表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测
表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒
感染效率检测
田 进,张在平,孟庆文3,谭复善,崔 雷 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001)
摘要:慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、N P和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNA TM
6.22GW/Em GFP2miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+N P+PB2);鉴定正确后通过BP/L R
重组反应将GFP和靶向A IV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+ PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293F T,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real2time PCR法测定病毒滴度;通过感染MDC K细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+N P+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real2time PCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDC K细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向A IV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSV G替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究A IV的防控和慢病毒介导的抗A IV转基因动物模型奠定了基础。
关键词:RNAi;多靶点;慢病毒;感染效率
中图分类号:S852165 文献标识码:A 文章编号:100524545(2010)0520583205
Pruducing recombinant lentivirus expressing multi2target miRNA against AIV and determining viral infected rate
TIAN Jin,ZHAN G Zai2ping,M EN G Qing2wen3,TAN Fu2shan,CU I Lei (S t ate Key L aboratory of V eteri nary B iotechnolog y,H arbi n V eteri nary Research I nstit ute,Chi nese A cadem y of A g ricult ural S ciences,H arbi n150001,Chi na)
Abstract:Lentivirus2mediated RNAi can efficiently transfer and express gene lasting and stable,which have became a important vehicles for the researching of gene treatment and gene function.The miRNA against N P,PA and PB2of
A IV is cloned to pcDNA TM6.22GW/Em GFP2miR and multi2target miRNA expressing vector is constructed.After
pcDNA6.2/PA+N P+PB2has been identified correct by rectriction enzyme digestion and sequencing,the GFP gene and multi2target miRNA expressing element are transposed f rom pcDNA6.2/PA+N P+PB2to lentiviral expressing vector2pLenti6/V52DEST by BP/L R recombinant.The new vector is named with pLenti6/PA+N P+PB2.Lentivirus particles were produced by transient co2transfection of serum2f ree suspension2growing293F T packing cells with the pLenti6/PA+N P+PB2and other plasmids encoding the vector components.After72h,the cell supernatant is con2 centrated.We titrated the virus titer by gradient dilution method and Real2time PCR method.The virus infected rate was evaluated by infecting MDC K,CEF and porcine fetus mechanocyte.The resaults:we success in constructing the multi2target miRNA expressing vector2pcDNA6.2/PA+N P+PB2and pLenti6/PA+NP+PB2.The recombinant lentivirus is titrated with4×107TU/mL by gradient dilution method and1×108TU/mL by real2time PCR method.
The infected rate of MDC K and porcine fetus mechano2cyte is rather higher than that of the infected rate of CEF.All the resaults reveal we have succeed in producing recombinant lentivirus expressing multi2target miRNA against A IV and found the lower sensibility of lentivirus with VSV G in CEF cell,which provides a basis for f urther researching of
收稿日期:2009209202
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30771615);“十一五”国家科技支撑计划资助项目(2008BADB2B01);国家重点实验室基金资助项目(N K L VBP200829)
作者简介:田 进(19832),男,硕士研究生。
3通讯作者,E2mail:mengqw2000@hot https://www.360docs.net/doc/a16900570.html,
prevention and control about A IV and lentivirus 2mediated transgenic animal against AIV.K ey w ords :RNAi ;multi 2target ;lentivirus ;infected rate
3Corres ponding author ,E 2mail :mengqw 2000@https://www.360docs.net/doc/a16900570.html,
禽流感病毒(A IV )属于正黏病毒科流感病毒
属,可感染鸟类、禽类、哺乳动物和人类,该病毒为负链单股RNA 病毒,病毒基因组含有8个节段,易发生抗原漂移和抗原转变,对现有疫苗的使用和药物治疗带来挑战[1]。
RNA 干扰(RNA interference ,RNAi )是指双链RNA (double 2strand RNA ,dsRNA )在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA 降解,导致靶基因表达沉默,属于转录后水平的基因沉默机制[2]。针对病毒基因的编码区设计21～23nt 长度小干扰RNA ,可以特异性抑制基因的转录水平,从而抑制
病毒的复制与增殖,并且靶向保守区的RNAi 可以
减少因病毒突变产生脱靶效应。miRNA 可以被细胞内的Dicer 酶切割成siRNA ,发挥RNAi 作用,且miRNA 表达载体具有更稳定的RNA 干扰作用,便于进行较长时间的基因功能研究[3]。研究表明RNAi 可以特异性抑制病毒的复制与增殖,包括登革热病毒、流感病毒、乙肝病毒和SA RS [326]等。
慢病毒载体可以介导外源基因整合到分裂期及非分裂期细胞染色体上,转基因效率高,且遗传稳定,因而慢病毒载体在基因治疗、基因沉默、转基因动物研究领域得到了有效利用[7]。
本研究采用第4代慢病毒载体载体系统成功制备了表达靶向A IV 多靶点miRNA 重组慢病毒,采用梯度稀释法和real 2time PCR 法鉴定病毒滴度,通过感染不同物种细胞评价该病毒感染效率,为进一步体外研究慢病毒介导的RNAi 抑制A IV 的复制和慢病毒介导的抗A IV 转基因动物模型的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 慢病毒表达系统 慢病毒载体系统由pcDNA TM
6.22GW/EmGFP 2miR 、pLenti6/52DEST 、ViralPower T 2MPacking Mix (pLP1、pLP2、pLP/VSVG )和包装细胞系293FT 组成,购自Invitrogen 公司;pcDNA TM 6.22GW/EmGFP 2NP 、pcDNA TM 6122GW/Em GFP 2PA 、pcD 2NA TM 6.22GW/Em GFP 2PB 2由本室构建。1.2 主要试剂 S Y BR GREEN real 2tine PCR K it 、Taq TM 酶、dN TP 、限制性内切酶、DL2000和DL10000购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒去
内毒素大提试剂盒购自Q IA GEN 公司;总RNA 提取试剂盒均购自上海华舜生物技术有限公司;脂质体2000购自Invit rogen 公司。1.3 引物合成 应用Oligo6.0软件设计miRNA 检测引物和内参基因β2actin 检测引物,由上海生工合成:miRNA 2F :5′2C T GAC T GACAA GCAACTA 2A GG 23′,miRNA 2R :5′2CAAAACAA GCAA T T 2
GA GG 23′,扩增长度272bp ;β2actin 2F :5′2CA GA G 2CAA GA GGGGCA TC 23′,β2actin 2R :5′2A GGTA GT C GGTCA GGTCC 23′;扩增长度392bp 。
1.4 串联miRNA 表达载体(pcD NA6.2/PA +NP +PB 2)的构建 利用同尾酶特性,以pcDNA TM 6.22GW/Em GFP 2N P 为骨架,经Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ酶切,
以PA/RNAi 编码序列为插入片段将pcDNA TM 6122GW/Em GFP 2PA 经Xho Ⅰ和Bam H Ⅰ酶切,构建N P 和PA 串联表达载体,命名为pcDNA6.2/PA +N P ,以相同方法构建pcDNA6.2/PA +N P +PB 2。将串联重组质粒经Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切鉴
定,正确后送测序。pcDNA TM 6.22GW/Em GFP 2
miR 载体图谱和串联表达质粒的构建原理见图1。1.5 pLenti6/PA +NP +PB 2载体的构建 通过B P/L R 重组反应将pcDNA6.2/PA +N P +PB 2上的Em GFP 和串联miRNA 转座到慢病毒表达载体pLenti6/52D EST ,进行酶切和测序鉴定
。
图1 RNAi 串联表达质粒构建原理图
1.6 质粒的纯化 将pLenti6/PA+N P+PB2转化到感受态细胞 E.coli D H5α中,涂板后37℃培养箱培养12～16h。挑取单菌落于含4mL LB培养液的试管中震荡培养8h,然后接150μL菌液于含150mL LB培养液中震荡培养12～16h,待D600值达到0.6～1.0时,按照Q IA GEN E去内毒素试剂盒步骤纯化质粒。
1.7 重组慢病毒的包装和浓缩 按照Invit rogen 慢病毒包装系统和脂质体2000转染说明,将pLen2 ti6/PA+N P+PB2慢病毒表达载体与Viral Pow2 er TM Packing Mix通过共转染融合度达80%的293F T,转染4～6h后更换为含有10%FBS DM EM完全培养基;72h后收取细胞上清液。将细胞上清液以4000r/min,10min进行粗离心去除细胞碎片;然后用0.45μm滤器过滤后以20000r/ min,2h进行超速离心,以1/100体积无血清DM EM4℃溶解过夜。
1.8 梯度稀释法法测定病毒滴度 将浓缩后病毒进行10倍梯度稀释后接种到融合度达50%的293细胞,接种体积为50μL,4个复孔;48h后观察计算细胞荧光数并根据公式:病毒滴度=n×计量孔稀释倍数)/接种病毒体积[8],测定病毒滴度。
1.9 R eal2time PCR法测定病毒滴度 建立样品检测标准曲线后;将浓缩后病毒进行10倍梯度稀释后接种到融合度达50%的293细胞,接种体积为50μL,4个复孔;48h后将细胞消化提取总RNA,通过real2time PCR检测各感染组β2actin和miRNA Ct 值。将各感染组miRNA Ct均值与Cont rol组进行比较,Ct值至少低于3的认为该感染孔至少含有1个病毒粒子,该孔稀释倍数乘以反转录cDNA体积即为该病毒滴度[9]。
1.10 重组慢病毒感染效率检测 将MDC K细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞接种到96孔培养板中,待细胞融合度达50%,将浓缩后病毒100倍稀释每孔接种接种50μL,分别于48、72h通过GFP 蛋白表达评价重组慢病毒感染效率。
2 结果
2.1 pcD NA6.2/PA+NP重组质粒鉴定结果 pcDNA6.2/PA+N P+PB2经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,产生5625、441bp2个片段,与预期大小一致,如图2所示。测序结果与设计的目的序列完全相同,说明构建成功。
2.2 pLenti6/PA+NP+PB2慢病毒表达载体的构建结果 pLenti6/PA+N P+PB2用经SalⅠ和Bgl Ⅱ双酶切后,产生7814、441bp2个片段,与预期大小一致。测序结果显示构建成功
。
图2 miRNA串联表达质粒酶切鉴定结果 1.Marker15 000;2.pcDNA/PA+N P+PB2
2.3 重组慢病毒包装和浓缩结果 将浓缩后病毒100倍稀释接种到细胞融合度达50%的293细胞中,48h后可以观察到荧光,说明慢病毒包装成功。
2.4 梯度稀释法测定重组慢病毒滴度结果 病毒感染48h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光细胞的数量。因此以稀释105孔作为计量孔,并计算阳性细胞数n,计算病毒的滴度,计算所得病毒滴度为4×107TU/mL。
2.5 R eal2time PCR法测定重组慢病毒滴度结果 用分光光度计测定标准品纯度和浓度,以1∶10梯度稀释标准品,进行real2time PCR扩增,反应参数参照荧光定量PCR试剂盒说明书。Rotor2 gene3000软件分析real2time PCR结果,得到一条标准曲线(图3),其R2值达到0.99,表明检测数据具有相关性,可用于相关样品的检测。荧光定量结果显示各感染组β2actin基因转录水平初始模板量无明显差异,可以忽略取样量的差异对miRNA Ct 的影响(表1)。
比较感染组与Cont rol组miRNA Ct均值, 110E+4感染组比对照组低4.52(表1),以该孔作为计量孔,计算病毒滴度为:1.0E+4×10=1.0E +5TU/μL,即1.0E+8TU/mL。
表1 各感染组Ct值
样品β2actinCt均值miRNACt均值
1.0E+216.4824.43
1.0E+316.2126.61
1.0E+416.3930.22
1.0E+516.8933.56
1.0E+616.9934.10
Control16.9934.74
图3 标准品的实时扩增曲线及标准曲线
2.6 重组慢病毒感染效率检测结果 将制备的慢病毒100倍稀释后接种50μL 到MDC K 细胞、CEF
细胞及猪胎儿成纤维细胞,感染48h 荧光强度最高(图4),感染72h 荧光强度未增加;通过GFP 比较
被感染细胞效率:MDC K 细胞和猪胎儿成纤维细胞感染效率约90%;CEF 细胞感染效率约20%
。
图4 接种重组病毒48h 后荧光显微镜下观察图 A.MDC K cell ;B.CEF :C.Porcine fetus mechanocyte
3 讨论
禽流感病毒属正粘病毒科流感病毒属,病毒基
因组为分节段的单股负链RNA ,包含8个基因,编码至少11种病毒蛋白。根据表面结构蛋白血凝素(HA )和神经氨酸酶(NA )的抗原性不同,分为不同血清亚型,各亚型之间无交叉保护。由于RNA 聚合酶缺乏校对机制,在抗体和药物等选择压力作用下造成A IV 基因遗传上的不稳定。因此A IV 的高度变异性给疫苗和药物的防控带来挑战[10]。
N P 、PA 和PB2在A IV 复制过程中发挥重要
的作用。靶向N P 、PA 和PB2的串联miRNA ,可能会高效、协同抑制A IV 的复制和增殖。
本试验采用的pcDNA TM 6.22GW/Em GFP 2miR 载体可以同时表达多个miRNA ,因此在前人试验的基础上,将禽流感病毒N P 、PA 和PB 2基因的miR 2NA 编码序列构建了串联表达质粒。该方法的优点
是N P 、PA 和PB 2中其中1个基因突变造成RNAi 失败,其他2个miRNA 仍可以发挥抑制病毒复制和增殖的作用,防止病毒突变使RNAi 作用失效。同时该表达质粒同时表达绿色荧光蛋白,可以观察目的基因表达情况及慢病毒感染效率。
慢病毒与通常使用的逆转录病毒载体比较,具
有可感染分裂细胞及非分裂细胞、不易诱发宿主免疫反应而且具有高效整合、高效表达等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点[13]。第4代慢病毒载体发展为四质粒表达系统,降低病毒发生重组机率,提高了病毒使用的安全性;且病毒囊膜被水泡性口膜炎病毒VSV G 外壳替代,提高了病毒的稳定性,扩大了感染细胞的范围[13]。慢病毒载体介导的RNAi 作用持久,克服了可质粒介导RNAi 转染效率低,基因抑制表达作用弱,持续时间
短等问题[14]。慢病毒载体介导RNAi 在体内外研究中显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义[15]。
目前关于慢病毒滴度测定方法主要Real 2time PCR 、梯度稀释法、EL ISA 检测病毒P24核心蛋白
法和FACS 法[16]。Real 2time PCR 方法敏感,缺点是无法区分病毒是否失活,且测定的病毒滴度一般要高估10～100倍;梯度稀释法重复性好,直接反应了病毒对某种检测细胞的感染能力及感染有效病毒粒子数,接近真实感染滴度,缺点是病毒滴度受到被感染细胞效率的影响;应用EL ISA 法检测的病毒P24核心蛋白含有游离的和来自无功能病毒颗粒的P24蛋白,该法检测的病毒滴度偏高;FACS 法检测
设备昂贵,且载体必须含有荧光标记。因此本试验
中采用重复性好、且敏感的梯度稀释法和real2time PCR法检测病毒滴度,比较这2种不同方法检测结果可以更准确、客观反应病毒滴度。试验中2种方法检测结果相差2.5倍,结果差异的原因可能与检测方法的灵敏度与慢病毒感染细胞的效率有关,因此可以确定本实验包装病毒的滴度介于4×107～1×108TU/mL。
重组慢病毒感染MDC K细胞、鸡胚成纤维细胞及猪胎儿成纤维细胞48h GFP基因表达量最高,延长感染时间到72h不能使GFP蛋白的表达量提高。在试验中以相同的病毒粒子数感染数量相同但来源不同的细胞,MDC K细胞和猪胎儿成纤维细胞感染效率高于CEF细胞,其感染效率存在差异。慢病毒囊膜被水泡性口膜炎病毒VSV G外壳替代,扩大了病毒感染谱,但对CEF细胞敏感性较低。
本研究采用第4代慢病毒载体载体系统成功制备了表达靶向A IV多靶点miRNA重组慢病毒,为进一步通过体外研究RNAi抑制A IV的复制和慢病毒介导的抗A IV转基因动物模型奠定了基础。
参考文献:
[1] 刘 丹,亓文宝,孟庆文,等.靶向PB2基因的特异性
siRNA抑制禽流感病毒(A IV)复制[J].中国预防兽
医学报,2008,30(4):2452249.
[2] 陈忠斌、孟庆文,仇化吉,等.RNAi2基因沉默指南
[M].北京:化学工业出版社,2004.
[3] Adeiman Z N,Blair C D,Carlson J O,et a1.Sindbis vi2
rus2induced silencing of dengue viruses in mosquitoes
[J].Insect Mol Bio,2001,(110):2652273.
[4] 操 胜,孟庆文,刘光亮,等.通过载体表达siRNAs抑
制禽流感病毒复制的研究[J].科技导报,2006,03
(213):9213.[5] 吴 浩,杨复华,朱 应,等.载体表达siRNA抑制
HBV复制与基因表达[J].武汉大学学报,2006,52
(4):4662470.
[6] 赵 慧,秦鄂德,陈水平,等.siRNA对SARS冠状病毒
复制的抑制作用[J].中国生物化学与分子生物学报,
2005,21(3):3972402.
[7] 尹春光,杜立新.慢病毒载体构建策略及生物安全性研
究进展[J].动物医学进展,2008,29(2):72275.
[8] 张 磊,刘庆友,胡 天,等.第三代慢病毒高效率包装
系统的建立[J].基因组学与应用生物学,2009,28(2):
3262330.
[9] 周欣荣,厚慧萍,李鸿翼,等.荧光定量PCR法在重组
逆转录病毒pL xSN2BDN F滴度测定中的应用[J].中
华微生物学和免疫学杂志,2007,27(8):7662770. [10] 娄本红,朱秀同,孙贝贝,等.抗体选择压作用下
H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异[J].微生物
学报,2009,49(7):9552959.
[11] 杨生海,殷 宏,刘永生,等.禽流感病毒致病机制研
究进展[J].江西农业学报,2009,21(5):1142117. [12] Shi L,Summer D F,Peng Q.Influenza A virus DNA
polymerase subunit PB2is the endonucluase which
cleaves host cell mRNA and function only as the tri2
meric enzyme[J].Virology,1995,208(1):38247. [13] Xu X,Jin M,Yu Z,et https://www.360docs.net/doc/a16900570.html,tex Agglutination Test for
Monitoring Antibodies to Avian Virus Subtype
H5N1[J].Clin Microbiol,2005,43:195321955. [14] 彭 徐.慢病毒载体研究进展[J].西昌学院学报,
2007,21(3):20224.
[15] 季国忠,张发明,翟惠虹,等.Smad4基因RNAi慢病
毒载体的构建与鉴定[J].第四军医大学学报,2006,
27(7):6002602.
[16] Geraerts M,Willems S,Baekelandt V,ea https://www.360docs.net/doc/a16900570.html,pari2
son of lentiviral vector titration methods[J].BMC
Biotechnol,2006,6:34.
影响溶解快慢的因素[精选.]
《《影响溶解快慢的因素》实验报告》 实验名称：影响溶解快慢的因素。 实验目标： 1.知道可溶解的固体物质在水中溶解的快慢与物体的颗粒大小（面积的大 小）、水的温度、水是否被搅动等因素有关。 2.亲历控制单个变量进行对比实验的活动过程。 3.体验探究影响溶解快慢因素的乐趣，感悟科学就在身边，要做爱科学的有心人。 实验材料：2个透明玻璃杯①号和②号、1根筷子、1个水槽（内盛冷水）、热水1壶、食盐、方糖、溶解快与慢实验记录表。 实验内容： 1．溶解的快慢可能跟物体的颗粒大小（面积的大小）有关。 2．溶解的快慢可能跟水的温度有关。 3．溶解的快慢可能跟水是否被搅拌有关。 4．综合运用第三种方法的效果是否会更好。 提出问题：物体溶解的快慢与哪些因素有关呢？ 实验步骤： 实验一：溶解的快慢可能跟物体的颗粒大小（面积的大小）有关。 1.实验猜测 ①物体的颗粒大（面积的大小），溶解慢；物体的颗粒小，溶解快。 ②溶解的快慢跟物体的颗粒大小（面积的大小）无关。 2.实验方法与设计 ①在两只形状大小相同、水量相等的玻璃杯中放入两块大小不一的方糖。 ②仔细观察方糖在水中的溶解速度并将相关数据记录在记录表单中。 3.实验条件 A：相同因素：①玻璃杯的形状大小。②水量的多少。③两杯水的温度。 ④投放方糖时要同时同步同高度。 B：不同因素：两块方糖的大小不同（物质颗粒粗细不同）。 4.实验操作（边操作边记录，见附表1） 5.实验结论 物体颗粒越粗（面积大）溶解速度越慢，物体颗粒越细（面积小）溶解速度越快。 实验二：溶解的快慢可能跟水的温度有关。 1.实验猜测 ①玻璃杯中水的温度越高溶解速度越快。 ②溶解速度快慢跟水的温度高低无关。 2.实验方法与设计 ①在两只形状大小相同，水量相等但水温不同的玻璃杯中放入两块形状大小质量完全相同的方糖。 ②仔细观察方糖在水中的溶解状况并将相关数据记录在记录表中。 3.实验条件 A：相同因素：①玻璃杯的形状大小。②水量的多少。③两块方糖的大小。 ④投放方糖时要同时同步同高度。⑤实验室内的温度要一致。
细胞凋亡与衰老
细胞凋亡与衰老 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【关键词】细胞凋亡；衰老 衰老是指增龄过程中机体出现的多器官渐进性功能减退，其确切机制并不清楚，有多种学说，如自由基学说、端粒学说和细胞凋亡学说等。以啮齿类动物为研究对象，肌肉、脑、心脏等多种衰老组织中均存在细胞凋亡异常〔1〕。细胞凋亡参与多种与衰老相关的病理过程，如骨质疏松、阿尔茨海默病等。目前细胞凋亡在衰老中的作用成为国内外研究热点，本文就二者的最新研究进展作综述。 1 细胞凋亡 细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达及调控，是机体为更好地适应环境采取的主动死亡，其参与许多重要生命活动，如胚胎发育、免疫防御和维持组织稳态等，对维持细胞增殖与死亡的平衡有重要意义。 1.1 细胞凋亡途径 1.1.1 外源性途径又称死亡受体途径，是由膜受体介导的细胞死亡过程。死亡受体是属于肿瘤坏死因子受体超家族的跨膜受体，其中研究较透彻的是Fas/FasL系统。Fas广泛分布于胸腺、肝、心、肾等
组织细胞表面。当Fas与其配体FasL结合后发生多聚化，与胞浆内死亡结构域结合蛋白（FADD）结合，活化胞浆caspase8，再活化凋亡执行者caspase3，水解蛋白质，启动核酸内切酶剪切DNA，造成凋亡。这是发育过程和免疫系统中最主要的凋亡途径。通过该途径可清除发育过程及免疫反应中活化的淋巴细胞。增龄过程中Fas表达呈上升趋势。衰老大鼠胸腺细胞和脾细胞凋亡速度加快，可能造成衰老机体免疫功能下降。 1.1.2 内源性途径以线粒体为核心，又称线粒体途径。该途径凋亡信号来自体内各种应激，如DNA损伤、氧化应激、紫外线、生长因子缺乏等。凋亡信号引起前凋亡蛋白Bax活化，Bax诱导线粒体释放细胞色素c（Cyt c）。进入胞质的Cyt c与凋亡蛋白激活因子（Apaf1）、caspase9前体组成凋亡体，激活caspase9，再活化caspase3引起细胞凋亡。线粒体也可释放凋亡诱导因子(AIF)和内切核酸酶G进入胞浆，二者转移到细胞核，断裂DNA。随着年龄增长，内源性凋亡途径逐渐变得活跃。 1.1.3 内质网应激介导的细胞凋亡内质网(ER)参与蛋白质合成及翻译后加工修饰。当非折叠或错折叠蛋白质在ER内堆积超过处理能力时，引起ER应激。ER应激的一个后果是细胞凋亡。位于ER膜上的Bak、Bax发生构象变化形成多聚体，使Ca2+进入ER，活化caspase12，引起下游级联反应，活化caspase9和caspase3。机体具有应对ER应激的保护措施，如使翻译起始因子eIF2去磷酸化，减少蛋白质合成。但衰老机体应对ER应激能力降低，eIF2磷
病毒感染与靶细胞凋亡
病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。
越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,
细胞氧化应激基本概念讲解
1、细胞氧化 细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。 2、OS 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病-最重要的危氧化应激和抗氧化不单纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、核的重构、DNA损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠等多重的细胞和分子改变。 3、ROS 需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -·、H2O2 及HO2·、·OH 等。 4、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis ）是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡（ PCD ） 5、SOD 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD 具有抗衰老的特殊效果。是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
细胞衰老和凋亡教学设计.docx
第六章细胞的生命历程 第3节细胞的衰老和凋亡教学设计 一、教材分析 细胞像生物体一样也要经历出生、生长、成熟、繁殖、衰老、死亡的过程，所以细胞的分裂、分化、衰老、死亡是生命的必然。那么个体衰老与细胞衰老的关系呢？细胞衰老有哪些表现呢？细胞衰老的原因是什么？细胞的衰老和凋亡是生命活动中必不可少的过程，衰老和凋亡有什么关系？这一连串的问题构成本节内容的主线。对于细胞衰老和凋亡的学习，能使学生对细胞的整个生命过程有个完整的认识。同时细胞衰亡机制的研究与生物科技的发展息息相关。对细胞衰 亡知识的学习，有助于培养学生的科学兴趣，培养学生的创新意识。 二、教学目标 1.知识与技能 (1)个体衰老与细胞衰老的关系。 (2)描述细胞的衰老的特征和原因。 (3)简述细胞凋亡的含义及与细胞坏死的区别。 2.过程与方法 (1)培养学生联系实际灵活应用知识的能力。 (2)学会进行与社会老龄化相关问题的分析。 3?情感态度与价值观 (1)探讨细胞的衰老和凋亡与人体健康的关系，关注老年人健康状况和生活状况
(2)通过有关衰老问题的讨论，树立科学的发展观。 三、教学重点难点 学习重点：1?细胞衰老的概念及特征。2?细胞凋亡的含义。 学习难点：细胞衰老与细胞凋亡的区别和联系。 四、学情分析 学生已经学习了细胞的增殖、分化的内容，对本节的内容已经有了初步的认识和理解，明确了细胞的分化、衰老和凋亡是一个自然的生命过程。本节的内容接近现实生活，可利用现实生活中的例子加以说明，培养学生知识的应用能力和知识的迁移能力。 五、课型：新授课教学方法：教学基本环节：情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→布置作业及预习 六、课前准备布置学生在课前预习细胞衰老与凋亡内容。教师制作课件。 七、课时安排：1课时 八、教学过程 【情景导入、展示目标】 教师展示刘德华的电影一一童梦奇缘的剧照：谁曾经没有幻想过一夜长大？谁又在垂暮之年没有产生过如果生命可以重来的念头？但是如果真的有那么一种方式，可以让你体验一下一夜长大的感觉，你会为此付出青春的代价嘛？ 问题1:人的一生必然要经历哪些生命历程：出生→生长→成熟→繁殖→→的生命历程。(学生思考回答)
第五章 病毒与宿主细胞的相互作用
第五章病毒与宿主细胞的相互作用 第一节病毒与宿主细胞的相互作用 1.1病毒感染及病毒性疾病 １.病毒感染(viral infection)：病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程为病毒感染，有时虽发生病毒感染，但并不形成损伤或疾病。 ２病毒性疾病(viral disease)：感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病，称为病毒性疾病 ３病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ４显性病毒感染：有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等进入机体，到达靶细胞后大量增殖，使细胞和组织损伤，机体出现明显的临床症状，这样的感染称为显性病毒感染或临床感染；按症状出现早晚、持续时间的长短以及病毒在体内持续存在状态等显性感染又分为急性病毒感染和持续性病毒感染两种。 ５病毒在宿主易感细胞内增殖造成细胞破坏与死亡，这种感染称杀细胞性感染。 ６病毒在细胞内增殖引起细胞变性、死亡裂解的作用称病毒的细胞病变效应（CPE）。 ７细胞凋亡：多细胞生物的一种生理性细胞死亡的过程，是形态上术语。细胞程序性死亡：细胞内特定基因的程序性表达介导的死亡，是功能性术语。 1.2病毒在机体内的散播 局部散播:病毒只在入侵部位感染细胞局部散播。 血行散播：病毒可在入侵局部增殖进入血液经血流或神经系统向全身或远离入侵部位的器官散播。 神经散播：HSV单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）、VZV水痘-带状疱疹病毒、狂犬病病毒。 1.3病毒感染的条件 ａ．病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ｂ．合适的感染途径。 c．宿主的易感染性细胞：跟细胞表面的病毒受体、宿主机体的免疫状态、其他物理分子（如体温、营养及年龄、病毒的致病机制）有关。 1.4病毒的致病机理 病毒对细胞的致病作用包括来自病毒的直接损伤和机体免疫病理应答两个方面。敏感的宿主细胞被病毒感染后，两者相互作用下可表现为：杀细胞性感染；稳定状态感染；细胞凋亡；包涵体的形成；细胞增殖和转化；病毒基因的整合。 1.病毒对细胞的直接致病作用 由于病毒在细胞内增殖，干扰和破坏了宿主细胞的正常代谢，造成细胞死亡即所谓杀细胞效应(cytocidal effect)。 2.机体的免疫应答引起的免疫病理作用 病毒感染细胞后，细胞表面可产生新的病毒抗原，可诱发宿主产生免疫应答，也能造成
病毒感染呼吸道时机体的固有免疫和适应性免疫的参与机制
病毒感染呼吸道时机体的固有免疫和适应 性免疫的参与机制 以呼吸道病毒感染为例，当病毒入侵机体时将会产生以下几个阶段的防御反应。 一、呼吸道粘膜以及细胞分泌物的机械和化学屏障 当病毒通过呼吸道入侵机体时，首先遇到由完整粘膜组成的免疫系统第一道防线，黏膜产生阻挡作用的同时还通过纤毛的不断同向摆动，清除粘膜表面的病原体。除机械性作用外，粘膜细胞分泌的多种物质亦可阻挡病毒的入侵。 二、固有免疫细胞和免疫分子的免疫应答作用 当病毒突破机体屏障结构进入体内时，固有免疫细胞和免疫分子启动免疫应答——第二道防线。 首先发挥作用的是游离在血液中小吞噬细胞中性粒细胞，感染发生初期在炎性细胞因子等的作用下，血管内皮细胞表达E-选择素，诱导吞噬细胞表达相应配体，并与血管内壁黏附，沿内皮细胞表面滚动，以致穿越血管内皮，接着在趋化因子作用下向感染灶募集和迁移，聚集在感染灶的吞噬细胞PRR与病毒PAMP识别结合启动吞噬与杀灭作用。 NK细胞通过识别受感染的靶细胞表面HLA-I类分子，激活杀伤
活化受体，与HLA-I类分子表达下降的感染细胞表面相应配体结合，从而产生杀细胞效应。同时通过NKG2D和自然细胞毒性受体识别受病毒感染细胞高表达的相应配体，选择性的杀伤靶细胞。 此外，NKT细胞、B1细胞、γδT细胞、树突状细胞(DC)等也起到了相当重要的免疫应答作用。以上均为固有免疫的参与机制，为感染发生后的96小时内反应，固有免疫将贯穿整个免疫应答过程。 三、T淋巴细胞介导的细胞免疫应答 1.T细胞识别抗原 病毒被DCs吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给初始CD4+ T细胞；而吞噬细胞通过对病毒的吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给效应CD4+ T细胞和记忆CD4+ T细胞识别。由此激活由T细胞介导的细胞免疫应答。 被病毒感染的细胞通过表达病毒肽-MHC I类分子分子复合物，被初始CD8+ T细胞识别。 2.T淋巴细胞活化 CD4+ T细胞表面的TCR与ACPs表面的抗原肽-MHC II类分子复合物结合后，以及CD8+ T细胞表面的TCR与靶细胞表面病毒肽-MHC I类分子分子复合物结合后引发第一信号，促进免疫突触的形成，启动信号传导途径，导致T细胞基因表达改变，表达基因编码了介导T细胞生物学效应的蛋白质。同时，T细胞将第一信号整合，直至达
氧化应激与心肌
氧化应激与心肌 1957年美国克里夫兰临床中心，首先将大隐静脉搭桥术应用于冠心病病人，此后冠状动脉粥样硬化性心脏病血运重建治疗快速发展。冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路手术已成为挽救缺血心肌的重要治疗方式。但血流恢复本身也会引起显著的损伤，部分患者在血供恢复后，出现细胞超微结构变化、细胞代谢障碍、细胞内外环境改变，导致缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion-associated tissue injury，IRI），临床表现为心律失常、心力衰竭等。IRI也出现在心脏手术、心脏移植、心肺复苏等临床情况后。目前研究表明细胞IRI的机制主要包括：氧自由基含量增多、细胞内钙超载、线粒体膜去极化等。氧化还原失衡是IRI发生的重要起始因素，但其机制和细胞中存在的保护机制尚不完全明确，本文重点对氧化应激与心肌IRI的研究进展做一综述。 1.氧化应激和ROS 氧化应激（oxidative stress，OS）主要是由于内源性和(或)外源性刺激引起机体代谢异常而骤然产生大量活性氧簇（ROS）。ROS是指在外层电子轨道含有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子，包括超氧阴离子（O2- ·）、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝酸盐（ONOO-）和羟基自由基（·OH）。ROS作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件，包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶作为体内清除自由基的重要物质，在维持体内氧化还原平衡方面发挥重要的作用。但在IRI过程中，参与合成ROS的酶体系增多，且活性更强，如NADPH氧化酶、线粒体黄素酶、黄嘌呤氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶、细胞色素P450、脂氧合酶、环氧合酶和过氧化物酶体，ROS的生成量明显高于细胞内的清除能力，导致氧化还原失衡。ROS虽然半衰期很短，但具有极强的氧化活性，与细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生过氧化反应，造成细胞结构损伤和代谢障碍。 2.ROS的主要来源 NADPH氧化酶是细胞内ROS的最主要来源，是由催化亚基gp91phox或其同系物，即非吞噬细胞氧化酶1~4(NOX1~4) 、双功能氧化酶1~2(Duox1~2) ，跨膜亚基p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox等蛋白分子共同组成的多亚基蛋白复合体。NOX家族蛋白亚型与跨膜亚基、胞浆亚基结合并组装成有活性的复合体后发挥其生物学功能。活化的NADPH氧化酶复合物与NADPH结合并释放2个电子，通过黄素腺嘌呤二核苷(FAD)传递给亚铁血红素，与细胞膜的外侧的2个氧分子结合生成O2-，最后生成H2O2、过氧化硝酸盐(ONOO-) 、羟基团(-OH) 及其它基团[1,2]。NOX源性的ROS在维持机体稳态中是把双刃剑，NOX源性ROS 一方面在氧化还原信号通路中起到了第二信使作用，参与多种细胞生理功能；另一方面，在高血压、动脉粥样硬化以及心肌IRI的病程中发挥了重要作用，因此单一抑制NOX活性对治疗心肌IRI并不是最好的选择。Vincent等[3]研究发现在30分钟缺血-24小时再灌注小鼠模型中，NOX4基因敲除组与NOX1和NOX2敲除组相比，表现出更大面积的心肌梗死，提示内源性NOX4 在H/R损伤中可能发挥着心肌细胞保护作用。 黄嘌呤氧化酶（XO）是IRI中ROS产生的另一重要来源，与合成抗氧化剂尿酸的黄嘌呤还原酶（XDH）作用相反。XDH/XO活力受细胞因子、细胞内化学物质及激素的调节。细胞缺血时XO活力升高，并且A TP分解产物次黄嘌呤积聚，再灌注时O2大量介入，次黄嘌呤和氧在XO作用下反应生成O2- ·和H2O2。有研究指出，XO不仅通过合成ROS参与心肌缺血再灌注损伤，XO本身可以与白细胞产生相互作用，造成微循环阻塞，导致再灌注的无复流现象。此外，XO可以直接损伤血管内皮细胞（EC）或通过ROS间接损害EC，影响心肌血流再灌注[4]。 3.ROS与细胞损伤
制备慢病毒载体
现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。 瞬时转染制备慢病毒： 细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编 码基因，转染效率极高。但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。 DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。质粒的纯度对慢病 毒载体的包装效率非常关键。不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。 转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。其它方法有脂质体法和PEI法。转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病 毒载体。之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。储存溶液添加血清会帮助提高 病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。 病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储 存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。甚至是不同的实验室测出来的都会有差异。亦可使用PCR 法测定滴度，其引物设计针对病毒颗粒的通用cDNA区域，因此不受外源插入片段的影响，也不需要反转录步骤，而且可以用于所有慢病毒载体。 注意事项 1.避免使用小量抽提质粒，其纯度相比中抽和大抽而来的质粒纯度较低，可能会降低包装效率。 2.对于基于HIV-1的慢病毒载体而言，依实验目的，可能需要Vpr或者Rev辅助蛋白因子。有些细胞类型需要这些辅助蛋白的参与才能达到高侵染效率。 3.包装细胞系的质量对高效包装病毒非常关键。转染时，细胞密度在70-90%之间比较合适，过低或者过高密度 都可能会降低病毒包装效率。细胞开始出现汇合时，需要及时更换或者添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。 4.氯喹对细胞有毒性，一般将标准使用浓度之下的氯喹与细胞共孵育的时间控制在8小时之内。或者降低氯喹的使用浓度，延长孵育时间。 5.病毒包装时的细胞培养温度需要综合两方面因素考虑：a)，370C最有利于保持细胞健康状态;b)，320C最有利于维持重组病毒的稳定性。 6，收集病毒上清时的离心步骤可以去除细胞碎片以及少数悬浮的293T细胞。必要时，需要过滤以彻底去除一些细胞成分的污染。 7.冻融会降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反复冻融。病毒放置于4℃时每36-48小时侵染效率下降50%。 8.视实验目的而定，为降低血清成分污染，建议使用低浓度血清培养基。 9.通过使用0.45mm的滤膜不仅可以去除细胞碎片残留，还可以去除VSV-G残留片段对细胞的毒性影响，但同 时也会部分影响病毒滴度，所以过滤步骤需要依据具体实验目的而定。 10.使用TNE重悬病毒沉淀时，虽然低体积会增加病毒浓度，然而由于VSV-G介导病毒与细胞的融合，所以高 浓度VSV-G对细胞会造成一定毒性，而有些细胞对VSV-G引起的毒性比较敏感，因此最终体积需要依据具体实验而定。
病毒与细胞凋亡复习课程
病毒与细胞凋亡
病毒与细胞凋亡 万文娟 2011302220031 摘要：细胞凋亡的概念、与细胞凋亡有关的病毒和基因、病毒调控细胞凋亡的机制 关键词：病毒细胞凋亡 1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应 生存环境而主动争取的一种死亡过程。根据形态学特征，细胞凋亡可分为三个阶段（1）：第 一阶段为核碎裂阶段，此阶段细胞要经过核固缩、染色质凝聚、胞浆浓缩等变化；第二阶段为凋亡小体形成阶段，包括细胞膜形成泡状突起、突起与胞体分离形成凋亡小体等过程；第三阶段为凋亡小体被临近细胞吞噬或凋亡小体自行降解阶段。 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程 （1）凋亡的启动阶段 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，目前比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。 2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经：实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。 （2）．凋亡的执行 尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。
内质网应激的信号通路及其与细胞凋亡相关疾病关系的研究进展
山东医药2019年第59卷第17期 内质网应激的信号通路及其与细胞凋亡 相关疾病关系的研究进展 叶勇1，赵海霞2,张长城2 （1三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌443000；2三峡大学医学院） 摘要:细胞凋亡是指生理性或者病理性因素触发细胞内预存的死亡程序，内质网应激（ERS）在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。氧化应激、Ca"稳态失衡及缺氧等可引起蛋白质在内质网内的折叠受到抑制,促使未折叠蛋白聚集，引起ERS,激活未折叠蛋白反应，若此反应持续存在，则可诱发细胞凋亡。ERS包括PERK、IRE1、ATF6三条经典的信号通路，由PERK介导的信号通路能快速减少蛋白质的合成，减轻内质网的负荷；IRE1和ATF6介导的信号通路能增加内质网分子伴侣蛋白的合成，增加内质网蛋白的折叠、转运和降解的能力，减轻内质网的负荷。 ERS参与了心肌缺血再灌注损伤、衰老、骨质疏松、肝硬化、肿瘤等疾病的发生发展男十对ERS进行干预有望成为治疗凋亡相关疾病的重要靶点。 关键词：内质网应激;细胞凋亡;凋亡相关疾病 doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2019.17.028 中图分类号:R329.2文献标志码:A文章编号：1002-266X（2019）174098-04 细胞凋亡又称为程序性死亡，是指生理性或者病理性因素触发细胞内预存的死亡程序,导致细胞自主有序的死亡。与坏死不同，凋亡是主动过程，涉及一系列信号通路的激活与调控，与细胞增殖共同 维持体内细胞数量的动态平衡。研究表明，内质网 应激（ERS）、线粒体通路、死亡受体通路及氧化应激等均参与了细胞凋亡的发生发展，其中ERS是目前的研究热点［1>2］o内质网是由细胞内膜构成的封闭网状管道系统，是真核细胞内重要的细胞器,主要负 通信作者：张长城(E-mail:greatwall@https://www.360docs.net/doc/a16900570.html,) [21]Su V,Lau AF.Connexins:Mechanisms regulating protein levels and intercellular communication[J].FEBS Lett,2014,88(8): 1212-1220. [22]Liu P,Xia L,Zhang WL,et al.Identification of serum microR- NAs as diagnostic and prognostic biomarkers for acute pancreatitis [J].Pancreatology,2014,14(3)：159-166. [23]Bi Y,Wang G,Liu X,et al.Low-after-high glucose down-regula- ted Cx43in H9c2cells by autophagy activation via cross-regulation by the PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK(1/2)signal pathways [J].Endocrine,2017,56(2)：336-345. [24]李靖华，张涛，张胜逆，等.水通道蛋白-1及核因子k B在大鼠 重症急性胰腺炎肺损伤中的表达及意义[J].中华消化外科杂 志,2016,15(8)：830-835. [25]刘多谋，黄鹤光,周武汉，等.白细胞介素-1|3对人脐静脉内皮 细胞结构及水通道蛋白-1的影响[].中华肝胆外科杂志， 2014,20(2)：142-145.责分泌型蛋白和膜蛋白的合成、折叠、修饰及运输,同时也是细胞内Ca2+的主要储存库。在某些生理和病理条件下（如氧化应激、Ca2+稳态失衡及缺氧等）可引起蛋白质在内质网内的折叠受到抑制，促使未折叠蛋白聚集，激活未折叠蛋白反应，引起ERS o ERS包括未折叠蛋白反应、内质网相关性死亡和整合应激反应三个相互联系的动态过程，其中未折叠蛋白反应起重要作用［］。一定程度的ERS 有利于激活细胞的保护性适应机制，而ERS过强或持续时间过长，导致内质网的内稳态严重失衡，无法修复，则引起细胞凋亡［,］。因此，受损细胞往往会 [26]Zhang Z,Chen Z,Song Y,et al.Expression of aquaporin5in- creases proliferation and metastasis potential of lung cancer[J].J Pathol,2010,221(2)：210-220. [27]Cao C,Sun Y,Healey S,et al.EGFR-mediated expression of aquaporin-3is involved in human skin fibroblast migration[J]. Biochem J,2006,400(2)：225-234. [28]Crockett SD,Wani S,Gardner TB,et al.American gastroenter- ological association institute guideline on initial management of a-cute pancreatitis[J].Gastroenterology,2018,154(4):1096-1101. [29]陈康部?乌司他汀治疗急性重症胰腺炎疗效观察[]?中国误 诊学杂志,011,1(30)：7353-7353. [30]Xie Z,Chan E,Long LM,et al.High dose intravenous immuno- globulin therapy of the Systemic Capillary Leak Syndrome( Clark-son disease)J] .Am J Med,2015,128(1)：91-95. (收稿日期：2019-01-21) 98
慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法
一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得:shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。 B． PCR扩增产物的胶回收 原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收
教科版四年级上册科学实验报告单含实验目的及实验现象
教科版四年级科学上册实验报告单 （1）实验名称：室内外温度的测量与比较 实验器材：温度计、线、笔 实验步骤： 1、取一支温度计，用线拴好。 2、将温度计悬挂，（离地面米左右，不能靠拢，在室外注意通风，阳光不能直射温度计）。 3、读数。 4、记录并比较。 实验结果：室内外温度存在差距，通过对大气温度的测量，可以了解当地的气温。 （2）实验名称：气温的测量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、选择两个地点：阳光下和背阴处来测量它们的温度； 2、测量一天中，清晨、商务、中午、下午、傍晚的气温。 实验结果：1、阳光下的温度高，背阴处的温度低，说明测量气温时应该选择背阴的地方。2、一天中，中午的时候气温最高，清晨的时候气温最低；还发现在一天中的气温时从低到高，在从高到低的规律变化的。 （3）实验名称：用简易雨量器测量降水量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、用喷水壶模拟降水，记录好时间。 2、把雨量器改在水平桌面，读出刻度 3、换算成24小时，核对雨量等级。 实验结果：根据24小时内测的降水量，对照等级表，确定了下雨的等级。 （4）实验名称：观察食盐、沙在水中的状态 实验器材：烧杯2个、搅拌棒2根、沙、食盐、水。 实验步骤： 1、取一小匙食盐，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现 2、取一小匙淘洗干净的沙，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现 3、比较食盐和沙在水中的状态。 实验结果：食盐在水中溶解了，沙在水中没有溶解。 （5）实验名称：观察面粉在水中溶解了吗 实验器材：烧杯1个、搅拌棒1根、面粉、水。 实验步骤： 1、取一小匙面粉，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。 2、你发现了什么
细胞凋亡与免疫
细胞凋亡与免疫 细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜包小泡的一种精确调节的细胞死亡过程，是目前生物界最热门的话题之一。细胞凋亡之所以引起学者们的广泛关注，在于它在保证许多生物的健康生存上起到了十分关键的作用。它在生物的发育过程中塑造了神经系统，并且保证了免疫系统行使正常功能。细胞凋亡是免疫应答和免疫调控的重要形式之一，免疫细胞的增殖与分化过程是与免疫细胞的正常死亡相统一的，免疫应答的效应过程也是与靶细胞的死亡相伴随的。细胞凋亡的研究也是免疫学的重要课题。 1.概念 1972年，Kerr首先提出细胞凋亡是不同于坏死的一个主动的自我破坏过程。1980年，Wyllie等在糖皮质激素诱导胸腺T细胞死亡的过程中，观察到一系列形态学和生物化学的变化，与常规坏死不同，认为这是细胞内基因调控发生的有序的死亡过程，并提出了细胞程序性死亡（PCD）的概念。作为生命过程中同一个过程的两个方面，凋亡和增生同样不可缺少，二者是辨证统一的。对免疫学来说，细胞凋亡有特殊的意义。免疫系统识别外来异物和自身组织的形成，必须依靠对自身起反应的淋巴细胞的删除，而这种删除主要是通过细胞凋亡来完成的。淋巴细胞对靶细胞的杀伤过程部分也是通过靶细胞凋亡来实现的。细胞凋亡如果出现紊乱，机体可能出现严重的病理状态，如肿瘤、白血病、自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等）、免疫缺陷等。以下对细胞凋亡的基本机制、信号传导、分子事件及疾病治疗等方面的研究成果综述如下。 （1）基本机制 多细胞动物体内的细胞具有一套相似的酶系统，激活后可以启动细胞凋亡。线虫Caenorhabditis elegans是研究细胞死亡机制的一种很好的生物模型。C.elegans 的三种基因产物：CED-3，CED-4和CED-9对凋亡而言是十分重要的，CED-3和CED-4促使凋亡，CED-9抑制凋亡。CED-3是一种caspase,即一种半胱氨酸蛋白酶，它在天门冬氨酸存在的部位之后切断蛋白。CED-3是一种酶原，通过自身切割而活化。CED-4与CED-3结合并激活CED-3，CED-9与CED-4结合从而阻断CED-4激活CED-3。通常，CED-9与CED-4和CED-3形成复合物是CED-3保持无活性状态。当引起细胞凋亡的刺激发生时，CED-9会分解从而活化CED-3，继而导致细胞死亡。脊椎动物已进化出一整套基因族，类似于C.elegans的死亡基因。哺乳动物的caspase类似于CED-3。Apaf-1是目前唯一已知的哺乳动物体内CED-4类似物。哺乳动物Bcl-2基因族产物与CED-9有关，但包括两个蛋白亚群，一个亚群抑制凋亡，一个亚群促进凋亡。 （2）死亡受体直接介导凋亡机制 从细胞生存环境发出的生存信号和内部感受器对细胞完整性的感知使细胞的凋亡机制随时处于戒备状态。一旦细胞失去与外界的联系或内部发生难以修复的损伤则启