基因工程重点

名词解释：1基因工程：狭义的基因工程：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。

广义的基因工程：是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；

下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。2．DNA重组技术：除少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为DNA重组技术。

3．基因组文库：将某种生物基因组DNA经超声波或限制酶部分酶切处理后，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部基因的克隆群体。

4．cDNA文库：将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群体。

5．PCR(polymerase chain reaction)：利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。

6．Southern印迹杂交：是将DNA分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。

7．基因诊断：通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）的存在、量的多少，结构变化与否、表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。

8．基因治疗(gene therapy)：指将人的正常基因或有治疗作用的基因，通过一定方式导入人体细胞，以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物高技术。

9．转基因动物：是人类按自己的意愿，借助基因工程技术，将外源基因导入动物受精卵，有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，使外源基因与动物基因组整合、在体内稳定表达并能稳定遗传给后代的动物。

10．转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰，这一技术称为转基因技术。

简答题：一．基因工程的基本原理：基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。分子遗传学、分子生物学、生物化学工程学是基因工程原理的三大基石。

1、提高外源基因的剂量——DNA复制及稳定遗传的分子遗传学原理。

2、筛选、修饰、重组基因转录调控元件——基因表达调控的分子生物学原理。

3、筛选、修饰、重组mRNA翻译调控元件——基因表达调控的分子生物学原理。

4、基因工程菌(细胞)的增殖及稳定生产——生物化学工程学的基本原理。

二、基因工程的理论依据

1、不同基因具有相同的物质基础

2、基因是可切割的

3、基因是可以转移的

4、多肽和基因之间存在对应关系

5、遗传密码是通用的

6、基因可通过复制把遗传信息传给下一代

三．双脱氧链末端终止法的原理

1）在单链模板、引物、4种dNTPs存在时，Klenow酶能不断地将dNTP加到引物3’-OH末端，合成出与单链模板互补的新链。

2）Klenow酶还能以ddNTP作为底物，使之掺入正在延伸的DNA链中，但因ddNTP缺少3’-OH，无法和下一个核苷酸之间形成磷酸二酯键，故在ddNTP掺入位置，链延长终止。四．基因文库的质量标准：

除尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：

1．克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；

2．载体的装载量必须大于基因的长度；

3．含有相邻DNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；4．克隆片段易于从载体分子上完整卸下；

5．重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。

五．PCR引物设计原则：

1．长度适宜，一般15-30bp；2．G+C含量40-60％；3．4种碱基应随机分布；4．内部不应存在互补序列；5．两条引物之间不应有多于4个碱基的互补；

6．3’端不应有任何修饰；7．5’端可修饰，如32P、生物素、荧光素。

六．寡核苷酸探针的设计原则：

1．长度18-50bp；2．G+C含量40-60%；3．分子内部不含互补区；

4．避免同一碱基连续出现（不能多于4个）；

5．与非靶序列70%以上同源性、或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。

七．基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现主要为重组质粒的不稳定性，包括结构不稳定性和分配不稳定性。

工程菌遗传不稳定性的产生机制：

1．受体细胞中的限制修饰系统对外源DNA的降解。

2．外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。

3．受体细胞的内源性转座元件促进重组DNA的缺失、重排。

4．重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配。

八．选择分离纯化方法时，应遵循下列原则：

1．选择不同分离纯化机理的方法联合使用；2．尽量选择高效的分离方法；

3．首先选择能除去含量最多杂质的方法；4．将最费时、成本最高的分离纯化方法排在最后。九．酵母菌表达外源基因的优势：

1．全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便。

2．具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。

3．能将外源基因表达产物分泌至培养基中。

4．大规模发酵工艺简单、成本低廉。

5．不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。

酵母菌表达外源基因的缺点：表达产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距。十．乳腺生物反应器的优点

1）产量高：2）活性高：表达产物经过充分的翻译后修饰加工，如糖基化、磷酸化和羧基化等，具有稳定的生物活性。

3）成本低：不需昂贵的生产设备（如发酵罐），动物饲养、繁殖成本比较低。

4）周期短：5）效益高：

论述题

一．什么是密码子的偏爱性，生物体对密码子偏爱性的决定因素是什么？怎样进行纠正？（1）生物体对密码子的偏爱性：不同生物、甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子的使用频率不同，具有一定的偏爱性。

（2）生物体对密码子偏爱性的决定因素：

①生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 X174）基因组中，密码子第3位上U和A出现频率较高。在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第3位上含G或C的简并密码子占90%以上。

②密码子与反密码子相互作用的自由能：适中的作用强度有利于蛋白质生物合成的迅速进行。弱配对作用可能使氨酰基tRNA进入核糖体A位需要花费更多的时间。强配对作用则

可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。

③细胞内tRNA的含量：简并密码子使用频率与相应tRNA的丰度呈正相关。表达量高的基因含有较少种类的密码子，这些密码子又对应于高丰度的tRNA分子，以便细胞能以更快的速度合成需求量大的蛋白质。对于需求量少的蛋白质，其基因含有较多与低丰度tRNA相对应的密码子，用于控制该蛋白质的合成速度。

密码子偏爱性对外源基因表达的影响：原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，因此哺乳动物基因在E.coli中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。（3）使外源基因上的密码子在E.coli中获得最佳表达的策略：

①外源基因全合成：按E.coli密码子的偏爱性规律，更换外源基因中不适宜的简并密码子。

②同步表达相关tRNA编码基因：对于那些含有密码子种类单一，出现频率较高，而本身分子量又较大的外源基因，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略。

二．鼠源单抗的缺点及其改进措施

鼠源单克隆抗体的缺点：1．重复用药会产生抗鼠抗体，降低疗效；2．分子量大，在体内穿透血管的能力差；3．生产成本高，不适合大规模工业化生产。

解决措施：通过基因工程，将鼠源单克隆抗体进行改造。

基因工程抗体：采用基因工程方法，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后，导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。

基因工程抗体分类：人源化抗体（嵌合抗体，改型抗体，完全人源化抗体）

小分子抗体（Fab抗体，单链抗体，单域抗体，超变区多肽抗体）1．人源化抗体：

1）嵌合抗体(chimeric antibody)：从杂交瘤细胞分离出鼠功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。

特点：降低了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。

2）改型抗体(reshaped antibody,Rab)：为降低来自鼠可变区中骨架区的免疫原性，Winter 克隆出鼠源抗体中与抗原结合的3个互补决定区(CDR)基因，以置换人抗体中的相应序列。特点：绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，又称CDR移植抗体，对人体几乎无免疫原性。

3）完全人源化抗体：以人的抗体基因置换小鼠的全套抗体基因，通过抗原物质刺激小鼠，表达出人源特异性抗体。

2．小分子抗体：是具有抗原结合功能的小分子片段，是针对完整抗体的分子量大、不易透过血管壁等不足而进行改进的。

1）Fab抗体：由重链VH区及CH1区与轻链以二硫键形式连接而成，大小只有完整抗体的1/3，具有完整抗体完全相同的抗原结合能力。

2）单链抗体(single chain of Fv, ScFv)：由抗体重链和轻链的可变区(VH和VL)通过连接肽重组并表达的一种抗体，大小只有完整抗体的1/6。

特点：抗原结合能力好、分子量小、穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。

3）单域抗体：只有V区基因小片段，分子量仅为完整抗体的1/12。

4）超变区多肽抗体：根据抗体分子中与抗原特异性结合区域的氨基酸序列，设计具有对特异性抗原识别与结合的多肽分子，一般只有几十个氨基酸。

三．基因工程的应用

A. 在医学上的应用：

（一）基因工程药物：基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质-

肽类药物。基因工程疫苗将帮助人类彻底战胜疫病

（二）基因诊断（三）基因治疗

B、在农业上的应用

（一）转基因植物：抗病虫害，抗逆，提高产量，改良品质，提高固氮效率，药物和疫苗的新载体，提高花卉的观赏价值

（二）转基因动物：生产药物，人工改良牛奶，培育动物优良品系，器官移植，观赏动物

C、在工业上的应用：制药工业，食品工业，酶制剂工业，酿酒工业，冶金工业

D、在能源和环保上的应用

（一）解决能源危机（乙醇--最有希望的替代能源；氢气或沼气--白色能源；石油--黑色能源）（二）环境保护：环境监测，环境污染治理（构建能降解有机污染物的工程菌，分解石油、吞噬汞、降解土壤中的DDT。）

E．基因工程对经济社会发展的影响（提高生命质量，延长人类寿命、改善农业生产，解决食品短缺、制造工业原料，生产贵重金属、解决能源危机，治理环境污染）

四．谈谈基因工程是一把双刃剑

（一）基因工程的应用（同上）

（二）基因工程的安全性问题

1、将外源基因引入人体，可能会破坏细胞生长的重要基因，也可能会激活原癌基因。

2、基因工程改造微生物，可能会导致一些致病性极强、难以控制新型病原微生物出现，并且可能逸出实验室并扩散。

3、转基因植物可能会对人类健康和环境造成难以预料的长期影响。比如破坏自然生态平衡，导致生物多样性丧失；杂草化—出现超级杂草；增加目标害虫的抗性；对人体健康产生影响。

4、转基因技术在人类身上的应用会造成巨大的社会问题，并对人类自身的进化产生影响。用在其它生物上同样具有危险性，所创造出的新物种有可能具有极强的破坏力而引发一场浩劫。

5、基因工程的发展将不可避免地推动生物武器的研制与发展，使笼罩在人类头上的生存阴影越来越大。