大鼠脑组织石蜡切片的免疫组化染色体会

大鼠脑组织石蜡切片的免疫组化染色体会
大鼠脑组织石蜡切片的免疫组化染色体会

大鼠脑组织石蜡切片的免疫组化染色体会

【摘要】脑组织石蜡切片的染色结果,易出现切片染色不清楚,脱片、假阳性,假阴性出现。免疫组化这些结果的出现,与组织固定,抗原修复,内源性过氧化物酶活性的灭活,抗体质量,显色试剂质量,苏木素质量,时间上的把握及技术人员熟练程度有关,得出了免疫组化的过程的很多细节及各个步骤的主要的注意事项,提

高脑组织切片的免疫组化染色操作技术。

【关键词】脑组织;石蜡切片;免疫组化;染色

随着免疫组化技术广泛应用于科学和医学各个领域的研究和诊断中,免疫组化的技术已经成为一种基本的检测技术,如何提高免疫组化的技术,特别是脑组织切片在免疫组化中的检测,是每一个科研人员在检测中最关心的问题,现将近几个月大鼠脑组织切片的

免疫组化技术的一些体会和细节概况如下:

1 脑组织固定体会

用4%的多聚甲醛固定,固定之前要保持脑组织的平整和完整,不能被挤压,以免影响细胞的形态,影响电镜下观察。

2 脑组织防脱片的处理

(1)传统的防脱片的处理方法有延长烤片的时间、提高烤片的温度和重新脱水[2]。免疫组化前,切片在58-60℃的恒温箱中烤2-24 h[1],在脱蜡和脱水过程中,把切片稍晾干后再行下一步的免疫组化过程。但不能进行高温烤片,在干燥的条件下加热切片可

免疫组化染色过程中存在的问题

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。 一、无色片 染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能:1、真阴性结果:整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果:即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况:(1)、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用。(2)、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了解决这个问题,目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等,其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任,而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片,了解切片中是否有自身对照,如果没有,就应告诉技术员采用阳性对照。因此,病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 抗体未覆盖上测试组织:当多块散开的小组织染色时,可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多,产生的原因也多种多样,为了便于说明,笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4%多聚甲醛(4%PFA)4?C固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用bouin’s固定RT 2h(6—8dtesis)or RT过夜(成年tesis) PBS缓冲液洗三次,每次5min,4?C保存于70%乙醇中。 2、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,52-54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—10μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于4?C70%乙醇中得组织样品 ↓ 80%乙醇15min ↓ 95%乙醇15 min ↓ 100%乙醇15min? 2 ↓ 1/2乙醇1/2二甲苯15 min ↓ 二甲苯透明5-10 min ↓ 1/2二甲苯1/2石蜡30 min

↓ 石蜡(1) 1。5hr ↓ 石蜡(2) 1.5-2.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20min ↓ 100%乙醇20min ↓ 95%乙醇10 min ↓ 80%乙醇10min ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ↓ 0.4%Tritonx RT10 min ↓ 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min

切片在PBS中浸泡5min*3 0、25%胰酶RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0、2%Tritonx—100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer,勿洗 一抗4 C overnightin blockingbuffer 取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗inblocking buffer GAR1:200 (GAM1:100),R T 1h 切片在PBS中浸泡5min*3 DAB显色5—10min(50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2) 如果就是增强型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS终止显色,HE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15min,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、1-0、5%盐酸乙醇分色1~2秒钟(或更久)

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭:37度,20分钟 7.一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净,3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净,3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备 (一)制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×106~1×107/ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl) 的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入 1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察, 视细胞浓度加入100~500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5~7天) (二)试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 (三)注意事项 1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN 3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)

一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项

文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟:想拿高分 文章,不学免疫组化怎么行?” 免疫组化王子毛博旁边插话: 是这个理,今天我就豁出去,将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零,唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化,免疫组织化学技术(immunohistochemistry ),是 项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位,定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理切片和组织芯片)和冰冻切片。石蜡切片,对组织形态保存好,保存时间也长,虽然对组织抗原暴露有影响,但可以抗原修复,所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候,我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析,得出理想的结果。这实在是一件憾事。 如下图,正常的结果应该是这样的:镜下细胞核呈蓝色,阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下,随机10 个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在光学显微镜下按染色程度(0 分阴性着色,1 分淡黄色,2 分浅褐色,3 分深褐色)

和阳性范围(1分0-25%,2分26-50%,3分51-75%,4分76-100%)评分,最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长,以下是他传授的独门绝技。 1.对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样,免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 般有阳性组织对照,阴性组织对照,阴性试剂对照,自身 对照。般来说,有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。 2.定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上;CK 应定位在细胞浆内;PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色,不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办?这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话,就只好赶鸭子上架,用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比较强,所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级:弱(+ ),中++ ),强(+++ )。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和

病理切片的特殊染色方法

1. Van Gieson苦味酸和酸性品红法 【染色方法】 (1)中性甲醛固定组织,石蜡切片; (2)组织切片脱蜡至水; (3)用Van Gieson液染1?5分钟; (4 )倾去染液,直接用95 %乙醇分化和脱水; (5) 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。 【结果】胶原纤维呈红色,肌纤维、胞质及红细胞呈黄色。2. Masson氏结缔组织三合染色法 【染色方法】 (1)石蜡切片厚6ym,脱蜡至水; (2)0.2 %冰醋酸水溶液浸泡片刻; (3)Masson氏染色液中5分钟或更长时间; (4)0.2 %冰醋酸水溶液浸泡片刻; (5) 5 %磷钨酸水溶液2?3分钟,再入0.2 %冰醋酸水溶液浸洗 (6 )投入淡绿、冰醋酸水溶液浸染5分钟或更长时间; (7)再入0.2 %冰醋酸水溶液浸洗片刻; (8)脱水、透明和封固。 【结果】胞浆和神经胶质纤维染红色,胶原纤维染绿色。 【染色方法】 (1 )石蜡切片、脱蜡至水; (2)0.25 %高锰酸钾液3分钟; (3 )蒸馏水洗2次; (4) 1 %草酸漂白即可; (5 )蒸馏水洗2次; (6) 2.5 %铁明矶水溶液媒染5?10分钟,蒸馏水洗多次; (7)二氨氢氧化银浸染1分钟,蒸馏水洗3次; (8)10 %甲醛液还原2分钟,蒸馏水洗3次; (9)0.2 %氯化金液调色1?2分钟,蒸馏水洗3次; (10)5%硫代硫酸钠固定5分钟; (11 )蒸馏水洗,需要时复染; (12)水洗、脱水、透明和封固。

【结果】网状维呈黑色,其他组织呈复染的颜色。 显示弹性、胶原纤维的双重组合染色法 【染色方法】 (1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水; (2)切片入70%乙醇中洗2分钟; (3)将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0.5?2小时; (4)直接入95%乙醇中分色数秒钟; (5)浸入蒸馏水洗2分钟; (6)用丽春红S液滴染切片5分钟; (7)直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次; (8 )将切片在空气中或冷风干燥; (9)二甲苯透明,中性树胶封固。 【结果】弹性纤维呈蓝绿色,胶原纤维呈红色,背景呈淡黄色 【染色方法】 (1)冰冻切片厚度8?15ym; (2)Harris苏木素,染约1分钟; (3)自来水洗后,用0.5%盐酸乙醇分化,再水洗直至胞核返蓝为止; (4)蒸馏水洗后移入70%乙醇内浸洗一下; (5)浸入苏丹III染液中约30分钟或更长时间(如果置于56 °C温箱中可适当缩短时间); (6)在70 %乙醇分化数秒钟; (7)待切片在空气中稍凉干或用冷风机吹干; (8 )及时用明胶甘油封片。 【结果】脂肪呈橘红色,脂肪酸不着色,胞核淡蓝色。 高碘酸一Schiff ( Periodic acid Schiff ,PAS)染色法 【染色方法】 (1) 切片脱蜡至蒸馏水; (2) 浸入高碘酸氧化液中10?20分钟; (3 )蒸馏水洗2次; (4) Schiff液染色10?30分钟;

冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子,以CD4为例) (1)冰冻切片室温晾干15分钟; (2)用组化油笔将待染组织圈好,置PBS中浸泡10分钟,以去除OCT;(3)用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时(此步可以不洗涤,把封闭液吸干即可); (4)加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA),4℃孵育过夜;(5) PBS洗3次,每次10分钟; (6)加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司),37℃孵育1小时; (7) PBS洗3次,每次15分钟; (8)封片后,荧光显微镜观察结果并拍照; (9)在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项:(1)整个实验过程中勿使表面干燥 (2)稀释、加二抗(荧光抗体)及此后的洗涤过程中注意避光 附注1:如目的分子为胞内分子,各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2:所用液体(表面分子染色不用0.3%TrixtonX100): (1)pH7.4 0.01MPBS: 配方为:0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为:Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压, pH7.2-7.4 (2)洗涤液:0.3%TrixtonX100-pH7.4 0.01MPBS,分装15ml/支-20℃保存 (3)封闭液:10%NGS-0.3% TrixtonX100-pH7.4 0.01MPBS,分装1.2ml/支-20℃保存 (4)抗体稀释液:1%BSA-0.3% TrixtonX100-pH7.4 0.01MPBS,分装1ml/支-20℃保存

免疫荧光实验步骤大全(精华版)

免疫荧光染色大全(精华版) 组织免疫荧光法 (1)将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h,脱蜡 (2)1×PBS 洗涤 3 次,每次 5min。 (3)0.5%Triton X-100(PBS 配制)室温通透 10min (4)1×PBS 洗涤 3 次,每次 5min。 注意:步骤(3)和(4)用于检测细胞核抗原,细胞膜抗原直接跳过此步骤(5)抗原修复:使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,微波炉微波高火3min,后转成低火 15min。 (6)1×PBS 洗涤 3 次,每次 5min。 (7)3% H2O2,室温孵育30min,目的是灭活内源性过氧化物酶。 (8)1×PBS 洗涤 3 次,每次 5min。 (9)使用1% BSA进行室温封闭 30min,用于封闭非特异性抗原表位。 (10)按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗,4°C 湿盒中静置过夜。(11)次日取出切片,室温下复温 30min。 (12)1×PBS 洗涤 3 次,每次 5min。 (13)选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上,37°C避光孵育30min。(14)1×PBS洗涤 3 次,每次 5min。 (15)避光条件下,DAPI 染液染细胞核,浓度和时间根据试剂说明书使用(16)1×PBS洗涤 3 次,每次5min。 (17)在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 (18)使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 (1)在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min (2)4%多聚甲醛固定细胞爬片15min (3)1×PBS洗涤 3 次,每次5min。 (4)0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透10min (5)1×PBS洗涤 3 次,每次5min。 (6)1%BSA室温封闭30min (7)弃掉封闭液,细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗,4℃孵育过夜(8)1×PBS洗涤 3 次,每次5min。 (9)细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 (10)1×PBS洗涤 3 次,每次5min。 (11)DAPI染细胞核,浓度和时间根据试剂说明书使用 (12)1×PBS洗涤 3 次,每次5min。 (13)用抗荧光淬灭剂封片 (14)荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光(悬浮细胞方法一) (1)收集悬浮细胞,细胞在冰浴中冷却,然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min,吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。

免疫荧光非特异性染色的消除方法

免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂,其产生的原因主要可分为以下几点: (1)一部分荧光素未与蛋白质结合,形成了聚合物和衍化物,而不能被透析除去。 (2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白,可与组织成分结合。 (3)除去检查的抗原以外,组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原),可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 (4)从组织中难于提纯抗原性物质,所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体,以致容易混淆。 (5)抗体分子上标记的荧光素分子太多,这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子,可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 (6)荧光素不纯,标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法,常用的方法有以下几种: (一)动物脏器粉末吸收法 常用肝粉(猪、大白鼠或小白鼠),其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50~100mg,在离心管中充分混匀,在室温中振动2h,4℃中过夜,再搅拌10min,高速离心(3000~15000r/min)30min,1~2次后,即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行,吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较,吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿,离心(3000~15000r/min)30min,除去上清液,再加入荧光抗体进行吸收,以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法,对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时,也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多,如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液,用生理盐水洗2~3次,12000r/min 10min离心沉淀,用其沉淀物吸收其荧

免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)

免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法 一、原理及应用 免疫组化,简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。 二、操作步骤: (1)将石蜡组织切片置于65°C恒温箱,烤片1h左右。 (2)脱蜡:二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精(由高到低)各5min。 (3)1×PBS 洗涤3次,每次 5min。 (4)0.5% Triton X-100通透(PBS配制),目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了,如果检测的是膜抗原无需通透,忽略该步骤。 (4)抗原修复:使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,微波炉微波高火 3min,之后转成低火 15-30min。 注:福尔马林或多聚甲醛固定,会导致蛋白交联,而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复!!抗原修复方法有多种,一般包括两大类:酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。(5)1×PBS 洗涤3次,每次5min。 (6)3% H2O2,室温孵育30min,目的是灭活内源性过氧化物酶。

(7)1×PBS 洗涤3次,每次5min。 (8)使用1% BSA 进行室温封闭30min,用于封闭非特异性抗原表位。 (9)根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗,4°C 湿盒中静置过夜孵育。 (10)次日取出切片,室温下复温30min。 (11)1×PBS 洗涤3次,每次5min。 (12)按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。 (13)DAB 显色:DAB 显色液按说明书配制,使用时滴加到血管组织上,显微镜下观察并计时,待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。(14)苏木素染细胞核:苏木素染液5-10min(根据苏木素染液使用时间的长短,来调整染色时间)→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。(15)脱水:梯度酒精(由低到高)各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 (16)中性树胶封片。 三、免疫组化结果分析原则及具体方法 (1)必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 (2)抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性。

石蜡切片免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020

对于石蜡切片: 1、烤片:60℃ 60分钟 2、脱蜡:二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70%乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复:高压修复,事先烧开锅中的水,修复盒中加入l柠檬酸钠,(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中),上汽后加热10分钟,关火。修复盒取出,放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶:玻片取出放入湿盒,加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中,现配现用,避光),室温孵育10分钟,PBS洗3次,每次5分钟。(也可不用去除内源性酶)。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清(原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子),室温孵育封闭30分钟。如果背景较高,可以4℃封闭过夜。不用洗,用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书,按照适当比例用(10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS)稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗, 4℃过夜,第二天取出复温45分钟。PBS洗3次,每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

做好免疫组化染色必须注意的问题

做好免疫组化染色必须注意的问题 一、为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好。 在免疫组化最后结果的判断时,常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象,经多方研究认为,它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散,肿瘤细胞无限制的生长和生长过速,导致肿瘤中间部分组织血液供给困难,造成缺血坏死,坏死细胞中的抗原由于机体的作用,可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质,这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是,由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定,组织就会自溶,抗原就会扩散,这是一非常普通的常识,但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间,在这段时间里,有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液,但标本较大,固定液的量又不足,当然由于固定液的渗透需要时间,当渗入到组织之中时,中间的细胞已发生了变化,抗原也随着发生扩散,这种现象在产酶多的器官是比较明显的,如胃癌,当切除后标本较大,虽然在手术室期间已放入了固定液,但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间,当固定液发挥作用时,组织已经发生变化。因此,这了达到免疫组织化学染色的要求,对于离体的组织尽量快的进行固定,有条件的应将其剖开,早取材,早固定。 二、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚,才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚,在较短的时间内脱水不完全,将可引起一系列的问题,比如浸蜡不彻底,切片不好完成,切不完整。由于先天不足,导致后来切片染色的脱落,造成染色的失败,或者由此反复操作,造成年人力物力的浪费,造成病理报告的延期发出等。因此,对取材的要求是除了要求要有艺术性外,即平整、外观好看,还要求适中。 三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折 应用于免疫组织化学染色的切片,对切片的质量要求较高,切片必须完整,平展、无汽泡,无邹折,这样有利在染色时的冲洗,有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展,免疫组化染色后,可出现染色不均匀的现象,颜色深浅不一,不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时,由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织,在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折,免疫组化染色后,在邹折的地方有深浅不一的颜色,这是一种假阳性,容易引走混淆。 四、切片的附贴必须牢固,必须使用合适的粘贴剂。 免疫组织化学染色前的前期准备工作,就是必须对新的载玻片进行处理,新的载玻片表面看起来很干净,有人认为不需要进行任何的处理,都能够适合使用,这是一种错误的想法。新出厂的载玻片,表面复盖着开一层油脂样的物质,如果不加以处理,对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是:新的载玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜,然后取出,经自来水彻底冲洗后,浸入酒精中达2小时以上,取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了-氨基-三乙氧基-硅烷(3-Aminopropyl triethoxy-silane)的稀释液(1:50用丙酮或无水乙醇稀释都可以)中硅化10分钟,后经无水乙醇洗2次,烘干即可使用。 五、切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破坏抗原。 应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理,如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟,PBS的反复冲洗,有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此,

常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法

常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法 吕俊耀1, 于晓军1, 刘卯阳2 ( 1.汕头大学医学院法医学教研室, 广东汕头515031; 2.北华大学医学院法医学教研室, 吉林吉林132003) 常规组织切片的制作过程较繁琐, 按具体制作效能分为固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等九大步骤。其中脱水有12 个步骤、透明有2 个步骤、浸蜡有3 个步骤、染色有23 个步骤, 一般要经过总计40~45 个步骤, 各个实验室根据自身的实际情况及工作习惯各有不同。事实上, 从尸体储藏到切片染色的整个过程中, 任何步骤出现问题均可影响切片的质量, 因此, 要提供高质量的石蜡切片, 必须对各种潜在的影响因素严加注意, 同时, 观察组织切片时, 还应对可能出现的切片染色质量问题给予充分考虑, 以避免制片过程中的人为假象干扰而作出错误诊断。现综合有关文献及笔者的经验, 讨论常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法( 表1) 。 1 固定和取材 组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精, 固定剂可与蛋白质交联结合、使之变性, 组织硬化、结构固定,此外其本身的变性物质可与染料结合, 增强着色能力。同时, 固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分, 产生不同的折光率, 使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。 常见的与固定过程相关的组织切片染色问题及解决方法见表1。在诸多影响切片质量的因素中, 尤以固定较为重要。 1.1 减少或去除组织切片中甲醛颗粒 甲醛饱和液偏酸, 影响细胞核的染色, 特别是放置较久后, 易析出沉积在组织切片中, 呈细小的黑褐色或黄黑色颗粒物, 影响观察。以甲醛饱和液和pH7.2 的PBS 缓冲液配制的10%中性甲醛固定液( 体积比为1∶9) 应用最普遍, 效果也相对较好, 可以减少和消除甲醛颗粒。如果现场无法配制PBS 缓冲液, 可在固定溶液中加入一些普通白粉笔, 使溶液呈中性或弱碱性。甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区, 以及自然腐败较重的组织, 可作为组织出血和血浆渗出指示剂。 1.2 防止组织固定不良

免疫组化染色过程中存在的问题原因分析及对策

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。 一、无色片 染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能:1、真阴性结果:整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果:即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况:(1)、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用。(2)、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了

过氧化氢。为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了

免疫荧光染色

荧光免疫染色和DAPI染色实验 1.实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting,两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白,但是由于免疫染色需要在原位进行,而且蛋白没有经过富集,因此其实验难度较高。 实验的基本原理是:利用固定剂(通常是甲醛或多聚甲醛)将细胞固定,使得细胞膜的通透性大大增加,并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性,从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭,可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合,而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合,这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域,利用二抗连接不同的荧光基团,就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光,从而显示目的基因的表达情况。 另外,免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内,核外,膜上以及一些较大的细胞器上),所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4,6-联脒-2-苯基吲哚,是一种常用的荧光染料,其作用机理与溴化乙锭(EB)等染色剂的机理类似:它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用,从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm,正好UV (紫外光)的激发波长是356nm,使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步,该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测,胚胎发育过程的检测,细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等,可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞: 可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培养细胞,然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片,70%乙醇中浸泡后,用无菌的镊子放置到6孔板内,然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养,待细胞贴在盖玻片上生长良好后,即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞: 把细胞先在固定液中固定,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳,可以在载玻片上用PDL等物质进行处理,以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片: 切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片:

冰冻切片的免疫荧光

免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1,动物组织直接OCT包埋,或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后,OCT包埋。-20℃保存3月,-80℃长期保存。请勿保存于液氮。 2,冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后,-20℃储存 3,切片从-20取出后,在通风橱放10-30分钟以去除水汽,4%PFA固定15分钟,或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片,3X5min 从此请保持玻片湿润 5,有时,抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请:选用稳定的抗原修复方式(真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热)…关注修复的温度,时间(抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间),抗原修复液必须遵循自然降温规律,使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液(A液枸盐酸缓冲液PH6.0,B液EDTA-Na缓冲液PH8.0,C液枸盐酸缓冲液PH4.5)

6,室温封闭1小时 封闭液:5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液:1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS(细胞因子,无需封闭的蛋白 7,一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗,1:1000 (alexa系列)1:300(dyelight )in封闭液,避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min, 12,DDW Rinse 13,抗淬灭剂封片,(避免气泡)避光置于通风橱过夜 14,干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1,动物组织取出后经固定-脱水-包埋(见随后操作步骤),制成石蜡包块 2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水:58℃20min-

组织切片制备及染色技术

组织切片制备及染色技术 (一)常规石蜡切片的制备: (1)取材与固定:切取组织时应使用锋利的刀、剪,切取组织块时,从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2~0.3cm,大小为1.5cm x 1.5cm x 0.3cm为宜。取好的组织块用10%福尔马林溶液固定24~48h。 (2)包埋:先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明,然后入溶融的石蜡中浸透每次30min,共3次;再包埋。 (3)切片:包埋好的石蜡块即可进行切片;切片的厚度为5μm左右。 (二)苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色方法: (1)脱蜡:主要用二甲苯脱蜡。 (2)梯度乙醇水化。 (3)自来水冲洗。 (4)苏木精染色:水化后的切片放入苏木精染液中浸5~20min,染细胞核。自来水冲洗3~5min。 (5)1%盐酸乙醇分化5~30s。自来水冲洗1~3min。 (6)弱碱性水溶液返蓝30s~1min。自来水充分冲洗5~10分钟。 (7)伊红染色:充分水化后的切片直接入伊红染色液中,染细胞质5~15min左右。(8)梯度乙醇脱水。 (9)二甲苯透明。 (10)中性树胶封片。 二、组织化学及免疫组织化学技术 (一)组织化学(histochemistry):一般称为特殊染色,基本原理是通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂,定位地显示组织细胞的特殊化学成分并保持原有的形态学改变,对一些代谢性疾病的诊断具有一定的参考价值。通过光镜或电镜观察,可以检测组织切片内的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等。 1.过碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain,PAS染色):过碘酸是一种氧化剂,它能氧化糖类及有关物质中的1.2乙二醇基使之变为二醛,醛与Schiff氏试剂结合,形成红色的取代色素而得到定位。PAS染色可显示糖原、中性黏液物质、基底膜、软骨、垂体、霉菌及寄生虫等物质。是广泛应用的染色方法。在肾小球肾炎时PAS染色可显示基底膜和系膜区的改变。 染色方法: (1)切片按常规脱蜡水洗,再用蒸馏水洗涤。 (2)0.5%~1%过碘酸水溶液氧化5~10min。 (3)蒸馏水充分洗涤,至少3次。 (4)Schiff氏试剂染10~30min。 (5)倾去染液后,直接用亚硫酸冲洗液处理切片3次,每次2 min,以达到分化。 (6)自来水冲洗5~10 min,使之显现出红色。然后蒸馏水洗1次。 (7)明矾苏木精染核,自来水充分洗涤。 (8)95%乙醇及无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 结果判定:PAS阳性物质呈鲜紫红色,其它组织淡粉红色,细胞核呈浅蓝色。 2.结缔组织的染色方法 一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言,其结构特点是细胞间质内基质外含有较多的纤维成分,主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维,我们仅简述这三种纤维的常见染色方法。

免疫荧光实验步骤

免疫荧光实验步骤 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020

免疫荧光实验步骤 1. 直接免疫荧光法测抗原 (1)基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 (2)试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水(PBS):L, 荧光标记的抗体溶液:以L,的PBS进行稀释 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只(内有L,的PBS 1500ml) 有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫) 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 (3)实验步骤 ① 滴加L,的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。 ② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。

③ 取出玻片,置玻片架上,先用L,的PBS冲洗后,再按顺序过L,的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。 ④ 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。 ⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示: (-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。 (4)注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。 2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3)为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 ① 标本自发荧光对照:标本加1-2滴L,的PBS。 ② 特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。

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