啤酒酵母中乳杆菌的分离鉴定
２００７Ｎｏ．１ＳｅｒｉａｌＮｏ．１６６
ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ
在啤酒生产过程中，酵母的纯种培养和纯种发酵
对啤酒的质量至关重要。但实际生产中啤酒厂的酵母一般要连续使用多代，在循环使用过程中很容易染菌。乳酸菌是最容易污染、且危害较大的细菌。当使用受到乳酸菌污染的酵母进行啤酒发酵时，会导致啤酒产生丝状浑浊、酸味增加、双乙酰超标等质量问题。因而对酵母定期进行微生物检测、控制乳酸菌的污染是非常重要的。本文对种酵母中存在的乳酸菌进行了分离和初步鉴定。１材料与方法１．１材料１．１．１样品
连续使用５代以上的种酵母：取自济南某啤酒厂。１．１．２培养基
ＵＢＡ固体培养基：酵母膏６．１ｇ，蛋白胨１５ｇ，葡萄糖１６ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．３１ｇ，ＫＨ２ＰＯ４０．３１ｇ，ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ０．１２ｇ，ＮａＣｌ０．００６ｇ，ＦｅＳＯ４?７Ｈ２Ｏ０．００６ｇ，ＭｎＳＯ４?４Ｈ２Ｏ０．００６ｇ，番茄汁２４４ｍＬ，啤酒２５０ｍＬ，琼脂２０ｇ。蒸馏水定容至１０００ｍＬ，ｐＨ６．０。
改良ＵＢＡ固体培养基：ＵＢＡ固体培养基中加入２％ＣａＣＯ３。用来分离种酵母中的乳酸菌。
ＰＹＧ培养基：蛋白胨０．５ｇ，胰酶解酪朊０．５ｇ，酵母膏１．０ｇ，葡萄糖１．０ｇ，盐溶液４．０ｍＬ，蒸馏水１００ｍＬ，ｐＨ值自然。用来测定乳酸菌发酵葡萄糖产乳酸的情况。
盐溶液成分：无水ＣａＣｌ２０．２ｇ，ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ０．４８ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ，ＮａＨＣＯ３１０ｇ，ＮａＣｌ２．０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。
麦汁培养基：将粉碎的粗麦芽与水按１：４在６３℃水浴中保温１ｈ，升温至６５℃继续保温１ｈ，至碘检无色。糖化醪用纱布过滤，向滤液中加入３０ｍＬ／Ｌ麦汁澄清剂，煮沸３０ｍｉｎ后过滤，麦汁糖度调至１２°Ｐ。麦汁培养基用来测定低温下乳酸菌的发酵产酸性能。１．２方法
１．２．１乳酸菌的分离纯化
以无菌操作取２５ｇ酵母泥于装有２２５ｍＬ无菌生理盐水的５００ｍＬ三角瓶中，振荡均匀。用１ｍＬ无菌移液管吸取１．０ｍＬ稀释液，注入到含９ｍＬ无菌生理盐水的试管中，按相同的方法逐次稀释到１０－６。分别取１０－４、１０－５、１０－６３个稀释度的菌悬液０．１ｍＬ涂布在改良ＵＢＡ固体培养基倾倒的平板上，３０℃恒温培养５ｄ，挑取产生溶钙圈的单菌落，反复划线分离至获得纯菌株，４℃斜面保存。
啤酒酵母中乳酸菌的分离鉴定
成
堃，于同立
（山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南２５０３５３）
摘
要：从啤酒生产所用的酵母菌中分离得到２株乳酸菌，经鉴定为短乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）和有害片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
ｄａｍｎｏｓｕｓ）。对这２株乳酸菌在麦汁中进行７２ｈ发酵产酸性能的实验，结果表明，该２株菌均使麦汁酸度上升０．６°Ｔ，因而会导致接种后的麦汁酸败。
关
键
词：啤酒酵母；乳酸菌；分离；鉴定
中图分类号：Ｑ９３－３３１
文献标识码：Ｂ
文章编号：２０５４－０５７１（２００７）０１－００５０－０３
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｂｅｅｒｙｅａｓｔｓｔａｒｔｅｒ
ＣＨＥＮＧＫｕｎ，ＹＵＴｏｎｇ－ｌｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａｎｄｏｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊｉ＇ｎａｎ２５０１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｅｅｒｙｅａｓｔｓｔａｒｔｅｒｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓａｎｄＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｄａｍｎｏｓｕｓ．Ｔｈｅｉｒａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｂｉｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｗｏｒｔｍｅｄｉｕｍｆｏｒ７２ｈ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｏｔｈｏｆｔｈｅｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｍａｄｅｔｈｅａｃｉｄｉｔｙｏｆｗｏｒｔｉｎｃｒｅａｓｅ０．６°
Ｔ，ｗｈｉｃｈｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｓｐｏｉｌａｇｅｏｆｗｏｒｔａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｅｅｒｙｅａｓｔ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
收稿日期：２００６－０７－１１
作者简介：成堃（１９８２－），女，山东济南人，在读硕士研究生，研究方向为现代酿酒技术。
ＥｘｐｅｒｉｅｎｃｅＥｘｃｈａｎｇｅｓ
５０??
２００７年第１期总第１６６期中国酿造
注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性。（下同）。
表３乳酸菌Ｌ２、Ｌ３的碳水化合物发酵产酸鉴定结果
Ｔａｂｌｅ３．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｂｙ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｆｏｒＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＬ２ａｎｄＬ３
项目
Ｌ２
苦杏仁苷－＋阿拉伯糖＋－纤维二糖－＋七叶灵＋＋果糖＋＋半乳糖＋＋乳糖＋－麦芽糖＋＋甘露醇
－
－
菌株
Ｌ３松三糖蜜二糖棉籽糖鼠李糖核糖水杨苷山梨醇蔗糖海藻糖－＋＋－＋－－－＋－－＋－－＋＋－
＋
Ｌ２Ｌ３项目
菌株
经验交流
１．２．２乳酸菌的鉴定
乳酸的定性测定：无菌操作取菌株１环，接入ＰＹＧ
培养基中，３０℃培养４８ｈ。采用纸层析法定性测定ＰＹＧ发酵液中是否含有乳酸，以确定产乳酸细菌。
纸层析法：①展开剂：水：苯甲醇：正丁醇以１：５：５混合，然后加１％甲酸。②显色剂：０．０４％的溴酚蓝乙醇溶液，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调ｐＨ６．７。
将国产新华滤纸裁成２５ｃｍ×２５ｃｍ大小，在纸下方距边约３ｃｍ处画条横线，每隔３ｃｍ画一点作为点样位置。毛细管点样，用２％的标准乳酸溶液作为对照。将滤纸放入层析缸，先用展开剂饱和已点样的滤纸过夜，然后加展开剂开始层析。上行约２０ｃｍ，取出晾干后喷显色剂，观察样品上行是否出现有黄色斑点，测量各显色斑点中心与点样点之间的距离ｄ１和点样点到展开剂前沿的距离ｄ２。计算Ｒｆ值：Ｒｆ＝ｄ１／ｄ２
培养特征和形态特征鉴定：将菌株接种在ＵＢＡ固体培养基倾倒的平板上，３０℃恒温培养７２ｈ，观察菌落特征。挑取单菌落，涂片，革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态。
生理生化特征鉴定［１］：将菌株依次进行碳水化合物发酵产酸实验、过氧化氢酶实验、精氨酸产ＮＨ３实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、Ｈ２Ｓ的产生实验等。１．２．３产酸性能实验
５００ｍＬ三角瓶中装２５０ｍＬ麦汁培养基，接入乳酸菌的菌悬液，使麦汁中菌液浓度约为０．５×１０３个／ｍＬ。１２℃培
养７２ｈ。
每６ｈ取样１次，测定酸度。以时间为横坐标，酸度为纵坐标绘制产酸曲线。１．２．４酸度测定
发酵液１ｍＬ置于１００ｍＬ三角瓶中，用５０ｍＬ冷却后的蒸馏水稀释，以酚酞为指示剂，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ标准溶液滴定至溶液显微红色，记录用去的ＮａＯＨ标准溶液体积。酸度（°Ｔ）以１００ｍＬ发酵液中的产酸量计，即：
酸度（°Ｔ）＝ＣＮａＯＨ×ＶＮａＯＨ×１００
２结果与讨论
２．１乳酸菌的分离纯化
将种酵母的稀释液涂布在改良ＵＢＡ固体培养基上，培养５ｄ后，挑取平板上溶钙圈大的典型菌落。共得到５株菌种，依次命名为Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５。２．２乳酸菌的鉴定２．２．１乳酸的定性测定
利用纸层析法对２％标准乳酸溶液和Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５菌的ＰＹＧ发酵液进行对比实验，结果见表１。根据Ｒｆ值测定的结果，在纸层析中Ｌ２和Ｌ３发酵液
的Ｒｆ值与乳酸的Ｒｆ值基本一致，说明菌株Ｌ２、Ｌ３能够发酵葡萄糖产生乳酸。
样品乳酸Ｌ１Ｌ２Ｌ３Ｌ４Ｌ５Ｒｆ值
０．７２６
０．５１９
０．７２７
０．７２０
０．６１０
０．５４６
表１菌株Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５发酵液Ｒｆ值的测定结果
Ｔａｂｌｅ１．ＲｆｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４ａｎｄＬ５
菌株染色培养特征形态特征
Ｌ１
Ｇ
－
菌落圆形，乳白色，表面光滑，边缘圆整，湿润，中央隆起，φ１２ｍｍ细短杆菌，单个排列
Ｌ２Ｇ
＋
菌落圆形，白色，扁平，表面粗糙，较透明，边缘有缺刻，φ１ｍｍ
短杆菌，菌体两端圆形，单个或呈短链排列Ｌ３Ｇ
＋
菌落圆形，白色，表面平整，边
缘整齐，不透明，φ１．５ｍｍ
细胞圆球形，成对排列，
有的沿着垂直的两个平
面交替分裂形成四联状Ｌ４Ｇ－
菌落形态较不规则，浅土黄色，湿润较透明，似鼻涕状细长直杆菌，菌体外有一层荚膜，两端较尖Ｌ５Ｇ
－
菌落圆形，淡黄色，表面光滑，边缘整齐，湿润不透明，表面隆起，似小山苞状粗短杆菌，有的交联成八字形，有的弯曲成弧形，菌体两端圆滑
表２菌株Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５的培养特征和形态特征
Ｔａｂｌｅ２．ＣｏｌｏｎｙａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４ａｎｄＬ５
５１??
２００７Ｎｏ．１ＳｅｒｉａｌＮｏ．１６６
ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇ
２．２．２培养特征和形态特征鉴定（见表２）
根据乳酸定性测定和革兰氏染色的结果，只有Ｌ２、Ｌ３属革兰氏阳性菌，且能够发酵葡萄糖产乳酸，符合乳
酸菌的基本特征。对Ｌ２、
Ｌ３进行其他生理生化特征鉴定。２．２．３生理生化特征鉴定
根据对菌株Ｌ２、Ｌ３形态学、生理生化等的鉴定，结果如表３、表４所示，认为Ｌ２、Ｌ３分别为短乳杆菌（Ｌａｃｔｏ－ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）和有害片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｄａｍｎｏｓｕｓ）。２．３产酸性能实验
向麦汁培养基中接入Ｌ２、Ｌ３的菌悬液，培养７２ｈ的产酸结果见附图，２株菌均使麦汁培养基的酸度上升约０．６°Ｔ，这足以使接种后的麦汁酸败。
３结论
从啤酒生产用的种酵母中分离到２株乳酸菌，经鉴定认为分别是短乳杆菌（
Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）和有害片球菌（Ｐ．ｄａｍｎｏｓｕｓ）。对２株菌的产酸性能测定表明，２株菌均能显著改变麦汁的酸度，对啤酒生产带来不利影响。通过对种酵母进
行微生物检测，可以大体了解种酵母的卫生情况，及时发现问题，采取相应措施，如更换新的酵母等，从而更
好地指导生产。
参考文献：
［１］凌代文．乳酸细菌分类鉴定及实验方法［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９９．
［２］周广田，
等．啤酒酿造技术［Ｍ］．济南：山东大学出版社，２００４．［３］陈晓平，刘华英，魏晓川，等．自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究［Ｊ］．食品科学，２００６（２）：９１－９３．［４］杨晓晖，籍保平，李
博，等．泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及
其发酵性能的研究［Ｊ］．食品科学，
２００５（５）：１３０－１３３．［５］李凤云．ＮＢＢ培养基在啤酒工厂中的应用［Ｊ］．啤酒科技，２００３（１２）：２０－２５．［６］邓放明，
李罗明，尹华，等．碎鲜辣椒发酵制品发酵用乳酸菌
的选育与接种发酵试验［Ｊ］．食品科学，２００５（３）：１０６－１０８．
附图
乳酸菌
Ｌ２、Ｌ３发酵产酸曲线
Ａｔｔａｃｈｅｄｆｉｇｕｒｅ．Ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＬ２ａｎｄＬ３
ＥｘｐｅｒｉｅｎｃｅＥｘｃｈａｎｇｅｓ
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表４乳酸菌Ｌ２、Ｌ３其他生理生化特征鉴定结果
Ｔａｂｌｅ４．Ｏｔｈｅｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆ
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＬ２ａｎｄＬ３
菌株过氧化氢
酶实验
从精氨酸产ＮＨ３硝酸盐还原实验明胶液化实验
Ｈ２Ｓ的
产生Ｌ２－＋－－－Ｌ３
－
－
－
－
－
５２??
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基
BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定 刘同杰1，李云1，吴诗榕1，金乐天1，2，张国华1，杨浣漪1，何国庆1 （1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州 310058）（2.朝鲜韩德秀平壤轻工业大学，朝鲜平壤） 摘要：为进一步描述我国传统面食发酵剂的理化性质和菌落组成，收集了北方地区6份发酵剂样品，测定了其酸度和菌落总数，并对分离、纯化、初筛后得到的75株细菌和60株酵母菌进行了测序鉴定。结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。鉴定出包括短乳杆菌 （Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）在内的乳酸菌8种；酵母菌4种，其中优势菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；其他细菌6种，主要为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和醋杆菌。结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。 关键词：酸面团；菌相分析；16S/26S rDNA测序；生物多样性；系统发育树 文章篇号：1673-9078(2014)9-114-120 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.09.020 Isolation and Identification of Bacteria and Yeast from Chinese T raditional Sourdough LIU T ong-jie1, LI Yun1, WU Shi-rong1, JIN Le-tian1,2, ZHANG Guo-hua1, YANG Huan-yi1, HE Guo-qing1 (1.College of Biosystems Engineering and Food Science of Zhejiang University, Zhejiang provincial key laboratory of Food Microbiology, Fuli Institute of Food Science of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) (2.DPRK Han Dexiu Pyongyang University of light industry, Pyongyang, DPRK) Abstract: In this study, the physicochemical properties and microbial profile of traditionally fermented sourdough for Chinese steamed bread were examined. Six samples of sourdough were collected from northern China. Acidity and colony counts were measured. After isolation, purification, and preliminary screening, 75 strains of bacteria and 60 strains of yeasts were obtained and identified by DNA sequencing. The pH was between 3.73 and 5.46 and total titratable acid (TTA) values ranged from 8.3 to 19.8 mL. In all the samples, the number oflactic acid bacteria (LAB) and yeasts ranged from 8.35±0.07 to 9.75±0.12 Log cfu/g and 6.31±0.22 to 8.68±0.04 Log cfu/g, respectively. Eight LAB species, including Lactobacillus brevis, L. plantarum, and L. sanfranciscensis, and six other bacterial species, including Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, and three species of Acetobacter, were identified. Among the four identified yeasts, the dominant species was Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Chinese traditional starter cultures for flour-based food are complex bacterial floras dominated by LAB and yeast, in addition to several other microorganisms, including Bacillus spp., Acetobacter spp., and even pathogenic bacteria. Differences in microbial species compositions among LAB and yeasts in samples from different areas were identified by comparing species distributions in different sourdough samples. Key words: sourdough; elucidation of microbial flora structure; 16S/26S rDNA sequencing; biodiversity; phylogenetic tree 我国传统的面食发酵剂类似于西方发酵面包用的酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面收稿日期：2014-04-17 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371826） 作者简介：刘同杰（1989-），男，在读博士，研究方向：传统发酵食品通讯作者：何国庆（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术及发酵工程肥”等[1]，具有悠久的使用历史。上世纪80年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。究其原因，活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品 114
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
乳酸菌菌种的分离筛选方法解读
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特性菌株的筛选
中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特 性菌株的筛选 本研究采用选择性培养基对河南、四川、西藏、云南、内蒙古和新疆等地区的18份人体粪便样品中的双歧杆菌进行了分离纯化,并采用16S rRNA基因序列分析法对分离到的29株双歧杆菌进行了鉴定。以B.animalis subsp.Iactis V9为参照,通过耐酸性、人工消化液和胆盐耐受试验,筛选出胃肠道转运过程中耐受性较好的4株双歧杆菌。 并对筛选出的双歧杆菌进行了脱脂乳发酵特性和贮藏特性的研究。试验结果表明,从18位中国部分地区健康人体粪便中分离得到29株双歧杆菌,经16S rRNA 基因序列分析法将IMAUFB064、IMAUFB065和IMAUFB091等9株菌鉴定为B. longum,其中河南6株、四川2株和新疆1株；将IMAUFB071、IMAUFB073、IMAUFB084、IMAUFB090和IMAUFB092等20株菌鉴定为B.pseudocatenulatum,其中四川9株、西藏7株、云南3株和内蒙古1株。 29株双歧杆菌中有24株在pH3.0、3.5和4.0的改良MRS培养液中生长良好,初筛出的24株双歧杆菌分别经pH3.0、2.5、2.0人工胃液消化3h后,存活率高于V9(84.97%)的菌株有2株,分别为IMAUFB084(85.98%)和MAUFB073(85.66%),占总菌数的6.90%,各菌株在不同pH值人工胃液中耐受性有显著差异 (P<0.05),随着pH值的降低,供试菌株对模拟人工胃液的耐受性也随之降低。4株复筛出的双歧杆菌在人工肠液消化8h后,其中MAUFB090的存活率为101.8%,高于V9(97.84%),MAUFB073(97.19%)、IMAUFB084(94.38%)和IMAUFB064(89.93%)都低于V9的存活率。 4株双歧杆菌均能耐受2.0%胆盐浓度,但各菌株的延迟时间差异显著
大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案
鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验 实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。 1 病料采集 1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。 1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。 1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。 2 菌的分离培养及鉴定 2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。 培养基： A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1）， B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。）， C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。 2．2 样品触片镜检 涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。 2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。 2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析乳杆菌作为公认的安全级微生物,具有促消化、抗菌、增强免疫力等多种益生功能,广泛应用于食品工业、医药工程和畜牧业,其中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌较为常用。在发酵工程中,噬菌体的污染可造成不可忽视的后果,严重影响产品品质,甚至导致发酵失败。 本研究通过噬菌体富集法从酸菜中分离出两株烈性乳杆菌噬菌体,分别命名为LpeD和Lpa804,并对这两株噬菌体进行了生物学特性的鉴定。通过电镜观察,噬菌体LpeD和Lpa804均具有典型的二十面体头部和非收缩性尾部,均属于尾噬菌体目、长尾噬菌体科。 根据宿主范围测定结果,噬菌体Lpa804可感染植物乳杆菌(L.plantarum PA106和L.plantarum SC),而噬菌体LpeD可感染戊糖乳杆菌(L.pentosus KLDS1.0413)和植物乳杆菌(L.plantarumKLDSl.0344)。一步生长曲线的测定结果显示,噬菌体LpeD的潜伏期为15min,裂解期为90min,裂解量为194PFU/cell;噬菌体Lpa804的潜伏期为30min,裂解期为105 min,裂解量为221 PFU/cell。 理化因素对噬菌体的影响结果表明,噬菌体LpeD和Lpa804均对热敏感,LpeD 在56℃作用2 min全部失活,Lpa804在63℃作用2 min全部失活。噬菌体LpeD 和Lpa804在pH 4-12的环境中较为稳定,显示了较强的酸碱耐受性。 紫外线照射并不能使噬菌体LpeD和Lpa804完全灭活,二者在紫外线照射20 min后均仍有部分噬菌体颗粒存活。噬菌体LpeD和Lpa804对乙醇和异丙醇较敏感,35%乙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%乙醇作用10 min可使Lpa804 全部失活。 35%异丙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%异丙醇作用10 min可使
实验方案(双歧杆菌的分离)
1 双歧杆菌的分离 1.1 样品 取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。 1.2 培养基 根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。 1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP） 成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g 葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。 1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦） 成份：酵母膏5g 淀粉0.5g 蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g 胰蛋白胨5g 溶液A 10ml 大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml 葡萄糖10g 溶液C 50ml 乳糖3g 琼脂 15g 吐温80 1g pH 7.2 牛肝提取液150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。 溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。 溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。 溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。 1.2.3 NPNL培养基(孙雪) 培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，
植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。 溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。 溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。 1.3 分离方法 取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。 1.4 分离培养 在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性 双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。 培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案 实验原理： 1、大肠杆菌的性质： 大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： 沙门氏杆菌是G-直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备： （1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 （2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 （3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： （1）取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。 （2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： （1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H2S），并做穿刺实验于三糖铁上。37°C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 （2）检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁上，37°C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。
乳酸菌得分离、纯化与鉴定
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
微生物学实验报告——双歧杆菌分离
微生物学实验报告 乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化 2012/6/5 实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。 实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。 因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。 本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 实验方法： 1.培养基 双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】 枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】 2.简易厌氧罐法 将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。 图1. 实验中使用的简易厌氧罐
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理： 1、大肠杆菌的性质: 大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H 2S,不能利用xx酸盐。 半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： -沙门氏杆菌是G直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H 2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌 醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法
见附 1. 二、标本制备： (1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 (2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 (3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： (1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。 (2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门 氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： (1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H 2S),并做穿刺实验于三糖铁上。37 C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 (2) 检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁 上，37 C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 小组组员: 一、实验目的 1.学习分离纯化酵母菌的技术与方法 2.了解培养基的配置与灭菌技术 3.增强无菌操作技术的意识 二、基本原理 从混杂的微生物群体获得只含某一种某一株微生物的过程叫做微生物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 三、实验材料及用具 1.用品：苹果、葡萄糖、琼脂、水、1%孟加拉红水溶液、马铃薯 2.设备与器材：1ml的无菌吸管、无菌培养皿等. 四、实验步骤 1、马铃薯培养基的配置 培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、水 200毫升、 pH 自然。配置方法: （1）配制20%马铃薯浸汁：取去皮马钓薯40g，切成小块，加水200ml.加热煮游30 min ，用纱布过滤，然后补足失水互所需体积。121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备用。 （2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加入2g蔗糖，加热煮沸后加入4克琼脂，继续加热融化并补足失水。 （3）分装、加塞，包扎。 （4）高压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min