浏览全文胃癌患者微卫星不稳定性发生和dna 倍体的关系

胃癌患者微卫星不稳定性发生和DNA倍体的关系

朱少俊,金洲祥,王继生,徐鲁白

(325027 温州,温州医学院附属第二医院普通外科)

微卫星不稳定性(micro satelliteinstability,MSI)作为表征基因组不稳定性的一个指标,具有判断预后和指导治疗的重要临床价值。但MSI在胃癌中发生率研究报道尚不一致[1-2]，我们既往通过对胃癌患者胃液的检测已经发现MSI在胃癌胃液中有较高阳性率，且与预后相关[3]，为了进一步比较胃癌组织与胃液组织中MSI阳性表达率，我们对60例患者胃癌组织MSI两位点和DNA倍体类型进行了检测，并探讨其与胃癌临床病理参数、DAN倍体类型之间的关系。

资料与方法

一、临床资料

收集2003年11月～2006年11月60例经手术确诊的胃癌患者，术前未接受化疗或放射治疗。其中男性42例，女性18例，平均年龄（59±12）岁。

二、 MSI的检测

MSI的检测采用聚合酶链反应 K 单链构像多态性分析（PCR-SSCP）方法检测各位点重复序列改变，具体步骤如下: (1)DNA的提取：切取胃癌及相对应胃切端肿瘤细胞阴性的石蜡包埋组织6-10片，厚6μm。酚-氯仿-异戊醇法提DNA。选用D17S250、D2S123两个微卫星位点，D17S250引物序列：上游 5’-GGAAGAATCAAATAGACAA-3’,下游5’-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3’,150bp; D2S123引物序列：上游

5’-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3’,下游 5’-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3’,197bp。引物序列由上海生工合成，扩增条件采用美国2400型PCR扩增仪扩增，PCR反应体系为50mmol/l KC1，10mmol/LTRIS-HCL， 0.1％ TritoX-100，1.5mmol/L MgC12，200umol／L dNTPS，模板DNA200ng，上下游引物各50 pmol/L，Taq酶1U，加去离子水至50ul。PCR反应条件为：94℃ 30S，53℃～57℃ 30S，72℃ 30S，共35个循环，最后72℃延伸10min，1．5％琼脂糖凝胶检测PCR产物，证实为无杂带。(2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳：取上述PCR产物10ul加入10ul变性剂(含95％去离子甲酰胺、10mmolEDTA，Ph 8．0、0．5％二甲苯青、0．02％溴酚

资金项目：温州市科技发展项目资助（S2002A032）

通信作者：金洲祥，E-mail:jzx0847＠https://www.360docs.net/doc/a54345219.html, 联系电话：135********

蓝)，30ul石蜡油，煮沸5min，取出立即冰浴2min以上，再将水相全部上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5％甘油，丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺之比为29：1)上。开始在600V 电压下电泳50min，电泳后的凝胶用10%的乙酸和1.13%的硝酸(固定液)处理5min,水冲洗2～3次,再用12mol/L的硝酸银(染色液)染2次,每次10min,水冲洗3次, 最后用

3%碳酸钠-0.0515%甲醛(显色液)显色约5min,至带型清楚而背景不过高为止。肿瘤组织、癌周组织和对应正常组织DNA在同一条件下进行PCR扩增，电泳，银染。(3)结果判定：结果分析与正常组织比较，胃癌条带出现增多，丢失或移位，则MSI阳性。如果出现完全一致的电泳条带，则MSI阴性(MSS)。

三、流式细胞仪检测(flowcytometry,FCM)DNA倍体类型

将组织经机械法制成单细胞悬液,95%冷乙醇固定,碘化丙啶染色,在流式细胞仪上进行检测,测样前用正常人外周血校准仪器,使其CV值小于3%,分析采用ModFit细胞周期软件。以样本中二倍体细胞DNA含量作为内标,按照1998年欧洲分析细胞病理学协会推荐的标准[4],计算肿瘤细胞的DNA指数(DNAindex,DI):DI=肿瘤细胞的G0/1峰均道值/正常细胞的G0/1峰均道值。根据DI将样本分为二倍体(DI=1)和异倍体(DI≠1)两种倍体类型。

四、统计学分析

MSI检出率比较采用x2检验或Fish检验，两组间均数的比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学义。

结果

一、胃癌MSI检出率

分析2个位点，60例胃癌患者共检出MSI阳性17例，总阳性率为28.3%(17/60), D17S250和D2S123阳性率分别为10/60(16.7%)和15/60(25%),8例患者为D17S250和D2S123均阳性，见图1。

二、MSI与临床病理参数之间的关系

具体见表1，分析结果表明:MSI的发生和胃癌分化程度、HP感染、TNM分期和淋巴结有移相关(P<0.05), 而与性别、年龄、肿块部位及Lauren分型无关,MSI阳性患者往往分化程度高,TNM分期早,少有淋巴结转移,且常无HP感染。

三、FCM检测DNA倍体类型结果

60例胃癌患者,6例因CV值大于3%从分析中剔除,共检出二倍体15例,异倍体39例。由表1可见MSI的胃癌多为二倍体,MSI阳性和MSI阴性两组的差别具有统计学意义(P<0.05)。

讨论

MSI是由于复制错误引起的的简单重复序列(小于10个核苷酸)的增加或丢失,也称RER(+)(replicationerror)。国内外大量文献报道胃癌组织中存在MSI的发生，且认为MSI 的发生与预后有一定的相关性[5-6]。我们既往通过对胃癌患者胃液沉淀液MSI检测发现：D2S123位点和D17S250位点阳性率分别为25.0%和16.7%,且MSI阳性患者一般发生在肿瘤早期，多位于胃窦部，分化程度较高，少有淋巴结转移[3]。本研究发现胃组织MSI检测阳性率分别为25.0%和16.7%，与胃液检测阳性率无显著差异。通过与临床病理关系的研究，我们进一步发现微卫星不稳定的阳性率为28.3%(17/60),微卫星不稳定表型和分化程度、HP感染、TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿块部位和Lauren分型无关。提示MSI阳性患者预后佳,与胃液检测结果基本一致，但在肿瘤部位与MSI阳性发生率之间的相关性这项结果两项研究存在差异，这可能与遗传背景、取材不同有关。

在Gafa等[7]的研究中,MSI的大肠癌中,二倍体的比例高达82.5%,与MSI阴性者(17.7%)相比差异具有统计学意义。异倍体作为染色体不稳定的重要表征,较少出现在MSI的胃癌中,提示染色体不稳定和MSI是两条相对独立的发病途径。本研究结果发现MSI阳性患者多为二倍体,而该类患者预后较好，提示MSI阳性的胃癌患者的预后与二倍体类型有一定关系。

综上所述，MSI可能是部分胃癌发生发展和演进的另一机制，可能是胃癌多步骤发生过程中的早期分子事件。MSI的胃癌预后较好，可能与MSI胃癌多为二倍体有一定关系。

参考文献

1.Wirtz HC,Muller W,Noguchi T,et al.Prognostic value of clinicopathological

profile of microsatellite instability in gastric cancer.Clin Cancer

Res,1998,4:1749-1754.

2.Moskaluk CA,Rumpel CA.Allelic deletion in 11 p15 is a common occurrence in

esophageal and gastric adenocarcinoma.Cancer,1998,83:232-239.

3.王继生,徐鲁白,周斌,等. 胃癌患者胃液沉渣中的微卫星不稳定性的临床意义.

中国老年医学杂志,2006，26:596-598.

4.Tribukait B,Ormerod MG, Giaretti W.Consensus report of the task force on

standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology. DNA Flow

Cytometry Task Force of the European Society for Analytical Cellular Pathology.

Anal Cell Pathol,1998;17:103-110.

5.Wu MS, Shun CT, Lee CW,et al.Distinct clinicopathologic and genetic profiles in

sporadic gastric cancer with different mutator phenotypes. Genes Chromosomes Cancer,2000,27:403-411.

6.陈国庭，朱正纲，尹浩然，等.胃癌微卫星不稳定性及其与临床病理生物学的

关系.中华胃肠外科杂志,2004,7：225-228.

7.Gafa R,Maestri I,Matteuzzi M,et al. Sporadic colorectal adenocarcinomas with

high-frequency microsatellite instability. Cancer,2000 ,89:2025-2037.

表1 MSI发生与临床病理参数之间的关系

例数MSI阳性（例） MSI阴性(例) P值

年龄>0.05 ≤50 43 12 31

>50 17 5 12

性别>0.05 男性42 11 31

女性18 6 12

癌肿部位>0.05 贲门11 3 8

胃窦32 9 23

胃体17 5 12

分化程度<0.05 高中分化 37 14 23

低分化23 3 20

淋巴结转移<0.05 阴性17 9 8

阳性43 8 35

TNM分期<0.05

I、II 26 11 15

III、IV 34 6 28

HP感染<0.05 阴性18 12 6

阳性42 5 37

Lauren分型>0.05 肠型17 6 11

弥漫型25 9 16

混合型18 2 16

DNA倍体类型<0.05

二倍体20 12 8

异二倍体 34 3 31

图1 胃癌组织2个微卫星位点非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图[每个位点2例患者的胃癌组织（T）及对应正常切端组织（N），1例为MSI阴性（即MSS），表现为条带对称，1例为MSI 阳性，肿瘤组织表现为对应条带的丢失]