产志贺毒素大肠杆菌流行病学和stx基因研究进展

产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析

产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析1 李咏梅，李凡吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011 E-mail：mayflower380@https://www.360docs.net/doc/a39003992.html, 摘要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。非O157型 STEC耐药菌次为122，而O157 型为63。实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。关键词：STEC；鉴定; 耐药性 1．引言 STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。但是，近年来非O157H7 STEC引起的HC、HUC在逐年增加。由于E.coli O157H7不发酵山梨醇而比非O157H7STEC容易鉴定，所以非O157H7STEC 常被人们所忽视。而STEC致病的特征性毒力因子是1型志贺毒素（Shiga toxin type1, stx1）和2型志贺毒素（Shiga toxin type2, stx2）,分别由stx1基因编码和stx2基因编码。然而，其他毒力因子如由eaeA基因编码的紧密素（intimin）也称黏附抹平因子（attachment and effacement factor）；由hlyA基因编码的溶血素（hemolysin）等也是重要的毒力因素[2]。因此，用多重PCR技术对标本进行STEC毒力基因的鉴定，不仅可作特征性鉴定，而且还可对其潜在的致病性能作出前瞻性判定。 1本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为30271251 -1-

志贺毒性大肠杆菌 (STEC) 的临床实验室检验

志賀毒性大腸桿菌(STEC)的臨床實驗室檢驗陳星宇1孫俊仁2* 1台北市立聯合醫院仁愛院區 2三軍總醫院臨床病理科人類如果感染志賀毒性大腸桿菌 (shiga toxin–producing Escherichia coli ,STEC)會造成嚴重腹瀉。即時且適當的診治可以減少病人併發嚴重腎臟疾病及改善病人預後。所以實驗室如何正確診斷志賀毒性大腸桿菌就很重要。以群聚感染爆發與感染控制的角度而言，實驗室必須能區分所流行的志賀毒性大腸桿菌血清型。本篇文章為介紹臨床實驗室診斷志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程。此流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗。在台灣，志賀毒性大腸桿菌所造成的群聚感染並不常見，主要是跟我們熟食的飲食習慣有關。但隨著生食主義及生機飲食的盛行，志賀毒性大腸桿菌感染的風險也相對提高。臨床實驗室了解如何快速檢測志賀毒性大腸桿菌感染就顯得格外重要。關鍵詞：志賀毒性大腸桿菌、志賀毒素志賀毒性大腸桿菌 (Shiga toxin–producing E. coli, STEC)簡介志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)泛指會產生志賀毒素(shiga toxin)的大腸桿菌[1-3]。大腸桿菌的分型主要依據O抗原及H抗原進行血清分型。O抗原為表面抗原(Somatic Ag)而H抗原則為鞭毛抗原(Flagellar Ag)。STEC亦可以專一性抗血清針對其表面抗原及鞭毛抗原進行分型。舉例來說，STEC下最有名的E. coli O157:H7，別名為STEC O157:H7表示其所攜帶的表面抗原為O 157，而其所攜帶的鞭毛抗原為H7，並且可以產生志賀毒素。STEC 在分類上可以區分成O157 STEC及Non-O157 STEC 兩類。常見的STEC感染症主要是感染 E. coli O157:H7。但是至少還有150種STEC血清型證實與群聚感染或是人類疾病有關，這些血清型別可以被歸類為non-O157 STEC。在美國地區non-O157 STEC感染症與六株non-O157血清型(O26, O45, O103, O111, O121及O145)較為相關[4, 5]。志賀毒素的命名最早是因為其毒素結構與功能類似於Shigella dystenteriae 所分泌之Shigella dystenteriae type 1[6]。目前常見的Shiga toxin可以分成兩大類，分別為Shiga toxin 1 (Stx1)及Shiga toxin 2(Stx2) [7, 8]。其他常見名稱像是verocytotoxigenic E. coli則是指其所分泌的志賀毒素會使Vero細胞株產生細胞病變現象。因其會造成人類疾病主要是以腸道出血，所以又稱為enterohemorrhagic E. coli。STEC感染主要會造成急性腹瀉(diarrhea)，此外約8%病人在感染後會出現溶血性尿毒症候群(hemolytic uremic syndrome, HUS)的症狀。其他嚴症狀像是血小板減少症(thrombocytopenia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)及腎衰竭(renal failure)等症狀。如果臨床上觀察到血栓性血小板低下性紫斑症(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)或是溶血性尿毒症候群伴隨腹泄癥候，則必須要懷疑為STEC感染[9, 10]。但是，並非每個感染STEC病人都會出現溶血性尿毒症候群，出現症狀輕重與否與菌種毒性及宿主免疫力有直接關係。而HUS 症狀則是無論是O157 STEC亦或是non-O157 STEC皆有可能造成[10]。STEC造成的感染症主要是因為食用被STEC所污染過的食物(未煮熟的絞肉、受汙染的果汁、生菜及牛奶)、飲用收稿日期：100年10月12日通訊作者：孫俊仁三軍總醫院臨床病理科台北市內湖區成功路2段325號臨床病理科電話：886-2-87923311 ext 88092 傳真：886-2-87927226 電子郵件：sun3342@https://www.360docs.net/doc/a39003992.html, 綜論

大肠杆菌耐热性肠毒素_ST_的分子生物学研究进展_王玉炯

第22卷第3期宁夏大学学报(自然科学版)2001年9月 Vol.22No.3 Journal of Ningxia Uni versity(Natural Science Edi tion)Sep.2001文章编号:0253-2328(2001)03-0331-06 大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展王玉炯, 许崇波 (宁夏大学生物工程系,宁夏银川 750021) 摘要:大肠杆菌的耐热性肠毒素(ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁.文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解S T的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义. 关键词:大肠杆菌;耐热性肠毒素;分子生物学分类号:(中图)R378 2 文献标识码:A 产肠毒素性大肠杆菌(Escherichia coli,E TEC)是引起幼畜腹泻的主要病原菌.ETEC具有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为粘着素(或称定居因子),已知的粘着素有K88,K99,F41和987P等.ETEC 借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上,从而大量繁殖,产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠粘膜上皮细胞的病理性变化,导致幼畜腹泻[1]. ETEC产生两种肠毒素:一种为不耐热性肠毒素(LT),它由一个分子量为28kD的A亚单位结合5个分子量为11.5kD的B亚单位组成,全LT或B亚单位具有良好的免疫原性[2];另一种为耐热性肠毒素(ST),成熟的ST为18或19个氨基酸组成的小肽,有很强的毒素活性,而免疫原性极差.Rebertson 综合研究的资料表明,20%~30%的ETEC为LT+/ ST-;30%~40%的E TEC为LT+/ST+;而ST-/ST+接近50%.由于E TEC产生的ST在ETEC性腹泻中扮演重要角色,对人类和家畜健康有很大威胁,因此从分子水平研究ST的各种性质、致病机理和免疫原性等,对控制由ST引起的腹泻性疾病具有重要意义. 1 S T的一般生物学特性 1.1 ST的分类根据ST的生物学特性及致病性,将其分为ST (又称ST a)和ST (又称ST b)两类[2].ST 可溶于甲醇,可引起乳鼠和乳猪肠积水;ST 不溶于甲醇,对乳鼠不引起肠积水,而对断乳小猪可致肠积水.ST 可根据它的来源不同及核苷酸序列的差异分为ST a与ST b,ST a为牛源或猪源(又称ST p),ST b为人源(又称ST h),ST 则为猪源性[3]. 1.2 ST的理化性质不同来源的ST 其理化性质相同.ST 分子呈中酸性,疏水性氨基酸比例高,在低离子强度时易与碱性疏水性多肽聚合.ST 分子量较小,为2000D 左右,也有报道为4000D和5000D.18肽的小分子具有3个链内二硫键,因该键属于共价键,键能高,不易破坏,故分子结构高度稳定,因而耐热(在100 30min和121 15min不失活)、耐酸碱(在pH=2~10稳定)、耐多种有机溶剂和表面活性剂;抗各种蛋白酶水解,为肽类毒素中最特殊者;不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活.但ST 对可破坏二硫键的氧化剂和还原剂高度敏感,0.1mol/L的2 巯基乙醇、4 10-5mol/L的二硫苏糖醇和过甲酸均可使其失活.可溶于甲醇、丙酮等有机溶剂.经等电聚焦测定,ST的等电点为4.3左右.ST纯化后为白色粉末,其最大吸收波长为275nm,最小吸收波长为255nm.ST 单独不具免疫原性,但与大分子偶联可产生免疫原性.J.C.Frantz[4]将人工合收稿日期:2000-06-12 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660060) 作者简介:王玉炯(1963-),男,教授,博士,研究微生物学、分子生物学及基因工程等.

产志贺样毒素大肠埃希菌1类整合子的鉴定和分析

产志贺样毒素大肠埃希菌1类整合子的鉴定和分析1 李咏梅，李凡吉林大学基础医学院病原生物学教研室长春，130021 Email：mayflower380@https://www.360docs.net/doc/a39003992.html, 摘要: 本文通过常规分离出大肠埃希菌、血清学分型，PCR法鉴定产stx1-2毒素性菌株；纸片扩散法对17种抗生素进行耐药性监测和分析；PCR法鉴定1类整合子阳性株；PCR产物测序并对结果进行分析，以了解1类整合子在产志贺样毒素大肠埃希菌中的分布，阐明整合子中耐药基因盒的种类及相互关系。结果表明各种标本中共鉴定出46株产志贺样毒素大肠埃希菌，其中23株为O157：H7; 全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-氨苄西林。46分离株中有11株(23.9%)鉴定出1类整合子, PCR产物测序得知9株携带aadA1基因盒, 2株携带aadA2基因盒，传递对氨基糖苷类抗生素的耐药性。结果证实产志贺样毒素大肠埃希菌存在1类整合子及其相关的基因盒，而且与氨基糖苷类抗生素的耐药性可能有关。关键词：志贺样毒素；大肠埃希菌；整合子 1．引言细菌耐药性的迅速蔓延及扩散，给临床感染性疾病的治疗带来了巨大的副作用。已经证实的两种参与耐药基因扩散的机制，即耐药性质粒及转座子在其中起着重要的作用[1]。近年来，第三种耐药基因的扩散机制已被发现，即整合子（integron），一种通过特异重组位点介导耐药基因整合的DNA元件。这种重组系统依赖两个决定子，一是编码特异位点DNA整合酶（integrase）的int基因[2]；二是被整合酶识别，并作为插入基因接受者的相邻位点，即attI(integron attach)位点。而插入的基因包含着被叫做基因盒(gene cassette)的可移动元件，大多数都表达耐药性。迄今为止，根据int基因的不同，已有4类整合子得到了鉴定，大多数临床分离株及革兰阴性杆菌中存在着1类整合子[3]。其由两个保守片段组成，5’-CS 包含int基因，attI位点和共同的启动子Pant，而3’-CS包含一个耐杀菌剂的基因（qacE△1），一个磺胺基因（sul1）和一个未知功能的开放读码框（orf5）。中央可变区域包含不同的基因盒组合，至少70种不同的耐药基因盒已被发现，它们在种内及种间转移，使宿主菌成为广谱耐药性细菌[4]。产志贺样毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing E.coli，STEC）是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[5]。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157：H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶 1本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为30271251 -1-

160;食品安全风险解析：解读产志贺毒素大肠杆菌O26160;

食品安全风险解析：解读产志贺毒素大肠杆菌O26 2016年01月13日近日，媒体报道美国墨西哥风味连锁餐厅Chipotle食物中毒引发的产志贺毒素大肠杆菌O26疫情在美国蔓延，导致20人住院。美国疾病预防和控制中心宣称近两年来由产志贺毒素大肠杆菌O26引发的食物中毒事件明显增多，在未来可能引发更多的疫情，尤其是引发溶血性尿毒综合症的病例数量可能会远超过产志贺毒素大肠杆菌O157。针对产志贺毒素大肠杆菌O26事件，国家食品药品监督管理总局发布2016年第1期《食品安全风险解析》，组织专家进行解读，并提醒消费者注意培养良好的消费和生活习惯。一、产志贺毒素大肠杆菌是全球最重要的新发高致病性食源性病原菌产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，简称STEC）是一类携带了前噬菌体编码一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原菌，包括大肠杆菌O26，以及O157、O45、O103、O104、O111、O121、O145等150多种其它血清型的大肠杆菌。该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽胞，有鞭毛，可以在10—65℃生长，最适生长温度为33—42℃，具有较强的耐酸性（pH 2.5—3.0），可以抵抗胃酸的消化作用。据不完全统计，美国1983—2002年发生的非O157的STEC感染者中，70%是由O26、O45、O103、O121、O111 和O145血清型所致；2011年9月，美国农业部食品安全检验局曾发布通告，强调大肠杆菌O26是美国最常

见的非O157STEC。爱尔兰对肉和乳制品中非O157 STEC的分布特征研究发现，血清型O26也是引起人类食源性疾病最主要的非O157血清型。STEC O26已逐渐成为美国、日本及部分欧盟发达国家引起暴发事件的主要病原菌。二、肉制品是引发食源性STEC感染的主要高危食品牛、羊等经济型动物是STEC的天然宿主，国际相关研究发现牛和羊中STEC 携带率可高达71%甚至以上。美国农业部（USDA）和欧盟食品安全局（EFSA）也证实养殖场中存在高风险污染的STEC，并且可以通过环境、粪便、野生动物、土壤等在一定范围内循环存在，最终造成肉制品等污染。1982—2006年多个国家STEC暴发事件的归因分析表明，最主要原因是肉制品污染（42.2%），其次是乳制品（12.2%）。除此之外，生鲜果蔬及其制品等也可能是STEC O26重要的传播介质。通过对美国1992—2002年期间24起STEC暴发事件统计发现，67%的疫情是由牛肉制品导致的，其中O26是最主要致病血清型。三、国际组织及部分国家和地区已对肉制品中的STEC污染高度重视 1999年第32届食品卫生法典委员会（CCFH）会议上，各国政府对食品中的微生物风险应按“食品—病原”组合进行风险管理达成共识，其中就包括“牛肉中大肠杆菌O157”。联合国粮农组织/世界卫生组织食品微生物风险评估联合专家组于2011年发布了风险评估会议报告，为如何控制生牛肉及牛肉制品中的出血性大肠杆菌提供了科学建议。但是，迄今CCFH尚未对如何应用食品卫生通则控制牛肉中的出血性大肠杆菌制定相关科学导则，也未制定相关产品的限量标准。

德国肠出血性大肠杆菌

德国肠出血性大肠杆菌O104 肠出血性大肠杆菌O104是一种罕见血清型细菌，因其能产生志贺样毒素而具有较强的致病性。感染到发病的潜伏期为3-8天，平均为3-4天。临床表现主要有：腹部绞痛和腹泻，常为血便样腹泻，呕吐。多数病人5-7天内好转，病例中有25%-30%出现如以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血性尿毒综合征并发症，发展到这一严重综合征的平均时间是出现腹泻症状后一周左右。患者其中有三分之一的重症患者已丧失肾功能，必须接受透析治疗。重症患者中还有超过一半的人表现出神经系统紊乱症状，焦躁不安，有语言障碍或出现癫痫病般的抽搐。根据世界卫生组织的分析，这次疫情不同寻常之处是发展非常迅速，而且受感染的成年人比例特别高（18岁或18岁以上的人占89%），尤其是妇女患者（68%的溶血性尿毒症患者、感染产志贺毒素大肠杆菌患者58.8%为女性），而不是幼童和老人等通常的高危人群。目前研究结果表明：导致最近德国肠出血性大肠杆菌疫情的致病菌是包含两种不同菌种基因的新型病菌,是由两种不同大肠杆菌基因结合的突变体，以前从未被发现过. 6月2日,两个研究小组分别公开了对欧洲近期肠出血性大肠杆菌流行病原的基因组测序初步分析的结果，确认这种大肠杆菌聚合了至少两种大肠杆菌的致病特性。中德科学家联合对本次流行的病菌进行了全基因组测序，初步分析结果显示，这种O104血清型的大肠杆菌与2002年从中非艾滋病患者腹泻标本中分离的肠聚集性大肠杆菌55989菌株的同源性超过93%，同时它还通过基因水平转移获得了肠出血性大肠杆菌的毒力基因和毒力相关质粒，这可能与该菌株强毒性和重症感染有关。造成本次疫情的菌株是O104：H4血清型的大肠杆菌的一个变种。该种“杂种克隆”聚合了肠聚集性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌的致病特性。研究人员进一步调查此次暴发的大肠杆菌是否含有已被发现的大肠杆菌的毒力基因。初步分析结果只确定了Stx2基因的存在，而其他典型志贺毒素基因如Stx1，eae，ehx缺失。暂未发现有其他毒力基因。Stx2基因编码志贺毒素是出血性大肠杆菌的主要毒力因子，并可能与出血性肠炎及溶血性尿毒症的致病性有关。此前研究人员已经发现该菌株携带氨基糖甙类、大环内酯类及磺胺类抗生素的耐药基因，目前又新发现5个抗生素抗性基因，包括头孢菌素、单酰胺菌素、青霉素和链霉素、萘啶酮酸类抗生素，使得该菌株对至少8种抗生素可能产生耐性。该菌株对carbapenems（卡巴配能类）ciprofloxacin（环丙沙星）敏感。 5.8日德国爆发，曲线图如

大肠杆菌内毒素酶联免疫分析

大肠杆菌内毒素酶联免疫分析 ELISA试剂盒操作方案本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 96T 0.03Eu/L – 0.8Eu/L 使用目的：本试剂盒用于测定大肠杆菌样本中内毒素(endotoxin)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大肠杆菌内毒素(endotoxin)水平。用纯化的大肠杆菌内毒素(endotoxin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内毒素(endotoxin)，再与HRP标记的内毒素(endotoxin)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内毒素(endotoxin)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大肠杆菌内毒素(endotoxin)浓度。试剂盒组成 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、

待测样品孔

。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲

一株产志贺毒素_且山梨醇阳性的大肠杆菌O157_H7的分离与鉴定

一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌 O157:H7的分离与鉴定张书萧1,2，刘喆1,2，邵东华2，陈晓平1 ，赵秋华3，马志永2 （1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118；2. 中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心，上海 200241；3.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201100） ISOLATION AND IDENTIFICATION OF SHIGA TOXIN TYPE 2-PRODUCING AND SORBITOL-POSITIVE ESCHERICHIA COLI O157:H7 摘　要：在上海某猪场采集6份腹泻猪粪便样品和2份病死猪小肠内容物样品，增菌后经麦康凯培养基和伊红美兰培养基分离得到32株疑似大肠杆菌，通过PCR 方法分析O157特异基因rfbE 和血清学鉴定，分离获得一株肠出血性大肠杆菌O157:H7。PCR 检测该菌株的毒力因子携带情况，结果表明其只携带志贺毒素Ⅱ，而不携带志贺毒素Ⅰ、紧密素和溶血素等毒力因子；生化试验发现该菌株与大多数O157:H7特性不同，可分解山梨醇；毒力试验和耐药性试验表明该菌株毒性较强，且耐药性很强，对大多数抗生素不敏感。关键词：大肠杆菌O157:H7；分离；鉴定中图分类号：S852.612 文献标识码：A 文章编号:1674-6422(2011)02-0030-05 ZHANG Shu-xiao 1,2, LIU Zhe 1,2, SHAO Dong-hua 2, CHEN Xiao-ping 1, ZHAO Qiu-hua 3, MA Zhi-yong 2 (1. Colledge of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118; 2. Animal-borne Food Safely Research Center, Shanghai Veterinary Reseanch Institute, CAAS Shanghai 200241, China; 3. Animal Dicease Control and Prevention of Shanghai Minhang District, Shanghai, 201100, China) Abstract: A total of 32 strains of Escherichia coli were isolated from diarrhea samples (n =6) and intestine contents (n =2) collected from diseased pigs in Shanghai. PCR analysis of the rfbE gene of the isolates indicated that one of the isolates was positive for being the serotype of Escherichia coli O157:H7, which was further conformed by immunological assay. The isolate was found to carry Shiga toxin-producing gene 2, but not the Shiga toxin-producing gene 1 and some other toxic factors, as detected by PCR analysis. The isolate was able to catabolize sorbitol and resistant to almost all of antibiotics tested.Key words : Escherichia coli O157:H7; isolation; identi ? cation 收稿日期：2011-07-04 作者介绍：张书萧，女，硕士研究生，食品科学专业通信作者：马志永，E-mail: zhiyongma@https://www.360docs.net/doc/a39003992.html, Chinese Journal of Animal Infectious Diseases ·研究论文· 中国动物传染病学报2011,19(4): 30-34[19] Philippe B. Human circoviruses[J]. Vet Microbiol, 2004, 98: 95-101. [20] Moen E M, Sleboda J, Grinde B. Serum concentrations of TT virus and TT virus-like mini virus in patients developing AIDS[J]. Aids, 2002, 16(12): 1679-1682. [21] Philippe B, Pierre G, Jean F C, et al . Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups in french blood donors[J]. J Med Virol, 2006, 78(2): 298-304. （上接第29页）

PCR快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究

文章编号:100028020(2009)022******* ?实验研究? PCR 快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究李玉锋　代娟　刘红露 1 西华大学生物工程学院,成都　610039 摘要:目的　利用PCR 技术,尝试建立特异性引物PCR 快速检测肠毒素大肠杆菌的方法。方法　设计肠毒素大肠杆菌LT 基因的特异性引物,优化PCR 反应条件,对16种样品进行细菌通用引物和特异性引物的PCR 扩增,从而鉴定肠毒素大肠杆菌。结果　所有样品都出现细菌通用引物的扩增条带,而只有肠毒素大肠杆菌有特异性引物的PCR 扩增产物,结果与实际完全一致。结论　该方法具有简单、迅速、准确的特点,可应用于对肠毒素大肠杆菌的鉴定。关键词:PCR 技术　特异性引物　食品检测　大肠杆菌中图分类号:R155151 文献标识码:B Study on the rapid detection method of Enterotoxigenic E .coli by polymerase chain reaction technology LI Yu feng ,DAI Juan ,LIU H onglu C ollege of Bioengineering ,X ihua University ,Chengdu 610039,China Abstract :Objective T o establish the rapid detection method of Enterotoxigenic E .coli (ETEC )by polymerase chain reaction (PCR )technology for characteristic primers.Methods The primer of LT gene from Enterotoxigenic E .coli was designed and the condition of PCR was optimized to identify ETEC with PCR amplification for 16samples.R esults all samples could not be amplified except ETEC with special primer.Conclusion The technology of ETEC determinated by PCR could be easy ,rapid and accurate. K ey w ords :polymerase chain reaction technology ,characteristic primers Enterotoxigenic E .coli ,food detection 作者简介:李玉峰,男,生物学博士,教授,制药工程系主任 1四川省疾病控制预防中心肠毒素大肠杆菌((Enterotoxigenic E 1coli ,ETEC )是一种嗜热、嗜酸、好氧的细菌,能引起肠粘膜细胞水与电解质的代解紊乱,是导致婴幼儿和幼畜腹泻的主要病因之一。ETEC 主要的传染途径是通过食入了被该菌污染的食品所致,因此,快速、准确地检测出食品中的ETEC 就非常重要[1]。目前对 ETEC 的检测方法仍为常规的培养检测法,操作复杂,耗时较长,一般需要4～5天[2]。聚合酶链反应(PCR )技术因具有特异性强、灵敏度高和快速准确的优点而被广泛应用[3,4]。高特异性PCR 检测肠毒素大肠杆菌方法的建立和完善为食源性肠毒素大肠杆菌的鉴定,及时控制、防范食品的污染提供了新的途径。 1　材料与方法 111　材料 11111　实验菌株　C83902,C83921肠毒素大肠杆菌购于中国兽医药品监察所,侵袭性大肠埃希菌购生物制品研究所,其他实验菌株均来源于四川省疾病预防控制中心。11112　主要仪器与试剂　仪器:冷冻高速离心机;PCR 扩增仪(eppendorf m odel 680microplate reader );紫外可见呈像系统; 核酸分析仪E ppendorf AG 22331Hambnry 。试剂:P M D182T Vector 为宝生物工程(大连)有限公司的产品;T aq DNA 聚合酶为宝信公司的产品;dNTP 与离心柱型高纯度质粒小提取试剂盒由TI AN GE N 公司提供;012ml 薄壁管为Axygen 的产品;其余试剂购于北京赛百盛基因技术有限公司。112　方法11211　菌种的培养及DNA 模板的制备　将菌株接种于20ml LB 液体培养基,37℃震荡过夜培养(150～200r Πmin )。DNA 的提取采用热裂解法[5] ,取细菌培养液015ml ,置于E ppendorf 管中,2000r Πmin 离心20min ,灭菌蒸馏水洗涤2次,最后用1ml 蒸馏水悬浮,隔水煮沸15min ,8000r Πmin 离心15min ,取上清,即为DNA 模板溶液,保存于-20℃备用。11212　PCR 引物设计　根据G enebank S60731LT 毒素基因序列(1275bp ),选取结构基因内保守区段为目的片段,由软件Express 210设计两对引物(表1)。引物由上海基康生物技术有限公司合成。11213　PCR 反应条件的优化　调整模板、引物和聚合酶浓度以及循环次数和退火温度,用两对设计的特异性引物(P 1、P 2;P 3、P 4)10次进行PCR 扩增。DNA 模板(1μg ΠL )为015μl 、110μl 第37卷　第2期2008年　3月卫　生　研　究 JOURNA L OF HYGIE NE RESE ARCH V ol.37　N o.2 Mar.　2008231