂类含量高达细胞干重55%的异养藻细胞(缪晓玲，2004)。

2产油微生物的种类

目前能够用来生产微生物油脂的微生物主要有细菌、真菌和藻类，其中以真菌中的酵母菌类和霉菌类的真核微生物居多。

2.1产油细菌

细菌在高葡萄糖时产生不饱和的甘油三酸酯，但大多细菌不产油脂而是积累复杂的类脂，加之产生于细胞外膜上，提取困难，故以前认为产油细菌无工业意义。1973年，国外研究发现海洋细菌中有多不饱和脂肪酸存在；1977年Johns 等从海洋细菌Flexibacter polymorphus得到EPA，证明原核生物同样具有合成多不饱和脂肪酸(PUFA)能力(Johns et al.,1997)。目前对细菌的研究主要集中在产PUFA深海细菌和极地细菌，对产PUFA细菌而言，PUFA组成和含量与培养温度密切相关，降低培养温度，PUFA产量则相应提高(郑建仙等，1996)。

2.2产油真菌

霉菌和酵母产的油脂与许多植物油脂相似，多为16个碳原子和18个碳原子，脂肪酸几乎都是不饱和的脂肪酸。罗玉平等(1995)分离到一株高产棕榈油酸的酵母，总脂棕榈油酸含量高达50.14%；中科院大连化物所实验室筛选出的4株产油酵母能同时转化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖为油脂，菌体含油量超过其干质量的

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55%(赵宗宝，2005)。最近希腊学者Papanikolaou S.等(2004)报道利用深黄被孢霉(Mortierella isabellina)进行高浓度糖发酵(初始糖浓度达100g/L)，油脂产量达到18.1g/L，显示出很好的应用前景。

目前，真菌中常见的产油酵母有浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、产油油脂酵母(Lipomy slipofer)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutimis)、类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)等。常见的产油霉菌有：土霉菌(Asoergullus terreus)、紫癜麦角菌(Claviceps purpurea)、高梁褶孢黑粉菌(Tolyposporium ehrenbergii)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)等(蒲海燕，2003)。

3.3产油藻类

微藻的太阳能利用效率高、个体小、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应能力强、容易培养，因此受到人们的重视。另外，微藻中不但油脂含量可观(Behrens et al.,1996)，而且直接从微藻中提取得到的油脂成分与植物油相似，因此具有广泛的应用价值，它不仅可以替代石油作为生物柴油直接应用于工业上，还可以作为植物油的替代品(Rattry,1984)。微藻中甘油三酯的含量丰富，且其甘油三酯的结构与普通蔬菜油甘油三酯的结构类似，故可以作为食用油而满足人们对食用油脂的需要。目前国内外对微藻脂肪酸进行了大量研究，但报道较多的是小球藻(Chlorella sp.)、球等边金藻(Isochrysis galbana)、球等鞭三角褐指藻(Phaeodactylumtric ornutum)等(蒋霞敏等，2003)，其总脂含量高达细胞干质量的12.1%。易翠平等(2001)用重量法测定了3种绿藻，其总脂肪含量在17.69%-21.44%之间。清华大学缪晓玲的研究表明，通过异养转化细胞工程技术可以获得脂类含量高达细胞干质量55%的异养藻细胞(缪晓玲，2004)。常见的产油海藻有硅藻(Diatom)和螺旋藻(Spirulina)。

3 微生物油脂的生物合成与代谢调控机理

目前，人们对产油酵母和产油霉菌利用葡萄糖为碳源积累TAG的代谢途径已有比较深入的认识，图1-1简要说明了产油酵母中与TAG合成代谢调控相关的一些重要步骤。当产油微生物培养基中可同化氮源耗尽并且可同化碳源丰富的情况下，其TAG积累过程被激活。这个过程涉及到微生物代谢和与代谢相关的一系列生理生化过程的变化。首先，当氮源枯竭时，产油微生物的腺苷一磷酸(AMP)脱氨酶活性增加，AMP脱氨酶将AMP大量转化为肌苷一磷酸(IMP)和氨，相当于微生物对缺氮的一种应激反应(Evans et al.,1983)。通常产油酵母线粒体中异柠檬酸脱氢酶(ICDH)都是AMP依赖性脱氢酶，细胞内AMP浓度的降低将减弱甚至完全停止该酶的活性(Botham et al.,1979)。因此，异柠檬酸不再被代谢为2-酮戊二酸，三羧酸(TCA)循环陷入低迷状态，代谢路径发生改变。线粒体中积累的柠檬酸通过线粒体内膜上的苹果酸/柠檬酸转移酶转运进入细胞溶胶中

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(Palmieri et al.,1996)，在ATP:柠檬酸裂解酶(ACL)的作用下裂解生成乙酰CoA和草酰乙酸。这样，微生物在氮源枯竭、蛋白质合成停滞的情况下仍可将葡萄糖有效地代谢为乙酰CoA，并在脂肪酸合成酶(FAS)的作用下完成脂肪酰CoA的合成。

图1-1 产油酵母油脂积累代谢调控途径简图(刘波等，2005) Fig.1 Outline of the metabolic regulation of lipid accumulation in oleaginous yeasts ACL:ATP柠檬酸裂解酶；CS:柠檬酸合成酶；FAS:脂肪酸合成酶；ICDH:异柠檬酸脱氢酶；MDH:苹果酸脱氢酶；ME:苹果酸酶；PDH:丙酮酸脱氢酶；PYC:丙酮酸脱羧酶

微生物产生油脂过程与动植物产生油脂过程相似，都是从乙酰CoA羧化酶催化羧化的反应开始，然后经过多次链延长，或再经过去饱和作用等完成了整个生化过程。其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和脂肪酸的关键酶，该过程称之为脂肪酸氧化循环(Mclendon et al.,2004)。脂肪酸碳链延长与去饱和途径如下图所示。

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6

图1-2 脂肪酸碳链延长与去饱和(墨玉欣等，2006)

Fig.Desaturation and elongation of fatty acid

在此过程中，有两个主要的催化酶，即乙酰CoA 羧化酶和去饱和酶。乙酶CoA 羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一个限速酶。此酶是由多个亚基组成的复合酶，以生物素作为辅基。乙酰CoA 羧化酶结构中有多个活性位点，如乙酰CoA 结合位点，ATP 结合位点，生物素结合位点等等。因此该酶能为乙酰CoA 、ATP 和生物素所激活。ADP 是该酶ATP 的竞争性抑制剂，抗生物素蛋白作用于生物素而抑制了该酶的活性，丙二酸单酰CoA 起反馈抑制作用。另外，丙酮酸盐对该酶有轻微的激活作用，磷酸盐对该酸的活性有较低程度的抑制。去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和酸的关键酶。去饱和作用是由一个复杂的去饱和酶系来完成的。20世纪70年代中期，科研人员就发现酵母微粒体中的去饱和酶系主要由三个酶组成，即NADH—Cytb5还原酶，Cytb5和末端去饱和酶。NADH—Cytb5还原酶是一种黄素蛋白，其催化作用是将电子从NADH 传至Cytb5。Cytb5只作为去饱和酶的电子供体，对去饱和并未起到实质性的作用，而去饱和酶才是产生不饱和酸的关键(阴秀丽等，2003)。

在脂肪酸链延长机理方面，人们也作了一些探索。Heath 等(Heath 等1996)在研究 E.coli 菌株时发现，链延长循环过程中有关的酶主要有ACP 转酰基酶(fabO)、B-酮酰基-ACP 合成酶(fabH)Ⅲ、B-酮酰基-ACP 还原酶(fabG)、B-羟癸酰-ACP 脱水酶(fabA)和烯酰-ACP 还原酶(fabI)，其中fabH 和fabI 在链延长循环中引发脂肪酸合成。

目前国内有关产油微生物的研究主要是从生物化工的角度考察一些生产多不饱和脂肪酸的产油霉菌。国际上对产油微生物甘油三酯生物合成和代谢调控机

制的研究已取得了重要进展，例如已经初步阐明了AMP脱氨酶、柠檬酸裂解酶、苹果酸酶等的活性变化与甘油三酯与甘油三酯积累活动的关系(Ratledge C,2002)，也有望通过基因调控手段增加细胞内油脂的贮存含量。

4 影响微生物油脂合成的因素

微生物发酵产油脂大体分为两个阶段，即菌体增殖期和油脂积累期，发酵培养的前期为细胞增殖期，这个时期微生物要消耗培养基中的氮源，吸收利用蛋白质，以保证菌体代谢旺盛，接着菌体细胞分裂速度剧增，以消耗碳源为主，并合成积累大量油脂，这个时期为油脂积累期(费栓琴，1998)。微生物高产油脂的一个关键因素是培养基的碳源充足。而其它营养成分缺乏，在这种情况下，微生物菌体不再进行细胞增殖，而是将过量的碳水化合物转为脂类。

研究表明，不同种属的微生物其产油脂量、油脂成分及含量各不相同。而就同一种微生物菌株，在不同培养条件下，其产油脂量、油脂成分及含量也不尽相同。与此相关的培养条件主要有碳源、氮源、温度、PH值等，其中以碳源的影响为最大(徐华顺等，1999)。表1-1.表1-2列举了几种微生物产油脂的情况(李小松，1998)。

表1-1不同菌种脂肪酸组成(%)

Tab.1-1 The fatty acid composition of different strains(%)

菌种

脂肪酸

黑曲霉米曲霉少根根霉红酵母酿酒酵母

C14:0 0.5 1.6 0.2 0.31 -

C15:0 0.5 0.5 0.71 -

C16:0 19.3 23.3 18 10.4 7.6

C16:1 - - - 1.68 50.14

C17:0 - 4.2 - 3.2 1.94

C18:0 6.9 8.3 6.6 10.84 3.08

C18:1 40.7 28.7 31.6 52.25 29.84

C18:2 31.6 30.8 32.84 2.94 1.94

注：“-”表示未检出该成分

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表1-2不同菌种在同培养条件下的油脂含量

Tab.1-2The lipid contents of different microbial strains under the same culture condition 菌种菌丝体干重(g/L)油脂质量(g/L)含油量(%)

黑曲霉 5.529 0.2181 3.94

米曲霉 1.2486 0.15 12.01

少根根霉 2.699 0.7152 26.5

红酵母0.506 0.306 57.73

酿酒酵母 1.232 0.395 32.06 4.1 碳源、氮源及碳氮比对微生物产油脂的影响

微生物高产油脂的一个关键因素，就是培养基中碳源充足而其他营养成分缺乏，在这种状况下，微生物菌株主要将过量的碳水化合物转化为脂类。目前发酵生产食用级脂类的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和乙醇等，但通常采用的碳源是葡萄糖(易绍金，2006)，因为葡萄糖作为碳源所生产的菌体生物量高，且产脂量也高。

氮源的作用是促进细胞的生长，常用的氮源有铵盐、尿素等。在严重缺氮的条件下，可观察到细胞内脂类的积累。赵人俊等(1995)在研究被孢霉M14菌株产脂条件时，认为无机氮有利于不饱和脂肪酸产生，有机氮有利于细胞增殖，低C/N有利于菌丝体产量的提高，高C/N则促进菌体细胞内的油脂合成，此外氮源的种类也会影响油脂的积累。

4.2 温度对微生物产油脂的影响

温度调节脂肪酸成分，是由于细胞对外界温度变化的一种适应性反应。通常情况下不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低，短链脂肪酸比长链脂肪酸低。因此当菌株从高温转移到低温生长时，细胞膜中不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加，主要是棕榈油酸或油酸等含量的增加；而当温度升高时，平均链长就增长。这些变化都是为了保证细胞膜的正常流动性和通透性(Fukunaga et al.,1995)。4.3 pH值对微生物产油脂的影响

不同种类的微生物，产油的最适pH值也不同，酵母产油的最适pH值为3.5～6.0，霉菌的为中性至微碱性。构巢曲霉(Aspergillus nidulans)在pH值为2.8～7.4下培养时，随pH值上升，油酸含量增加。油脂酵母培养基的初始pH值越接近中性，稳定期菌体的油脂含量越高(殷蔚申，1990)。在培养过程中不断调整pH 值，使微生物处于其最适pH值范围内，可有效地提高微生物的产油量。

4.4 培养时间对微生物产油脂的影响

微生物细胞的油脂含量随微生物生长阶段的不同而有显著差异，如油脂酵母

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的油脂含量在生长对数期较少，在生长对数期末期开始急剧增加，至稳定期初期达到最多。培养时间的长短也是一个影响因素，培养时间不足，菌体总数少而影响油脂产量；培养时间过长，细胞变形、自溶，合成的油脂进入培养基中难以收集，同样影响油脂产量。此外，不同微生物的最佳培养时间也不相同，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、根霉(Rhizopus sp.)、红酵母(Rhodotorula sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的最佳培养时间分别为3d、7d、7d、5d、6d(颜治等，2004)。

4.5 通气量对微生物产油脂的影响

油脂是由基质的糖类还原而成，当微生物产生油脂时，必须供给大量氧气，不饱和脂肪酸的生物合成也需要大量氧气(咸漠等，2000)。研究发现，产油真菌在供氧不足的条件下，甘油三酯的合成会强烈受阻，并引起磷脂和游离脂肪酸大量积累；在通气条件下，游离脂肪酸会部分转化成含有2个或3个双键的脂肪酸，从而使不饱和脂肪酸大量增加(墨玉欣等，2006)。

4.6 无机盐对微生物产油脂的影响

对真菌而言，适当增加无机盐和微量元素的添加量可提高油脂合成速度和产油量。国外有人研究表明，在培养基中适当增加Na、K、Mg等元素含量，构巢曲霉的油脂积累量可由25%～26%提高到50%～51%。另有研究证明，在培养基中适当增加Fe、Zn离子，可加速产油微生物对油脂的合成，但添加量不宜太大，否则会严重阻碍真菌对油脂的合成(蒲海燕，2003)。

4.7 其他因素对微生物产生油脂的影响

在培养基中添加乙醇、乙酸盐、乙醛等脂肪酸合成的中间产物或能形成中间产物的C2化合物可增加油脂含量，有些菌株还要求B族维生素。添加EDTA可抑制糖和盐类复合物的形成，减少同化性糖的损失，并增加油脂的含量(宋安东等，2006)。Cohen等发现有几种吡定族的除草剂能抑制脂肪酸去饱和，SAN9785是X3脱饱和的最有效抑制剂。1996年Khozin等研究表明，除草剂SAN9785能降低红藻(red algae)和紫球藻(Porphyridium cruentum)的二十碳五烯酸(EPA)产量，却同时又能将黄绿藻(Eustigmatophyte)和蒜头藻(Monodus subterraneus)的EPA产量从54%增到81%。不同的干燥方式也能影响脂肪酸成分的变化(Teixeira et al.,1996)。实验还证明，菌体稀释率、苯酚浓度、日照等对一些菌株产生油脂也有影响(Reis et al.,1996;Fukunaga et al.,1995;Molina et al.,1995)。

5 微生物油脂的制备工艺研究

5.1 微生物油脂的生产原料

微生物油脂的生产原料，碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡等；氮源有铵盐、

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尿素玉米浆、硝酸盐等；无机盐类有氯化钾、硫酸镁以及铁、锌等离了。另外，食品工业的废弃物，如淀粉厂的废水、糖厂的废糖蜜、乳品厂的乳清等，也是产油微生物可利用的好原料。

5.2 微生物菌体的预处理

在微生物油脂的生产过程中，菌体的预处理是关键步骤之一。微生物油脂属于胞内产物，有些油脂与蛋白质或糖类呈结合态存在，由于细胞壁较坚韧，所以在用有机溶剂浸提前须对菌体细胞进行预处理。预处理方法主要有掺砂共磨法(将菌体与砂子一起进行研磨)、与盐酸共煮法(与稀盐酸共煮使细胞壁分解，有利于获得油)、菌种自析法(让菌体在50℃下保温2-3d)、蛋白质溶剂变性法(用乙醇或丙醇使结合蛋白质变性)、反复冻融法(通过反复冻融的过程来破坏细胞壁)、超声波破碎法(通过超声波高频振动产生的空穴效应达到破壁的目的) 等方法(Mainu et al.,1996)。其中，掺砂共磨法较接近传统植物油脂的前处理工艺，常用于工业化生产微生物油脂。反复冻融、超声波破碎等方法适用于实验室小型操作。

5.3 油脂的提取

用于油脂浸提的溶剂应该能使全部油脂物质溶解，而且要求有足够的极性使其与细胞膜、脂蛋白等连接键被破坏(Manirakiza et al.,2001)。用于油脂浸提的溶剂主要有乙醚、异丙醚、氯仿、乙醚-乙醇、石油醚、氯仿-甲醇等。磨碎的微生物干菌体颗粒较细，溶剂渗透性极差，混合油不易浸出，因此在浸提前可对干菌体进行造粒处理，这样可提高浸出设备的利用率。由于混合油中粉末少，毛油质量好，浸出系统管道不易堵塞，浸提后可通过减压蒸发回收溶剂。

目前，研究人员常采用的油脂提取方法有酸热法、索氏提取法、超临界CO2萃取法、有机溶剂法(李植峰等，2001)。索氏法是油脂提取中最常用的方法，该方法油脂得率最高，但耗时较长，且样品需先经烘干处理，样品的需要量也大。高产菌株的诱变筛选多采用摇瓶小量发酵，索氏法难以满足菌株初筛的要求。超临界CO2萃取(SCF-CO2)法是新一代化工分离技术，因其可在常温下操作，具有有效防止提取物氧化分解、无溶剂残留、安全性高等特点，所以在生理活性物质的提取、分离上已得到广泛应用。在真菌油脂的提取中，已有不少采用SCF-CO2法的报道(Jarzebski,1995)。SCF-CO2法提取真菌油脂的效果虽较索氏法略差，但油脂的脂肪酸组成及含量相近，且样品需要量小，样品处理能力较索氏法大为提高。采用该方法的主要限制因素是需具有专门的设备。酸热法主要是利用盐酸对细胞壁中糖及蛋白质等成分的作用，使原来结构紧密的细胞壁变得疏松，再经沸水浴及速冻处理，使细胞壁进一步被破坏，从而有效地浸提出细胞中的油脂。酸热法将细胞破碎与油脂提取结合在一起，提取油脂能力大大加强，油脂提取效果与SCF- CO2法相近，该方法操作简便、快速，样品不需任何处理，单位时间内可处理大量样品，极为适合菌株的筛选。在采用该方法提取的油脂中，营养必需脂肪酸含量较索氏法及SCF- CO2法提取的油脂高，这可能是因为酸热处理可使

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细胞膜中富含多不饱和脂肪酸的脂类被更多地提取出来的缘故(刘煜等，2002)。

5.4 微生物油脂的分析

目前，常用的油脂定性分析法主要是苏丹黑染色法(张玲等，1999)，通常采用苏丹黑染色测吸光度绘制标准曲线法和索氏提取重量差法求油脂得率(董欣荣等，2002)。为了更好地确定菌体内油脂的含量，人们也在不断寻找一种简便而精确的方法，据Kimura等(2003)报道，以耐尔蓝(Nile blue)或耐尔红(Nile red)为染色剂测吸光度更有利于确定胞内油脂的含量。油脂成分分析一般利用气质联用仪在线检测，即在待测样品的酯化菌体油脂中加入5%KOH甲醇溶液封管水解，加入14%BF3甲醇溶液封管甲酯化，再加饱和NaCL溶液分层，以石油醚提取，用无水硫酸钠干燥，将溶剂挥发后进样测定(费栓琴，1998)。

微生物油脂的生产工艺流程如下(薛照辉等，2002)：

菌种筛选→原料→灭菌→菌体培养→菌体收集→预处理→油脂提取→精炼→成品油脂。

6 微生物油脂生产的展望

随着科学技术的进步和生物科学的发展,微生物油脂的研究正方兴未艾，尤其是根据各种微生物产油的培养条件及产油机理而研究微生物混合培养生产油脂，开发利用微生物油脂进行功能性油脂的生产，利用工业(特别是食品工业)的废水及废气进行微生物培养生产油脂，利用微生物油脂、微生物柴油提供原料油脂等方面的研究更具有广阔的前景。

目前国际上对产油微生物甘油三酯生物合成和代谢调控机制的研究已取得重要进展，如能通过基因工程和原生质体融合，对现有菌种进行改造，是获得高产油脂菌株的一条好途径。另外，深入研究微生物在产油脂时，碳源、氮源、碳氮比、温度、pH 值等因素对其的影响，有利于改进发酵工艺，进一步降低发酵成本，最大限度地发挥菌种产油脂的能力。再者，需要继续研究微生物油脂的提取纯化技术，为微生物油脂大规模工业化生产打下基础。

因此，产油微生物的研究，特别是利用产油微生物生产油脂为生物柴油提供原料油脂方面的研究，对解决当今世界各国油脂原料供应问题、促进生物柴油的推广使用、解决环境问题和人类能源问题等都具有重要的意义。

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