目的基因的直接转化法和间接转化法

植物基因工程中目的基因的转化方法

张亚欢 20102170231 目的基因的直接转化法和间接转化法

摘要: 植物基因工程中目的基因的转化方法有间接转化法和直接转化法，主要阐述各种转化方法的原理、特点，以期为植物转基因方法的选择提供帮助.

关键词:植物基因工程; 转化方法; 间接转化法; 直接转化法

植物基因工程是通过导入外源基因对植物进行遗传转化，使植物获得抗虫、抗病、抗逆境、优质高产以及生产药物等诸多能力，从而使人们最大限度地利用植物资源。在植物基因工程中最为关键的是植物基因工程技术，该技术是以纯化的外源DNA导入植物细胞以期获得转基因植物的方法，其内容包括:目的基因的分离和鉴定；植物表达载体的构建；植物细胞的遗传转化；转化值物细胞的筛选；转基因植物的鉴定；外源基因表达的检测等[1]。自20 世纪90 年代以来，人们对外源基因导入植物细胞进行了大量的研究，先后采用了多种方法对目的基因进行遗传转化，迄今为止，已经建立了10 余种基因转化方法，这些方法可以分为两大类: 即间接转化法和直接转化法. 下面就这两类转化方法从其原理、特点作一简单介绍.

1 间接转化法

间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法，有农杆菌介导法和病毒介导法.

1.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化的方法，该方法广泛地应用于愈伤组织、悬浮细胞、叶圆盘、茎切段、子叶切片、下胚轴切段、大田植株花茎的切段和薄层细胞等离体材料的转化，是目前双子叶植物常用的基因转移方法. 它是通过根癌农杆菌(Agrobacterim tumefaciens)的Ti 质粒(Tumer inducing plasmid) 和发根农杆菌(Agrobacterim rhizogenis )的Ri质粒(Root inducing Plasmid) 上的一段T一DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T一DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中[2]。由于T一DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可以插入到50kb 的外源基因，因此Ti 质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统.

1.1.1 Ti 质粒载体系统

Ti 质粒是Lenent 等从根癌农杆菌中分离到的一种巨大质粒，可将外源基因置换T一DNA中的非必需序列使得外源基因整合到受体染色体上而获得稳定的表达，并能使植物细胞转化为肿瘤状态，大量合成冠瘿碱。冠瘿碱是根癌农杆菌的唯一碳源，有利于根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，并进一步扩大侵染领域。

随着根癌农杆菌介导法基因转化技术的逐渐成熟与完善，它已成为常规育种的重要辅助手段，但在植物基因工程的实际操作中使用野生型的Ti 质粒直接作为基因克隆的载体仍然还有一些困难：①Ti质粒分子量很大，很难用常规的方法操作，另外在T一DNA 区段上不可能找到单一的DNA限制内切酶位点，不能插入外源DNA片段; ②野生型Ti 质粒对感染的植物具有毒性并能诱发冠瘿病，导入植物组织使其不能再生出健康的正常植株[3]，因此野生型的Ti 质粒必须经过

改造使之成为双元载体和共整合载体才能被利用。

1.1.2 Ri质粒载体系统

发根农杆菌的Ri 质粒与Ti 质粒有大致相同的结构. 当发根农杆菌侵染植物时,Ri质粒上的T一DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。经发根农杆菌侵染植物形成的毛状根离体培养都能够再生出可育植株( 因此从发展植物基因工程载体考虑，Ri 质粒是很有吸引力的[4])，而且许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高[5]。但由于目前对Ri 质粒的了解还不够充分，利用Ri 质粒载体系统还比较少，所以主要用在以研究次生代谢为目的的根组织培养工作和研究根瘤的形成上。

农杆菌的感染转化具有许多优点: ①操作简单不需要特殊仪器，培养周期短;

②技术较成熟，转化效率高; ③外源基因多以单拷贝或低拷贝插入受体细胞，稳定性好[6]; ④可利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达; ⑤较少出现基因沉默现象; ⑥可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中等。不过由于T一DNA可以在植物染色体的任何区域内插入，就有可能导致有益基因的插入失活，因此，外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善[7]。

1.2 病毒介导法

病毒介导法是以病毒为媒介对植物进行遗传转化的载体系统。具体来说就是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞的一种植物转基因方法，目前正在研究开发的植物病毒载体系统有三类: 单链RNA植物病毒载体系统、单链DNA植物病毒载体系统和双链DNA植物病毒载体系统。

1.2.1 单链RNA植物病毒载体系统

单链RNA植物病毒载体系统是以单链RNA为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA，将其克隆到质粒或粘粒载体上，然后把外源基因插入到病毒的cDNA 部分，通过体外转录，使带有外源基因的病毒载体感染并进入植物寄主细胞. 1.2. 2 单链DNA植物病毒载体系统

单链DNA植物病毒，是由单链环状DNA分子组成，一般存在成对的两个病毒颗粒，因此又称为双粒病毒(gemini viruses)。其基因组比较小，分子大小约为2. 5一3.5 kb 。双粒病毒中成对的两个颗粒所包含的基因组可以不同，但只有当两种DNA混合时才具有感染性[8]。这种二连基因组(bipartite) 可以把外源基因插入其中一种DNA上而不影响另一种DNA基因组复制，然后通过这类病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入其中，从而实现植物的遗传转化，这正是单链DNA 植物病毒载体系统转化植物的原理。

1.2.3 双链DNA植物病毒载体系统

双链DNA植物病毒载体系统，是将其病毒基因组中的一段对于病毒繁殖非必需的核昔酸序列去掉，插入外源DNA，这样在不影响病毒基因组正常包装的前提下用这种重组的病毒载体感染植物细胞从而实现外源基因的转移。

利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效率比较高，但它的安全性受到质疑，主要用于动物的基因转移[9]。

2 直接转化法

直接转化法(又称DNA直接导入法)，它指不依赖于生物体将裸露的DNA直接转移到植物细胞和原生质体中，导致细胞转化的技术，与间接转化法相比，直

接转化法不需构建载体，因此又叫无载体介导转化法. 它适用于对农杆菌侵染不敏感的植物，使用此法的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再生系统。

DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主，可以导入生物细胞; 缺点是嵌合基因整合进宿主染色体的频率低[l0]。该方法可以分为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、微注射法、基因枪法、离子束介导法和花粉管通道法[3]。

2.1 化学物质诱导法

化学物质诱导法是以原生质体为受体，借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法[l1]。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、PV A(聚乙烯醇)等，其中PEG法应用较多，效果较好。PEG 法是一种通过化学物质PEG处理去壁的原生质体作为转化受体，改变细胞膜的通透性使原生质体获得转化的方法。

PEG法具有操作简单，实验成本低廉、结果较稳定、重复性好、无需特殊的仪器设备等特点。不足之处是: ①原生质体培养再生难度较大; ②原生质体再生培养的转化植株变异率高，易产生白化苗; ③受基因型限制; ④转化率低。

2. 2 电穿孔法

电穿孔法又称电激法，是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的质膜上形成瞬时可逆性开放小孔，为外源DNA提供通道，借此导入DNA等遗传物质，达到转化的目的。由于质膜具有可修复性，外加电压造成的膜穿孔可在一定的时间内自动修复，从而使细胞恢复到正常的生理状况。

此方法的优点是: 操作简便，可以一次转化许多原生质体; 缺点是: 有原生质体培养的麻烦，电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低.

2. 3 脂质体法

脂质体是根生物膜的结构和功能特性人工用脂类化合物合成的双层膜囊[11]。脂质体法就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合，从而达到转基因目的一种转化方法. 该方法一般分4步，即原生质体的分离和纯化，脂质体的制备，原生质体和脂质体的融合以及转化体的培养、筛选和鉴定.

脂质体法的优点是: ①可避免DNA在导入受体细胞之前被核酸酶降解; ②适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA或RNA可稳定地贮藏.缺点是: ①在包装DNA时必须有短时间的超声处理，会使相当多的DNA断裂; ②所用材料必须使用具有全能性的原生质体作为受体细胞; ③转化效率较低.

2. 4 微注射法

微注射法是使用毛细微管(一般针尖的直径为0.5nm)，在显微镜下将外源DNA 注射入植物细胞或原生质体中的一种直接而完善的方法[3]。该方法是Pena等1987年首创的，在用此方法进行基因导入时，通常需要把原生质体或培养的细胞固定在琼脂或低熔点的琼脂糖上，或用聚赖氨酸处理使原生质体附着在玻璃平板上，也可以通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口，再进行操作[9]。

这种方法优点是转化效率高、无特殊的选择系统，但利用显微注射法需要以精细的显微操作技术和低密度的培养为基础，并且耗时，因此该方法比较适合大细胞的操作。

2. 5 基因枪法

基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment)、生物发射技术(biol istic Process)或高速微粒子发射技术(high一velocity mi croprojectile) ，它是利用高速运动的微粒将附着于表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质导

入技术。其工作原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子(微弹)，并使其进入带壁细胞，在此过程中携带有目的基因的质粒DNA首先沉淀在微弹(钨粉、金粉等)表面(通常以氯化钙、亚精胺作为沉淀剂来促进DNA 与微弹的结合)，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够的动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，外源DNA分子也就随之导入细胞并随机整合到寄主的基因组内. 根据动力来源的不同，基因枪大体可以分为火药式、放电式和气动式三种类型[l2]。

2.5.1 火药式(Gunpowder)基因枪

火药式基因枪的工作原理是利用弹膛中火药爆炸产生的动力，驱动载有微弹的微弹载体高速运动，当微弹载体抵达弹膛末端时被带有穿孔的挡板所拦截，而微弹由于惯性作用继续高速运动并击中靶细胞. 此装置结构简单，操作成本低; 但转化效率不高，轰击过程中弹头产生的碎片和微弹形成的粘液状聚集物都会对受体材料造成伤害. 另外，粒子速度主要受火药的数量及射程控制，可控度较低，不能使微弹均匀有效地分布; 射击时产生的声震也可能对细胞造成伤害。

2.5.2 气动式(Gaspowder)基因枪

气动式基因枪动力来源是高度压缩的氦气(为首选气体)、氮气或其它气体的爆炸式释放。当氦气压力达到可裂圆片的临界承受压力时，可裂圆片破裂并产生强烈的气流，使微弹载体携带微弹高速运动，遇到刚性的阻挡网，微弹载体被阻遏，而微弹利用惯性继续向前高速运动，轰击靶细胞或组织. 气动式基因枪的优点是: ①更加清洁、安全，通过调节气体压力可更有效地控制粒子的运行速度;

②金属颗粒分布更加均匀，每枪之间差异更小，转化率较高

2.5.3 放电式(Electric discharge)基因枪

放电式基因枪的工作原理是通过高压放电引起水滴汽化产生的冲力，驱动微弹载体连同微弹加速运动，行驶一定距离后，微弹载体被阻挡网挡住，而微弹则穿过阻挡网继续向前运动，轰击真空中的靶细胞或组织. 这种类型的基因枪可有效地转化多种类型的器官组织，特别是茎尖分生组织、配子体及胚胎细胞等，通过改变工作电压可精确地控制微弹的速度及射入深度，使微弹特异地射入具有再生能力的细胞层，以利于再生植株的获得。

“气动式”和“放电式”基因枪都具有精确调节微弹速度的性能. 微弹经无水乙醇处理后，最终形成的干粉，比粘液状的微弹更为安全有效，但所需的微弹及微弹载体材料比较昂贵[12]。

2. 6 离子束介导法

离子束介导遗传转化的原理是: 首先，一定能量和剂量的离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞壁和细胞膜的结构，结果在局部产生刻蚀和穿孔，为外源遗传物质进入细胞提供微通道; 其次，用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的负电性(沉积作用)，从而减弱了对带负电的外源DNA的静电斥力，从而促进了外源DNA的吸附和进入; 再者，离子束的直接和间接作用打断了细胞内的染色体DNA结构，有利于外源遗传物质整合到受体基因组中。

该法的优点是: 可突破生物远缘杂交的不亲和性和不结实性，能把许多野生的或不同种属生物的优良性状基因转移到农作物或经济作物中，从而丰富了基因库，增强了抗性，提高了品质. 然而，目前的离子束介导法装置需要在真空下进行离子注入，而真空的脱水作用和真空导致的冻害，使注入后细胞或组织的存活率大大下降，这不仅严重影响转化的效率，而且限制了它的应用. 对于不同的物种、不同基因型的材料，还需确定其适宜的转化参数。

2. 7 花粉管通道法

花粉管通道法是利用植物授粉后，所形成的天然花粉管通道，经珠心通道，将外源DNA携带入胚囊，从而达到转化目的的一种植物转基因方法. 特点是: ①适用范围广，可用于任何物种甚至人工合成的基因转移; ②可直接获得转基因种子; ③利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞进行转化，直接获得转基因植株，因此在鉴定时可直接针对目的性状的表现型来进行，简单快捷; ④转化速度较快，转化效率可达1%左右; ⑤育种时间短，变异性状稳定较快; ⑥方法简单，不需要复杂昂贵的仪器设备;⑦转化受体受植物花期的限制; ⑧操作的经验性很强，需要一定的技巧。

3 小结

综上所述，我们不难发现，各种转基因方法都各有利弊，有不同的适用范围. 比如说间接转化法中的农杆菌介导法，农杆菌介导法虽然具有操作简单，转化效率高，成本低等一系列优点，但却受到宿主细胞基因型的限制，它主要应用于双子叶植物和少数单子叶植物的遗传转化; DNA直接导入法虽然不受宿主细胞基因型的限制，但用这种方法导入外源基因时，拷贝数多，嵌合基因整合进宿主细胞染色体中频率低等，这些缺点都是不容忽视的. 因此，对于不同种类的植物，或者同一种类不同基因型的植物，我们都应当综合考虑多种因素，选择最佳的方法，从而达到理想的效果。

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Shift Way of Aim Gene in the Project of Plant Gene

Abstract :As for transformation methods of target genes, there are indirect and direct transformation methods in plant genetic engineering. This article deals with principles, features of transformation methods, in order to provide aid for choice of plant transgene methods .

Key words: plant genetic engineering :transformation method ; ndirect transformation methods, direct transformation method .