SF21,sf9昆虫细胞
https://www.360docs.net/doc/a95383053.html,
sf9昆虫细胞
货号基因名称规格货期
huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货
细胞描述：
Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。
质量控制：
本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。
培养条件：
27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。
用途：
本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。
细胞相关操作：
sf9细胞复苏
1.37°C水浴预热培养基；
2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；
4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）；
5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。
sf9细胞传代
1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代；
2.37°C水浴预热培养基；
3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）；
4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。
注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
https://www.360docs.net/doc/a95383053.html,
sf9细胞冻存
1.细胞计数:
1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；
2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；
3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；
4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2；
这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。
5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。
注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。
2.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。
3.37°C水浴预热培养基。
4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。
5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-1.5×107/ml。
6.将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。
7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒， -20°C放1-2h后，-80°C过夜，然后快速转移到液氮中。
sf9细胞贴壁培养
1.37°C水浴预热培养基（Sf-900 III SFM+10%FBS）；
2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；
4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；
5.置于27°C无菌培养箱中培养；
6.4-6小时后，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养；
7.每天观察细胞的状态和长势；
8.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
9.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；
10.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（Sf-900 III SFM+10%FBS）终止消化；
11.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；
12.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
13.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均
https://www.360docs.net/doc/a95383053.html, 匀分布；
14.将培养瓶置于27°C无菌培养箱中培养。
昆虫sf9细胞培养
Sf9培养要点： 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细 （以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白 Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害）） 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
昆虫的血液
昆虫的血液由血细胞和血浆组成，除双翅目摇蚊幼虫等少数昆虫因含有血红素而呈红色外，大多数昆虫的血液为无色、黄色、绿色、蓝色或淡琥珀色，比重为1.01～1.05，多为微酸性。由于昆虫体内只有一种细胞外体液即血液循环于体内和浸浴着所有组织和器官，并兼具哺乳动物的血液和淋巴液的特点，故又称血淋巴。昆虫体内的血液量因昆虫种类、虫期及生理状态的不同而有很大差异。 1 血细胞（Hemocyte）是指在昆虫血淋巴中流动着的游离细胞，来源于中胚层，约占血液的2.5%。但当昆虫被外物侵入或变态脱皮时，血细胞即行大量裂殖，数量增多。昆虫血细胞的形状常因观察时间与处理方法的不同而有较大差异，命名也颇不统一。最常见的血细胞有下面6种类型。 1.1 原血细胞（Prohemocyte）是普遍存在的小圆形血细胞，大小均一，核大并位于细胞中央，胞质嗜强碱性，是形成其他血细胞的干细胞。 1.2 浆血细胞（Plasmatocyte）是形态多样的吞噬细胞，有圆形、卵圆形、纺锤形、星形和不规则形等，核大并位于细胞中央，嗜碱性的细胞质中富含核糖体、线粒体、液泡等。在很多昆虫中，浆细胞是优势的血细胞，在昆虫免疫中起重要作用。 1.3 粒血细胞（Granulocyte）有吞噬作用的血细胞，核较小且常位于细胞中央，细胞质含有嗜酸性颗粒和粗面内质网。 1.4 囊血细胞（Cystocyte）又叫凝血细胞（coagulocyte），有一个小而圆形的车轮状的细胞核，破裂后使
周围体液发生沉积，起着凝结或愈伤作用。 1.5 珠血细胞（Spherulocyte）是一种小圆形或椭圆形的血细胞，核小且常偏离细胞中央，细胞质含嗜酸性内含物和许多液泡，在脂肪形成和中间代谢中起作用。 1.6 类绛色细胞（Oenocytoide）是一类形状和大小多变的血细胞，核小且偏离细胞中央，细胞质内含有酪氨酸酶、糖蛋白和中性黏多糖等，主要功能是参与物质代谢和分泌作用。 2 血浆（Plasma）是指体腔内浸浴着所有组织和器官的稍带粘滞性的循环液体，是胚胎时就充满体腔内的一种组织液，约占血液总量97.5%，比重在1.012～1.070之间。血浆的化学组成因昆虫的种类和龄期而有差异，但主要含有水分、无机盐、氨基酸、蛋白质、脂肪和糖类等物质，另外还有少许的气体、有机酸和激素。 2.1 水分约占血淋巴量85%左右。但因昆虫种类和发育期而有不同。例如，胃蝇Gastrophillus sp.幼虫血淋巴含水84%，牙甲Hydrophilus sp.幼虫含水92%。 2.2 无机盐类血浆中含有钠、钾、钙、镁、锰、铁、铜等以氟化物、硫酸盐、硝酸盐以及磷酸盐等形式组成的无机盐类，阳离子与阴离子常保持一定的离子平衡。一般来说，低等昆虫的渗透压主要由Na+和Cl－构成；有翅亚纲全变态的脉翅目、毛翅目、长翅目和双翅目血淋巴的渗透压有一半由无机离子构成，且以Na+为主，Cl－的作用很小，而全变态的鞘翅目、鳞翅目和膜翅目血淋巴的Na+含量低，而K+和Mg2+含量很高。另外，血淋巴中无机离子的含量和组配比率似与昆虫食性有一定的相关性。一般植食性昆虫血淋巴内含有较高浓度的K+和Mg2+，Na+/K+比率常小于1；肉食性昆虫常含有较高浓度的Na+，Na+/K+比率大于1；杂食性昆虫的Na+/K+ 比率常介于两者之间。昆虫血浆中无机盐离子的主要作用是参与物质运输，调节神经活动、酶活力、pH值和渗透压。 2.3 含氮化合物可分为蛋白质、氨基酸、尿酸、尿囊素、尿囊酸、尿素和氨等。 昆虫血浆中蛋白质的含量，除少数昆虫外，普遍比脊椎动物血浆中的含量低，但一般比其他无脊椎动物血浆中的蛋白质的含量高。例如，膜翅目昆虫血浆中蛋白质的平均含量为5g/100ml，鞘翅目为3～4g/100ml，鳞翅目为2g/100ml，直翅目为1g/100ml，而人血浆中蛋白质含量为7.2g/100ml，甲壳动物为2～3g/100ml。昆虫血浆中的蛋白质主要是以酶的形式存在，如蛋白酶、淀粉酶、转化酶、酪氨酸酶和酯酶等，参与着物质的新陈代谢。
细胞培养基本方法
1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染
（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式
11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离
昆虫免疫
昆虫免疫与信号传导 摘要 对于无脊椎动物抵御外来物质和病原体来说，先天免疫是迅速和唯一的免疫反应。昆虫依靠体液和细胞通过识别受体和激活免疫通路发挥免疫效应。脂肪体和血细胞产生以及分泌抗菌因子，但是在昆虫里血细胞才参与细胞免疫。近年来，研究集中在微生物识别机理以及对抗外来物质时细胞内信号分子的激活。这篇综述总结了昆虫先天免疫的机理，结合信号通路和它们的交叉反应涉及到了细胞免疫与体液免疫的潜在关联。 关键字：昆虫先天免疫信号通路 Abstract The innate immunity is the immediate and sole response of invertebrates for the protection against foreign substances and pathogens. In insects, it relies on both humoral and cellular responses that are mediated via certain recognizing receptors and activation of several signalling pathways. Fat body and hemocytes are the origins for the production and secretion of antimicrobial agents and activators/regulators of cellular response, while cell mediated immunity in insects is performed by hemocytes. In the last years, research has focused on the mechanisms of microbial recognition and activation of intracellular signalling molecules in response to invaders. In this review, I summarize the mechanisms of the innate immunity in insects and refer to potential interactions between humoral and cellular responses, combined with the involving signalling pathways and their cross talk. Key Words: insects innate immunity signalling pathways
昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；
细胞培养与病毒培养实验步骤..
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理
昆虫的一般形态特征教案
昆虫的一般形态特征教案 一、说教材 教材：高等教育出版社出版的《植物保护技术》第二版 “实验实训1.昆虫的一般形态特征”。 （一）地位和作用： 1、通过实验观察进一步认识昆虫体躯的组成及附器。 2、复习和巩固昆虫口器、触角、足、翅的构造及类型。 3、为鉴别昆虫打下坚实的基础。 （二）教学目标分析 1、知识目标 （1）认识昆虫体躯外部形态结构和特征。 （2）理解昆虫口器、触角、足、翅的各部分构造和作用。 （3）掌握昆虫的口器、触角、足、翅的基本类型。 2、能力目标 （1）学会观察昆虫的外部形态。 （2）培养学生合作学习的能力。 3、德育目标 发展学生的科学探究能力，培养学生对自然和社会的责任感。 （三）教学重难点 1、认识昆虫体躯外部形态结构和特征。 2、掌握昆虫口器、触角、足、翅的结构及类型，特别是触角类型繁多，学生不容 易掌握，则是教学难点。 二、说教法： 1、借助多媒体弥补实验过程中不容易观察到部分结构，如把昆虫的体躯放大,蜜蜂的 触角放大，蝴蝶的翅放大、蝗虫的后足放大、蝗虫的口器放大，通过感官和视觉， 把抽象变为具体，把难以理解的内容用多媒体展现出来，调动学生的直观功能，对 突破难点创造了良好的氛围，真正达到了对触角、口器、足、翅的结构的理解。 2、利用多媒体的趣味性，吸引学生的注意力。 1）、触角的类型部分，通过学生观察后回答，答对一个给一个动画笑脸，答错一 个给一个动画哭脸，体现多媒体的趣味性特点，这集中了学生的注意力，激发了学 生的学生兴趣和好奇心。培养了学生的创造性思维。 2）、对于昆虫的足、翅的类型，学生观察后，答对一个就把该类型的图片展现 出来，把无声的教学内容，变得有声有色，有静有动，带学生进入教学的情景 之中，使学生对学习内容产生极大的情趣，自然的步入积极的思维状态中。三、说学法 （１）课前准备 组织学生外出捕捉昆虫，要求学生在家附近搜集昆虫，由于学生个人的兴趣、经验、所处环境不同，学生搜集到的昆虫种类、数量不同，这就为学生提供了一 个广阔的空间，形成了开放性的学习过程。同时，这一阶段的学习具有很强的灵 活性，为本节课教学作好了充分的准备。 （２）教学实验 利用搜集到的昆虫材料，认识、辨别、分析昆虫各部分结构及分类，这就让
昆虫天然免疫的研究进展
昆虫天然免疫的研究进展 摘要：昆虫是目前地球陆地上最繁盛的物种类群，是人类取之不尽的资源宝库。近年来，昆虫的免疫在其基础和应用研究方面受到极大关注，通过实验来研究与昆虫免疫相关的机制、信号等问题，对害虫防治、益虫防病、开发利用抗菌物、研究人类免疫机制等有着非常重要的现实意义。 关键词: 昆虫；天然免疫；体液免疫；细胞免疫 Abstract：At present, insect is the most blooming species on the earth. And it is also a treasure-house of kinds of resources for humanity. For the past few years, the fundamental researches and application researches of insect immunity have been paid close attention to. Many scientific researchers study the mechanism and signal that related to insect’s immunity by doing experiments. It is of significance for pest control, preventing disease of beneficial insect, developing and using antibacterial material, studying humanity immunity and so on. Key words: Insect；Innate immunity；Humeral immunity；Cellular immunity 昆虫作为生物界分布最广、数量众多的一类群体, 在长期的进化过程中具备了高度的适应能力和独特的免疫体系。虽然昆虫没有像人一样的获得性免疫反应能力，但是昆虫拥有高效的先天性免疫反应系统。昆虫的先天性免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两部分, 它们协同作用吞噬和清除血淋巴中的外源入侵物。[冯从经，陆剑锋，黄建华，等，2009]本文主要基于目前对昆虫天然免疫的研究进展做一简介。 1．体液免疫 1.1抗菌肽 抗菌肽（AMPs），具有广谱抗菌活性和高效杀菌性，一直以来都承载着人类的一个梦想——取代抗生素。人类已经发现多种抗菌肽，测定出其结构，并获得抗菌肽基因，如Mdatta2基因[柳峰松，孙玲玲，唐婷，等，2011]、MdDpt基因[柳峰松，王丽娜，唐婷，等，2009]。根据氨基酸组成和结构特征, 一般可以把昆虫抗细菌肽分为 4类：即形成两性分子α-螺旋的抗细菌肽类、有分子内二硫桥的抗细菌肽类、富含脯氨酸的抗细菌肽类及富含甘氨酸的抗细菌多肽类。[柳峰松，王丽娜，唐婷，李伟，2009]昆虫抗菌肽中除绝大多数对细菌具有广谱高效的抑杀作用外, 近 10 年来也陆续发现了10多种抗真菌肽。昆虫抗真菌肽可分成两类: 昆虫组成性抗真菌肽、经免疫诱导在血淋巴中产生的抗真菌肽, 即昆虫免疫诱导型抗真菌肽[谢咸升，董建臻，李静，等，2011]。 AMPs 的产生主要由以下两个不同信号转导途径的活化而产生的: Toll途径和Imd途径，这两种途径通过激活不同的转录因子来调控不同AMPs 的基因表达。[王英，黄复生，2008]昆虫抗菌肽既具有种的差异性,又具有一定的同源性,抗菌物质在昆虫中普遍存在,可能是昆虫—植物—病原菌长期协同进化在免疫学上的体现,可以作为抗性资源利用[谢咸升，李静，董建臻，等，2009]。但是目前对抗菌肽作用机制仍需进一步研究，面对病原菌抗药性的升级, 抗菌肽及其基
鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达
鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达 及其反应原性的测定 赵莉1，2，3，步志高2*，鲍恩东1* （1.南京农业大学动物医学院南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，哈尔滨 150001； 3.瑞普（天津）动物药业有限公司天津 300300） 摘要：本研究构建了表达鸡IgM μ链蛋白的重组杆状病毒rBac-c IgMμ。采用抗c IgM μ 链蛋白的多克隆抗体间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达的c IgMμ 蛋白，显示出良好的特异免疫反应原性。以感染rBac-c IgMμ 的昆虫细胞裂解液上清包被96孔ELISA板，抗鸡IgM μ 链蛋白多克隆抗血清为一抗间接ELISA 检测，同样具有良好的敏感性和特异性。结果表明，重组杆状病毒能良好表达鸡IgM μ 链蛋白，且其表达产物具有良好的反应原性。 关键词：鸡IgM μ 链； 重组杆状病毒；反应原性 IgM是机体初次体液免疫应答中最早出现的免疫球蛋白，其在血清中的含量会在首次接触抗原的几天内达到高峰（杜念兴，1997），然后通过免疫球蛋白类转换作用转变为IgG而使其含量逐渐下降（Nossal et al, 1964；Coleclough et al, 1980; DePinho et al, 1984；Wabl et al, 1978；Yancopoulos et al, 1986；Burrows et al, 1983）。由于记忆B细胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高预示近期机体内有抗原出现，因此，IgM在动物疾病的早期诊断方面发挥着重要作用（杨汉春, 2003）。由于目前各类传染病危害严重，迫切需要一种有效的早期诊断试剂进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失。本试验利用杆状病毒—昆虫细胞系统表达了鸡IgM μ 链蛋白，由于杆状病毒表达系统在外源基因的表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的理化性质和生物学特性与天然蛋白相似（刘高强等，2004；王清华等，2006；董双林等，2006；李雪菲等，2005），因此用该蛋白包板建立的间接ELISA便于筛选出可以与天然IgM表位特异性反应的单抗，从而可为进一步建立快速灵敏的抗鸡IgM μ 链诊断试剂盒奠定基础。
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核
昆虫生理生化
《昆虫生理生化》 第一章体壁 引言 昆虫体壁（integument）又称外骨骼，它具有高等动物皮肤和骨骼的双重功能，使虫体具有坚强的支撑，并为肌肉提供了着生点，但在体壁的某些区域，仍然有柔软的性质，关键部位有许多关节，保证虫体能行动自如。 体壁也是一个复杂的代谢库，这些过程都受到激素的调节和控制。体壁又是虫体与环境之间的界面，是抵御外界异物和阻止杀虫剂渗透的屏障，特别对保持水分有很大的作用。 第一节体壁的组成 昆虫体壁包括皮细胞、表皮和基底膜三部分，表皮是皮细胞分泌的产物，但基底膜则是由血细胞分泌的。 一皮细胞 1.昆虫的皮细胞主要分布在虫体外围，局部区域已在胚胎发育时随着外胚层的内陷成为前肠、后肠、气管或生殖道的管壁细胞；另一部分特化成腺细胞、毛原细胞和膜原细胞。皮细胞的生理特点是具有周期性吸收、合成和分泌能力。 2.在极大多数昆虫中，皮细胞都是以单层形式排列的，细胞的纵切面大多呈柱状，也有不规则的。 3.皮细胞的大小与密度因虫种和发育阶段不同而异，并且与生长期间是否进行有丝分裂有关。 (一) 形态结构 1.昆虫皮细胞的形态结构是随变态和脱皮周期而不断变化的，皮细胞在脱皮期间分泌作用较弱，顶膜与底膜平直，侧膜不明显，细胞核不清晰。 2.沉积新表皮开始时期顶膜弯曲，常有原生质丝突入表皮层内，侧膜出现，胞核明显。 3.在溶离旧表皮与沉积新表皮期间，细胞的合成、分泌和吸收都很旺盛，顶膜微绒毛发达，基膜褶深陷，底膜也常随基膜一起内陷，并有血淋巴进入到内褶中，增加了基膜与血淋巴接触机会和吸收面积。 (二) 胞间联系 1.皮细胞能够识别自身所处的位置，并与周围细胞进行联系和协调，按程序分泌和沉积特定的表皮。 2.皮细胞之间复杂的横向通讯联络，主要通过侧膜联接来实现。大量平行排列的皮细胞间，在侧膜的上半部形成隔壁联结与间隙联结，皮细胞之间也借此进行信息交流，甚至结成合胞体。 3.皮细胞之间有离子偶联和由浓度梯度产生的信息交流，还能调节细胞生长和影响形态发生。 4.皮细胞有时也会象变形虫那样移动位置，这种位移出现在修补伤口的时候。 （三）皮细胞的特化 1.皮细胞会发生多种特化，并形成相应的外长物，如鳞片、刚毛和距等。 2.皮细胞不但普遍具有腺细胞的分泌功能，能分泌蜕皮液如表皮物质，而且有一些细胞还专门特化成大型的分泌细胞，即皮细胞腺。 二底膜 底膜是皮细胞基膜下方的双层结缔组织，由含糖蛋白的胶原纤维构成，内层为无定型的
细胞培养实验课程SOP
实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 七、传代细胞系培养 1、优点：1) 可以无限的传代。 2) 不少细胞系对病毒很敏感。 3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。 4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。 2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。 细胞培养 步骤： ①取长满单层的细胞一瓶，掉到培养液。 ②加入2ml胰酶消化液，置于37℃培养几分钟（也可以轻轻吹打几下），直到细胞间出现空隙或细胞变圆后倒掉消化液。（目的就是让细胞脱离贴壁状态，但不掉下来） ③加入生长液，吹打几次，使细胞分散成单个细胞（两三个聚集一起这种程度就好），然后分装于3个小瓶中，在每个瓶中补充生长液至10ml。 注意：胰酶消化不能太长（此时细胞大量脱离，会造成细胞损失，后面加生长液吹打时也不容易分散成单个细胞，容易成块，培养后长得不光滑） 细胞冻存 冻存液：现在一般用二甲亚砜，也可以用甘油。 步骤： 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细
SF21,sf9昆虫细胞
https://www.360docs.net/doc/a95383053.html, sf9昆虫细胞 货号基因名称规格货期 huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货 细胞描述： Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 质量控制： 本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。 培养条件： 27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。 用途： 本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。 细胞相关操作： sf9细胞复苏 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）； 5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 sf9细胞传代 1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）； 4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
实验一昆虫外部形态特征说课讲解
实验一昆虫外部形态 特征
一昆虫解剖镜的构造和使用 解剖镜、双目解剖镜又称体视显微镜、立体显微镜、实体显微镜等。其形式虽然多种多样，但结构基本一致现以22XB—01型解剖镜为例介绍如下。【目的】1.掌握解剖镜的基本构造和使用方法 【材料】解剖镜 【用具】 【内容和方法】 一、解剖镜的构造和功能 （一）机械部分 1．底座是全镜的最下面的部分。在底座的中央有1个可活动的圆盘，即载物盘。载物盘通常为一面为白色，一面为黑色，也有的为通明的玻璃制 成。在底座的中后部有1对压脚，用以压虫体和其它易动物体之用。 支柱是支持镜体的部件，是焦距的粗调装置，可使镜体上下移动，左右旋转。 ２．调焦装置为了避免镜身向下滑动和左右偏转，在支柱的上部和下部分别装了两个螺丝。上方的为锁紧螺丝下方的为升降螺丝。 ３．倍率盘在镜体中央，有1个两侧转动的圆盘，用以改变放大倍率之用。
双目解剖镜构造图 （二）光学部分 1. 物镜在镜体下，安装有大物镜（镜体内部还有变倍物镜）。 2．棱镜罩镜身上面为两个棱镜罩，内部为棱镜，使物象倒转，在目镜中可看到物体的正像。 3．目镜管和目镜在棱镜罩的上方，左右各有一个目镜管，用以承放目镜4．视觉圈一般是位于右边的目镜管上端。视觉圈可调节目镜的上下距离，使得观察者左右两眼都可以看到清晰物体。 5．眼罩，为了防止外来光线的干扰，多在目镜上设有眼罩，便于更好地进行观察。 6．防尘罩有些型号解剖镜带有防尘罩，使用前后均放在目镜管上端。 二、解剖镜的使用方法和注意事项
1．在取用（或者放回解剖镜）时，若需要连镜箱搬动，应将镜箱锁好，以免解剖镜零件倾出而损坏。同时镜箱的钥匙必须拔除，避免不小心将钥匙碰断在锁孔里。 2．取用解剖镜时，必须用右手握持柱，右手托住底座，小心平稳地取出或移动，严禁单手取用或移动。 3．使用前必须检查附件是否有无缺少及镜体各部有无害损坏，转动升降螺丝有无故障，若有问题立即报告，否则自己负责。 4．镜管上若有防尘罩，应取下防尘罩换上目镜，再将眼罩放在目镜的上端。注意用完后再将防尘罩放回目镜管上。 5．将所观察的物体置于玻片上或蜡盘中，再放到载物盘上，待观察。 7．拧开锁紧螺丝，先把镜体先上升到一定高度，然后锁紧镜体。 8．观察时，可先转动目镜管，使得两个目镜间的宽度适合于自己两眼间的距离。然后转动升降螺丝，使没有视觉圈的目镜成像清晰，另一目镜若不清晰，可转动视觉圈，直至两眼同时看到清晰的物像时为至。如果需要放大观察时，再转动倍率盘直到所需要的放大倍率。 9．在调节焦距时，转动升降螺丝时不能太快。在使用的过程中，若遇到故障应立即停止使用，并向老师报告。 10．使用时若发现目镜或物镜上有异物时千万不能用手、布、手绢、衣服等去擦摸，应用吸耳球吹或用擦镜纸轻轻擦拭。 11．用毕后，先将载物盘上的东西拿走，松开锁紧螺丝将镜体放下，并锁紧。取出目镜，换上防尘罩。将元件全部放回，注意不要与其它镜互换。12．用布把镜身擦干净，放入镜箱内，锁紧镜箱。
细胞培养实验步骤
细胞培养这个生物学研究最基础的技术之一，已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享一篇细胞培养的攻略，也是公司一位同事9年细胞培养经验的总结，涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞，主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作 方法。 细胞复苏： 1、细胞培养条件 2、复苏流程： （1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。 （2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。 （3）提前做好复苏准备，预热培养基。 （4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：
（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8 ml时间大概1分30秒，1 ml 大概1 min左右，需计时，期间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。 （6）贴壁细胞需离心， 1000 rpm，5 min；悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中 （7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶，最后放入培养箱中培养。 （8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。 细胞传代培养 1．悬浮细胞传代流程： （1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（2）打开摇瓶瓶盖，用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床； （3）将200 ul细胞混匀，取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝，显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验； （4）细胞需计数两次求平均值； （5）悬浮细胞生长参数
昆虫细胞的培养综述
昆虫细胞培养及其应用进展 摘要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。 关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件昆虫的组织培养最早始于1915 年, 直到1962 年Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。 1昆虫细胞培养基 昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基. 昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1] 体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben2dict (1915), 但他当
时没有合适的昆虫细胞培养基。T rager 首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件, 目的是证明单个细胞能在体外存活几天, 并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。1956 年, Silver W yatt 改进了用于家蚕(B om byx m ori L innaeus) 蛹的培养基, 成功地使细胞存活了14d。他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21 种氨基酸、5 种盐、3 种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖, 并相应调解了pH 值和渗透压, 这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。1956 年就在W yatt 发表论文时, Grace 在W yatt 的培养液中增加了胆固醇、内分泌腺和卵巢组织的提取物以及含有10 种B 族维生素的混合物, 使4 龄家蚕幼虫的卵巢细胞存活了29d。从此, 昆虫细胞培养基的研究便迅速发展起来。到目前为止, 至少已报道了60 多种昆虫细胞培养基。许多昆虫培养基配方正不断得到改进, 以使之适于细胞生长。最通用的商品培养基Grace氏培养基、TC2100、IPL 241、TNM 2FH 以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC1992M K 等。TC2100 适合于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒在草地贪夜蛾细胞系(Sf9 细胞系) 中生长, 但它仅适用于实验室而不适用于大规模培养, IPL 241 提高了昆虫细胞系的生产规模, 利于杆状病毒的有效生产。这些培养基是呈液体或粉剂的商品, 使用时通常补充5%～10% FBS(牛血清) 和一些蛋白水解物或抽取等复杂添加剂。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基, 含有丰富的细胞生长所必要的营养成分即提供生长因子、脂类、蛋白及无机盐。细胞培养的关键是培养基配方的开发, 已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长。昆虫细