实验十二聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验十二聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验十二聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验十二聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、目的

了解聚丙烯酰胺盘状电泳的基本原理和操作技术。

二、原理

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶,是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂和加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构,其网眼的孔径可用改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选用7.5%聚丙烯酰胺凝胶,分离比较大的分子,如核糖体核酸时则用2.5%凝胶。

凝胶电泳分辨力较高。

三、器材

1.电泳仪(600V)及盘状电泳电泳槽。

2.电泳玻璃管(用碱性较低的玻璃管),内径5-7毫米,长80-100毫米。

3.玻璃架(制胶时用来垂直插放玻璃管)。

4.微量注射器或微量吸管。

5.带长针头的注射器。

6.日光灯。

7.带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管。

四、试剂和材料

1.唾液。

2.贮液和工作溶液:按下页表配制。

五、操作方法

一般先制分离胶,再在分离胶上面制作浓缩胶。

l. 分离胶的制备

将贮液由冰箱取出等达到室温后再按下表中的比例配制工作溶液。先将分离胶液与过硫酸分别放在真空干燥器中。待抽出溶解的空气后取出,赶快混匀,用带长针头的注射器吸取一定量的胶液,沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中(玻璃管的一端用带有玻璃珠或小段玻璃棒的乳胶管塞住,乳胶管中加二滴40%蔗糖后插在玻璃架上),灌入的分离胶液高约6.5厘米,然后立即用带弯针头的小注射器在已加入的分离胶液面上,距胶面约0.l厘米处沿管壁缓缓加人3-5毫米高的蒸馏水层,切忌使加入之水呈滴状坠入胶液,这样会使顶部凝胶浓度变稀,改变凝胶孔径。

水层放好后,静置胶液使进行聚合反应。正常情况下10分钟开始聚合,应控制在30分钟到1小时内完成聚合。

刚加水时看出有界面,后逐渐消失。等到再看出界面时表明凝胶已经聚合,再静置30分钟便聚合完全。

2.浓缩胶的制备

用注射器吸去分离胶上的水层,用滤纸条吸去残留的水液(滤纸不要接触胶面)。

按比例混匀浓缩胶液(也预先抽气,抽气时不要与核黄素混合,抽完气后再混合),先用这种胶液很快漂洗一下分离胶的顶部,除去漂洗液后,按上法加人浓缩胶液约0.5-l厘米高,并立即仔细加水层。然后在距管10厘米处用日光灯照射进行光聚合。正常情况下照射6-7分钟就可看到浓缩胶显乳白色,表明聚合开始。继续照半小时,使聚合完全。

除去水层,吸干后用上电极槽缓冲液洗涤,再将这种缓冲液加至管顶,在室温放置0. 5—1小时就可使用。

浓缩胶应在临用前制备。

3.加样

盘状电泳所需样品很少,用1毫克/毫升浓度的样品液每管需5—100微升。

加样前先把玻璃管下边的橡胶塞除去,要注意先拉开乳胶管使空气进人,再拔下来,防止将凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液,把管固定在上槽的洞中,要保证凝胶管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端悬上一滴缓冲液,再把上槽放在下槽上,避免管下有气泡。管中凝胶表面上部及上槽灌满电极缓冲液。

将4号贮液1份,水3份,20%蔗糖溶液4份,混和,然后取唾液3微升,加上述混合液0.15毫升,混匀后小心地加在浓缩胶与电极缓冲液界面处,因样品液比重大,即平铺在凝胶表面。

指示染料一般用溴酚蓝或酚红,通常每管加0.l%的染料溶液0.005毫升,指示染料与样品混合后加人。

4.电泳

加完样后接通电源,负极在上,正极在下。调节电流,开始时用l-2毫安/管,电泳l—2分钟,再升高电流到约3-5毫安/管,不要一开始电流很高。电流最好不超过5毫安,以免产热过多,必要时应进行冷却或在冷库内进行。

当指示染料迁移到凝胶柱的下端附近时就可停止电泳,关闭电源,取出玻管。

缓冲液可再行使用,但上下槽缓冲液不能混淆,因下槽缓冲液中已混人催化剂及氯离子(快离子),如将它当作上槽液就要影响电泳效果。

5.凝胶的取出

将一针头长约10厘米的注射器吸满水。将针头插入凝胶与管壁之间,并紧贴管壁,一面注入水一面慢慢旋转玻管并推针前进,靠水流压力和润滑作用使玻管内壁与凝胶分开,待水从玻管一端流出时,再慢慢将针头退出。然后去掉针头,用注射器向玻管中快速注射水,将凝胶压出玻管。如凝胶浓度较高,取出困难,可用10%的甘油水溶液代替水注入。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。

6.固定

为防止凝胶柱内已分离成分的扩散,需进行固定。方法是:把剥出的凝胶柱浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟;或浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸液配制的染色液中,同时进行固定和染色。

7.染色

在6%乙酸(含1%考马斯蓝)中染色30min,用甲醇:水:浓氨水(64:36:1)脱色1-2天。

琼脂糖凝胶电泳标准操作流程

琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术,此关为能力考核,通关成功后,代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是:1、DNA分子大小;2、琼脂糖浓度; 3、DNA构想; 4、所用的电压; 5、琼脂糖种类; 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时,出现不同的效应。254nm的紫外线照射时,灵敏度最高,但对DNA损伤严重;360nm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对DNA损伤小,所以适合

对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高,且对DNA 损伤不是很大,所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段; 2、试剂 Hind III digest DNA Marker(分子量标准)(TaKaRa);D2000(TianGen);BIOWESTAGAROSE(西班牙琼脂糖);加样缓冲液(6x):溴酚黄;电泳缓冲液(1×TAE);溴化乙锭(EB); 3、仪器及器具 (1)移液器、吸头、锥形瓶 (2)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 (3)紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗:首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净,包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘(EB污染,需独立清洗)。清洗流程为:先用自来水冲洗三次,然后用纯水冲洗三次,最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收,则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶:根据基因组片段大小,配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸,然后量取一定量的电泳缓冲液(1×TAE)至锥形瓶中,再称取相应量的BIOWESTAGAROSE(西班牙琼脂糖)倒入锥形瓶中,摇匀并

琼脂糖凝胶电泳及其影响因素

琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGE胶的配制(DNA电泳用)50ml体系: 丙烯酰胺有效分离 (bp) 丙烯酰 胺30% (ml) 10×TBE (ml) ddH2O (ml) TEMED (μl) 过硫酸铵 10%(μl) 3.5% 100-1000 5.83 5 39.17 25.0 250 5.0% 100-500 8.33 5 36.67 25.0 250 8.0% 60-400 13.33 5 31.67 25.0 250 12.0% 40-200 20.0 5 25.00 25.0 250 15.0% 25-150 25.0 5 20.00 25.0 250 20.0% 5-100 33.33 5 11.67 25.0 250 5ml体系: 丙烯酰胺丙烯酰胺 30%(ml) 10×TBE (ml) ddH2O (μl) TEMED (μl) 过硫酸铵 10%(μl) 3.5% 0.583 0.5 3.917 2.5 25 5.0% 0.833 0.5 3.667 2.5 25 8.0% 1.333 0.5 3.167 2.5 25 12.0% 2.00 0.5 2.5 2.5 25 15.0% 2.50 0.5 2.0 2.5 25 20.0% 3.333 0.5 1.167 2.5 25 1、丙烯酰胺30%为29:1(质量比,丙烯酰胺:双甲叉丙烯酰胺) 2、TEMED 可以加到1ul/ml。 不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表

丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青* 3.5 100~2000 100 460 5.0 80~500 65 260 8.0 60~400 45 160 12.0 40~200 30 70 15.0 25~150 15 60 20.0 10~100 12 45 *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp). 凝胶的制备过程: 1、按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。 2、将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角。 3、按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。 4、加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。 5、立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成10°角,可减少液体泄漏的机会。 6、室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE缓冲液。 7、小心取出梳子,加样。 预电泳: 1.对于预电泳,有一种解释是为了除去没有聚合完全的丙烯酰胺分子和交联剂,其实最直接的理解就是预电泳会让胶跑的好看一点。 2.电压根据胶的长度来,是5~10V/cm,100V以下。 3.在预冷装置下电泳,防止局部温度高。

实验二 琼脂糖凝胶电泳实验知识交流

实验二琼脂糖凝胶电 泳实验

实验二琼脂糖凝胶电泳实验 【实验目的】 (1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理; (2)掌握使用水平式电泳仪的方法; (3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质,其等电点为 pH2-2.5,在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5),核酸分子带负电荷,在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时,具有电荷效应和分子筛效应,但主要为分子筛效应。因此,核酸分子的迁移率由下列几种因素决定: (1)DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢。 (2)DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的,超螺旋DNA移动得最快,而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 (3)电源电压。在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 二、实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。 三、试剂与器材 试剂:10%SDS、30%凝胶贮液(29%ACr-1%Bis)、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质maker、0.25%考马斯亮兰R250染色液、甲醇:醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl(PH6.8)缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水 器材:垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套、 四、实验步骤 1 SDS聚丙烯酰胺的灌制 ⑴按说明安装玻璃板,橡胶条放在两玻璃板之间,确定不漏液,玻璃板放入电泳槽时,有凹槽的一侧向里,时刻保持玻璃片间的压力。 ⑵根据表1制备分离胶溶液,加入TEMED后迅速旋转混合物,用1ml移液枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中(灌制红色板的上边缘)。用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。将凝胶垂直放于室温下。(丙烯酰胺有神经毒性,故操作时应注意不要吸入其粉末,实验时应戴手套,剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔,待聚合后再处理) ⑶待聚合后(40min),倒掉覆盖层,用去离子水清洗凝胶顶部,尽可能倒掉凝胶上的液体,用滤纸吸干水分。 ⑷按表1配置浓缩胶,加完TEMED后迅速旋转混合,注满玻璃板间隙,插入梳子(写有1.5mm 的一侧向里,先插入一侧,在从一侧向另一侧压着插入,以排除气泡)将胶垂直放置于室温下。约30min聚合完成,拔出梳子(平行拔出),用去离子水冲洗胶孔,再用滤纸吸干水。取出玻璃板,取下橡胶条。 表1分离胶与浓缩胶配制

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)

打印 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳,普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不 同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA (5-500bp) 效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖凝胶电泳原理: 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构,这种交联的结构使琼脂糖凝 胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷,但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代,使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷,引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用,影响分离效果。 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的,对蛋白质的阻碍作用较小,这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,所以适用于 一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术,如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析,由于DNA、RNA分子通常较大,所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用,这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率 的大小主要与DNA分子大小有关,而与碱基排列及组成无关。另外,一些低熔点的琼脂糖在62 C时熔化,因此其中的样品(如DNA),可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间,重新溶解到溶液中而回收。 由于琼脂糖凝胶的弹性较差,难以从小管中取出,所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳,管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶,用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及DNA、RNA的分析。垂 直式电泳应用得相对较少。 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下:

琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤

?RNA琼脂糖凝胶电泳: 配制: 1.0.5M EDTA(pH=8.0): 100ml:称取18.61g Na2EDTA·2H2O(分子量372.24),加80ml ddH2O剧烈搅拌, 用NaOH调节PH值至8.0(约需2g NaOH).高压灭菌,室温保存。 2.50×TAE loading buffer:(Tris acetate-EDTA buffer)电泳缓冲液 组分:2M Tris-乙酸;100mM EDTA(pH=8.0) 500mL:称121.1g Trisbase(分子量121.14),加800ml ddH2O溶解,加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液(pH=8.0),搅拌,ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE,ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen: 500ul:取495ul1×TAE于1.5ml离心管,加入5ul Sybergreen原液混匀,4℃锡纸 避光保存。 注意:Sybergreen原液需稀释10000倍; 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍,最终稀释倍数应不小于1×。 步骤: 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml,我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中,加入30ml1×TAE,瓶口倒扣小烧杯。 微波炉加热煮沸3次,至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备:(10ul体系/样品槽)于0.25ml离心管中 样品RNA(最后加):2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen:0.1ul DEPC水:至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯(trans UV)下观察拍照 保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带:28,18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊,可有可无

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链,再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节,从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示: 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围(bp)二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000-2000 460 100 5.080-500 260 65 8.060-400 160 45 12.040-200 70 20 15.025-150 60 15 20.0 6-100 45 12 a.N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b.给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小(核苷酸对)。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间,两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下,大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触,所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳,根据分离的需要,其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点:(1)分辨力强,长度仅仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶:多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽(1cm×1mm)而不致显著影响分辨力;(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高,可适用于要求最高的实验(如鼠胚胎微注射)。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶: (1)用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 (2)用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶

凝胶电泳实验报告模板

凝胶电泳实验报告模板

降低了对流运动,故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数,因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异,以及所带的净电荷的多少,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲,D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此,当核酸分子被放置在电场中时,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳,普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳;按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他

实验6、琼脂糖凝胶电泳

实验六、琼脂糖凝胶电泳 【实验目的】 熟练掌握琼脂糖凝胶的配置和DNA凝胶电泳的方法。 【实验原理】 琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物,琼脂糖凝胶点为 40~45℃。当加热至90℃左右时,即可成清亮、透明的液体,浇在模具上冷却后固化形成凝胶,琼脂糖凝胶可区分相差100bp 的 DNA片段。为了满足特殊的要求,可选择低溶点琼脂糖(<70℃,低于双链DNA的变性温度)。 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定的pH值条件下,可解离成带电荷的离子,在电场中向相反的电极移动。分子生物学领域中,琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多,它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。该方法操作简便、快速,可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直接嵌入荧光染料后,在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置,如有必要,从凝胶中回收DNA片段,用于各种克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块,在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低,但其分离范围广,约200bp~50kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好,甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度大于10 000kb的DNA片段,可以通过电场方向呈周期性变化,在脉冲电场胶中进行电泳。 【试剂和器材】 试剂:灭菌重蒸水;TE缓冲液;琼脂糖;核酸染料;;DNAmarker;6×上样缓冲液(0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油) 器材:移液器;水平电泳槽;电泳仪,枪头,移液器,锥形瓶,微波炉,制胶槽,梳子,水平电泳仪,稳压器,凝胶成像系统 【实验步骤】 (1)称取1 g琼脂糖加入250mL锥形瓶中,量取100 ml 1× TAE电泳缓冲液加入锥形瓶。 (2)微波炉加热并多次摇晃锥形瓶使琼脂糖充分溶解。

凝胶电泳实验原理与步骤

一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,但不带电荷,是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正极移动,不同DNA分子片段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品, 四、器具及药品 电泳仪,电泳槽,紫外透射反射仪,恒温水浴锅,微波炉,微量进样器,三羟甲基氨基甲烷,盐酸,醋酸钠,EDTA,琼脂糖,溴酚蓝,溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净,晾干,用胶带将两端的开口封好,放在水平的工作台上,插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4:1混匀后,用微量移液器将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μl,记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至3-5V/cm,电泳1-3hr,当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶,放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min,即可在254nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂,操作时要小心,必须戴手套。 附: ⑴5×TBE(tris-硼酸及EDTA)缓冲液的配制(1000ml): Tris 54g,硼酸27.5g,0.5mol/L EDTA 20ml,将pH调到8.0,定容至1000ml,4℃冰箱保存,用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制: 0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液,4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制: 称取0.1g溴化乙锭,溶于10ml水,配成终浓度为10mg/ml的母液,4℃冰箱保存。染

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 发布时间:11-06-01 来源:点击量:10032 字段选择:大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点: ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少带有离子的侧基,因而电渗作用比较小,不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质,在聚合前可调节单体的浓度比,形成不同程度交链结构,其空隙度可在一个较广的范围内变化,可以根据要分离物质分子的大小,选择合适的凝胶成分,使之既有适宜的空隙度,又有比较好的机械性质。一般说来,含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶,机械性能适用于分离分子量范围不1万至100 万物质,1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶,而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶,大孔胶易碎,小孔胶则难从管中取出,因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺,以改进凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明,易观察,可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物,可以精制,减少污染。合成聚丙

的总克数称凝胶浓度,常用T%表达;凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度,常用C%表示,可用下式计算: 公式 a:丙烯酰胺克数;b:甲撑双丙烯酰胺克数;m:缓冲液体积(毫升)凝胶浓度过高时,凝胶硬而脆,容易破碎;凝胶浓度太低时,凝胶稀软,不易操作。 交联度过高,胶不透明并缺乏弹性;交联度过低,凝胶呈糊状。聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度,它不防止对流减低扩散的能力,而且因为它具有三度空间网状结构,某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状,这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用,这里的凝胶并不仅是单纯的支持物,因此,在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外,还必须注意与凝胶本身有关的各种性质(网孔的大小和形状等)。可通过下式计算来选择适当的凝胶网孔。 公式 式中:P为网孔平均直径,C为多聚体浓度,d为该多聚体分子直径(若不是卷曲的分子应为5A),K为常数,K值取决于涨胶的几何构型,假如多聚体的链是以近似于直角交联的,则约为1.5根据此式,我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径,例如已知多聚体浓度为5%,其网孔平均直径应为: 公式

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称:质粒DNA的提取与纯化,DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理: 1.质粒DNA的提取: 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子,能够自主复制和稳定遗传,以超螺旋形式存在,是最常用的基因克隆载体。除质粒外,大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质,因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法,即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 (1)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理: 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA,达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,线性的DNA因氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕,不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA复性,恢复其天然构象,以可溶状态存在于液相中;而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质,然后用无水乙醇沉淀,即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 (2)四种溶液作用及原理: ①Solution I的作用:悬浮大肠杆菌菌体,增加溶液的粘度,维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,在溶液I中加入EDTA,是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉,从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用:提供碱性条件,pH高达12.6,使大肠杆菌瞬间裂解,促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠(SDS)可使细胞膜、核膜发生破裂,充分溶解膜蛋白。同时,磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用:为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾,从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀,与质粒分离开来;另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性,使pH降至中性,因为长时间的碱性条件会打断DNA;基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小的片段,就没有办法再被PDS共沉淀,这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA 的提取过程中,沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低,较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶pH=8.9;Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子;CI-是前导离子。在pH6.8时,缓冲液中的Gly-为尾随离子,而在pH=8.9时,Gly的解离度增加;这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性,控制了慢离子的解离度,进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带的静电荷不同,而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大量的负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内的二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性的蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是: M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m , 式中M r ——蛋白质的分子量; logK——截距; b——斜率; R m ——相对迁移率。 实验证明,蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内,电泳迁移率与分子量

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳 1.原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷,在电场中受力大小不同,因此跑的速度不同,根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间,离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb,利用脉冲电泳,可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 2操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 琼脂糖凝胶电泳:水平电泳 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA,造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 (1)电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以;如果需要分辨率高的电泳,特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳;用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 (2)凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳,浓度通常在0.5~2%之间,低浓度的用来进行大片段核酸的电泳,高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎,小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨,造成条带缺失现象。 (3)缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE,而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲性能下降,可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,一般简称为Tris)是一种有机化合物,其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如,在生物化学实验中常用的TAE和TBE 缓冲液(用于核酸的溶解)都需要用到Tris。 (4)电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm,电泳温度应该低于30℃,对于巨大的DNA 电泳,温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高,可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 (5)DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐,用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失,也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热,用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 (6)DNA的上样

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 该技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。 一、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDS—PAGE 后,就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.样品的浓缩效应 在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly,pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl,pH8.8),两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下,缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl-,两槽中的Gly (pI=6.0,pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly 离子加快移动,结

(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤

一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术,掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA 核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;而pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时,单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是: 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度愈大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA >IDNA>ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和过硫酸铵

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