通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠 脑微血管内皮细 …
收稿日期：2014?01?20
基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目（编号：2012CB518602）
作者简介：盖聪（1985?），女，辽宁抚顺人，医学硕士，博士研究生。通信作者：孙红梅，E ?m ai l ：hm ?s un@https://www.360docs.net/doc/a19522715.html,
栏目主编：朱明军协办：河南中医学院第一附属医院心脏中心.心脑病研究.
通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠
脑微血管内皮细胞的保护作用
盖聪，孙红梅，李澎涛，贾静，李卫红，刘元，于慧玲，李聪
﹙北京中医药大学，北京100029﹚
摘要：目的：观察通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。方法：分离大鼠脑微血管内皮细胞培养鉴定，采用氧糖剥夺法建立模拟体外脑缺血再灌注内皮细胞损伤模型，利用制备的通心络含药血清干预，CCK ?8法检测细胞活性；硝酸酶还原法测定细胞上清液N O 的含量；El i s a 法检测细胞上清液vW F 的含量。结果：与正常组比较，模型组细胞O D 值明显降低（P <0.01），细胞上清液N O 和vW F （P <0.05或P <0.01）含量明显升高；与模型组比较，10%的通心络含药血清作用24h，细胞O D 值明显增高（P <0.01），细胞上清液N O 含量和vW F 含量明显降低（P 均<0.01）。结论：通心络含药血清可能是通过减少N O 和vW F 分泌保护脑缺血再灌注损伤的脑微血管内皮细胞。关键词：通心络；脑微血管内皮细胞；脑缺血再灌注；一氧化氮；雄性SD 大鼠
本文引用：盖聪，孙红梅，李澎涛，等.通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用［J］.河南中医，2014，34（7）：1253?1256.
中图分类号：R 259.433
文献标志码：A
文章编号：1003?5028﹙2014﹚07?1253?04
缺血性中风具有发病率高、致残率高和致死率高等特
点，是威胁人类健康的重大疾病之一。基于中医络病理论研制的通心络﹙Tong X i n Luo，简称TX L ﹚应用于临床治疗缺血
引起的脑梗死疗效显着，且安全无明显毒副作用［
1?2］
。先期研究表明该药治疗脑梗死的新靶点为保护脑微血管，可增加缺血侧脑组织微血管密度，促进微血管新生，增加缺血脑组
织的血流灌注量［3］
。目前通心络对脑微血管内皮细胞
﹙br ai n m i cr o vascul ar endot hel i al cel l s ，BM EC ﹚在缺血缺氧损伤时的具体保护作用及机制尚不明确。本实验在建立体外模拟BM EC 缺血再灌注损伤基础上，观察通心络含药血清对BM EC 活性的影响以及上清液中一氧化氮﹙N O﹚和血管性血友病因子﹙von W i l l ebr and Fact or ，vW F ﹚的变化，探讨通心络对脑微血管的保护作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物雄性SD 大鼠﹙维通利华，动物合格证号：京I CP 备05076685﹚，体质量50~60g，用于原代脑微血管内皮细胞的分离培养；体质量200~250g，用于通心络含药血清制备。1.1.2试剂通心络超微粉﹙973课题组提供﹚；D M EM ?F12培养基、胰蛋白酶﹙G i bco 公司﹚；胎牛血清﹙hycl one ﹚；明胶、Ⅱ型胶原酶﹙Si gm a 公司﹚；CCK ?8﹙同仁化学﹚；vW F El i sa 试剂盒﹙美国R B 公司﹚；一氧化氮﹙N O﹚试剂盒﹙南京建
成生物工程研究所﹚；青霉素、链霉素﹙华北制药股份有限公
司﹚；肝素钠﹙鼎国生物技术发展中心﹚；内皮细胞生长因子﹙ECG S，BD 公司﹚；其他试剂均为国产分析纯。1.1.3主要仪器O l ym pus I M T ?2倒置显微镜；O l ym pus BX 60荧光显微镜；Cl i ni c bi o 128C 全自动酶标仪。1.2实验方法
1.2.1含药血清的制备大鼠随机分为通心络组和空白对照组。通心络组按0.16g·﹙kg·d ﹚?1浓度﹙通心络超微粉采用生理盐水配制﹚灌胃1.5m L，日2次；空白对照组给予相同体积的生理盐水灌胃，持续8d，最后一次灌胃2h 后﹙灌胃前禁食12h 不禁水﹚用10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉
取血3.5m L，放入4oС冰箱过夜。3500r·m i n ?
1离心20m i n，抽取血清，经56oС水浴30m i n 灭活，0.22μm 滤器过滤后分装，?20oС保存备用。
1.2.2大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养和鉴定参照
文献［
4?5］
，取大鼠麻醉断头后，在无菌条件下取出两侧大脑半球，仔细剔除软脑膜、大血管以及大脑髓质，保留大脑皮质，剪碎、匀浆，然后将匀浆液通过200μm 和74μm 滤网过滤，收集74μm 滤网上的微血管段，离心﹙1000r·m i n ?1，5m i n ﹚，用0.2%Ⅱ型胶原酶37oС水浴中消化约20m i n，离心
﹙1000r ·m i n ?1
，5m i n ﹚，其沉淀物用冲洗液﹙10%胎牛血清、90%D M EM ?F12﹚清洗2次，采用配制的内皮细胞完全培养液﹙20%胎牛血清、10%ECG S、1%青链霉素、0.64%肝素钠、余下为D M EM ?F12﹚重悬接种于明胶覆盖的25cm 2培养瓶中。放入37oС、5%CO 2孵箱进行培养并传代，倒置显微镜观察BM EC 形态长梭形、汇合状态呈紧密连接，单层生长，用第2代或第3代细胞鉴定，间接免疫荧光Ⅷ因子阳性，计算阳性细胞率大于95%。
1.2.3体外模拟脑缺血再灌注内皮细胞损伤模型的建立
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网络出版时间：2014-07-04 13:14网络出版地址：https://www.360docs.net/doc/a19522715.html,/kcms/detail/41.1114.R.20140707.0840.066.html
采用氧糖剥夺方法﹙oxygen ?gl ucose depr i vat i on，O G D﹚模拟
缺血再灌注损伤［6］
。用无糖的K r eb's 溶液，置于37oС密闭缺氧罐中，持续通入95%N 2和5%CO 26h；D ?H ank's 液洗细胞2次，将细胞用无血清的D M EM ?F12培养液置正常培养条件的培养箱中6h。
1.2.4通心络对正常大鼠脑微血管内皮细胞活性的作用待细胞呈80%汇合状态，吸弃培养板中培养液，用D ?H ank's 液洗细胞2次，含药血清以D M EM ?F12稀释作梯度浓度，分为5组：对照血清组﹙20%正常血清+0%TX L 含药血清，简称N T0%组﹚，5%
通心络含药血清组﹙15%正常血清+5%TX L 含药血清，简称N T5%组﹚，10%通心络含药血清组﹙10%正常血清+10%TX L 含药血清，简称N T10%组﹚，15%通心络含药血清组﹙5%正常血清+15%TX L 含药血清，简称N T15%组﹚，20%通心络含药血清组﹙0%正常血清+20%TX L 含药血清，简称N T20%组﹚，每孔加100μL 分别作用6h、12h、24h，进行细胞活性检测。
1.2.5通心络对脑缺血再灌注大鼠脑微血管内皮细胞的作用造模后，吸弃培养板中K r eb's 液，用D ?H ank's 液洗细胞2次，含药血清以D M EM ?F12稀释作梯度浓度，分为4组：①正常组﹙不造模，20%正常血清+0%通心络含药血清，简称N 组﹚；②模型组﹙造模后加20%正常血清+0%TX L 含药血清，简称I T0%组﹚；③5%通心络含药血清治疗组﹙造模后加15%正常血清+5%TX L 含药血清，简称I T5%组﹚；④10%通心络含药血清治疗组﹙造模后加10%正常血清+10%TX L 含药血清，简称I T10%组﹚。每孔加100μL 分别作用6h、12h、24h，进行细胞活性检测。1.2.6细胞上清液N O 、vW F 含量的检测根据上述各组细胞活性实验检测结果发现，通心络含药血清作用于脑微血管内皮细胞的最佳浓度和作用时间为10%通心络含药血清作用24h 组，故对N O 、vW F 检测的分组为：①正常组﹙20%正常血清+0%TX L 含药血清，简称N 组﹚；②正常给药组﹙10%正常血清+10%通心络含药血清，简称N T 组﹚；③模型组﹙造模后加20%正常血清+0%通心络含药血清，简称I组﹚；④通心络治疗组﹙造模后10%正常血清+10%通心络含药血清，简称I T 组﹚。每孔加100μL 分别作用24h。
1.2.7形态学观察特点和形态、并拍照。
1.2.8细胞活性的检测各组细胞活性检测采用CCK ?8方法检测。方法为：吸弃培养板中细胞上清液，每孔加入D M EM ?F12100μL，CCK ?8溶液10μL，置37oС、5%CO 2培养箱中孵育2h。全自动酶标仪﹙选择λ=450nm 波长，空白孔调零﹚测定各孔吸光度﹙O D﹚值。CCK ?8法显色深浅随孔板中活细胞数增加而逐渐加深，其吸光值亦随之升高。O D 值越大细胞活性越高。
1.2.9细胞上清液N O 含量的检测细胞上清液中N O 含量测定采用硝酸酶还原法。取200μL 细胞培养上清液，按试剂盒操作说明书进行，在全自动酶标仪λ=530nm ，测定各
孔吸光值，计算细胞培养上清液中N O 含量﹙μm ol ·L ?
1﹚。1.2.10细胞上清液vW F 含量的检测细胞上清液中vW F 含量采用即酶联免疫吸附测定法﹙enz ym e ?l i nked i m m unos or -bent as s ay，ELI SA﹚测定，取细胞上清液按试剂盒操作说明进行。1.3统计学方法数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差﹙゜
x ±s ﹚表示，在各组计量资料满足正态性和方差齐性时，用单因素方差分析，不满足正态
性或方差齐性，用非参数检验进行统计学分析。P <0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1通心络含药血清对正常脑微血管内皮细胞活性的影响2.1.1形态学经过一系列处理后的大鼠脑微血管段长短不一，可见有的微血管分叉﹙见图1﹚。分离培养的正常组脑微血管内皮细胞为多角形，饱满，呈铺路石样﹙见图2，图4﹚，内皮细胞Ⅷ因子﹙血管内皮细胞标志物﹚免疫荧光检验为阳性﹙见图3﹚。N T10%组作用24h 后细胞间隙较正常对照组缩小，细胞生长较快，细胞量较多﹙见图5﹚。
图1大鼠脑皮质微血管段（标尺：50μm ，×40）
图2原代培养7天B M E C （标尺：100μm ，×20）
图3B M E C Ⅷ因子免疫荧光（标尺：100μm ，×20）
2.1.2CCK ?8结果6h ?5%、12h ?5%、24h ?5%、24h ?10%O D 值高于对照血清组，但无显著性差异﹙P >0.05﹚。15%、20%浓度组三个时间点的O D 值均低于对照血清组，但无显著性差异﹙P >0.05﹚。12h 各个浓度的O D 值均高于6h、24h 对应的浓度，但无显著性差异﹙P >0.05﹚。其中12h ?10%组的O D 值高于对照血清组，且有显著性差异﹙P <0.05﹚。见表1。
图4传代后3天对照血清组（标尺：100μm ，×20）
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图5N T 10%?24h 组（标尺：100μm ，×20）
表1
不同浓度含药血清作用3个时间点的
正常脑微血管内皮细胞增殖O D 值比较
﹙゜x ±s ﹚组别6h 12h 24h N 组 2.379±0.054 2.783±0.071 2.735±0.335N T5%组
2.415±0.208
2.823±0.091 2.792±0.446N T10%组 2.173±0.092 2.896±0.131? 2.737±0.605N T15%组 2.284±0.161 2.729±0.065 2.673±0.376N T20%组 2.117±0.123
2.718±0.078
2.098±0.091
注：与对照血清组（N）比较，?P <0.05。
2.2通心络含药血清对体外缺血再灌注损伤内皮细胞活性的影响
2.2.1形态学倒置显微镜观察体外模拟缺血损伤1h 细胞即开始回缩，间隙变大，细胞间连接断裂，并随着损伤时间的延长，细胞回缩越明显，开始时变得细长，以后有些细胞回缩变圆，甚至漂浮。至6h 时可见细胞变形明显，细胞之间间隙增大，有些细胞变圆并漂浮，折光性增强﹙见图6﹚，通心络治疗组细胞间隙较模型组缩小，细胞生长较快，细胞量较多﹙见图7﹚。
图6B M E C 拟缺血损伤6h （标尺：100μm ，×20）
图7通心络治疗组（标尺：100μm ，×20）
2.2.2CCK ?8结果见表2。
表2不同浓度含药血清作用3个时间点缺血再灌脑微血管内皮细胞活性O D 值比较
﹙゜x ±s ﹚组别6h 12h 24h N 组 2.379±0.054
2.783±0.071
2.735±0.335
I T0%组0.216±0.092??0.192±0.033??0.291±0.025??I T5%组0.288±0.0540.189±0.0070.326±0.033I T10%组
0.482±0.241
0.241±0.079
1.037±0.092##
注：与正常组比较，??P <0.01；
与模型组比较，##P <0.01。 2.3通心络含药血清对内皮细胞培养上清液中N O 、vW F
含量的影响见表3。
表3通心络含药血清对内皮细胞培养上清液中
N O 、vW F 含量的影响﹙゜
x ±s ﹚组别N O 含量﹙μm ol ·L ?1﹚
vW F 含量﹙pg·100μg ?1﹚
N 组 5.580±0.02341.504±0.403N T 组
5.712±0.04154.019±0.491I组
6.041±0.030?232.821±0.444??I T 组
5.687±0.025##
56.934±0.685##
注：与正常组（N）比较，?P <0.05，??P <0.01；
与模型组（I ）比较，##P <0.01。
3讨论
3.1通心络含药血清对细胞活性的影响CCK ?8﹙cel l
count i ng ki t?8﹚［7］
是国外研发出的一种新型的检测细胞活性方法，其原理为活细胞线粒体脱氢酶转化出的黄色结晶为高度水溶性，不需要裂解细胞，即可直接进行比色。该方法步骤简便，且准确性很高。
由于任何药物在达到一定浓度并作用一定时间时，都会产生细胞毒性而造成细胞死亡，而影响其对药物作用的判定，所以本实验首先采用CCK ?8法观察4种药物血清浓度作用3个时间点后对正常脑微血管内皮细胞活性的影响，以探讨通心络血清基本无毒性的作用浓度和时间。结果显示，N T10%组作用12h 后其O D 值明显高于对照血清组﹙P <0.05﹚，提示10%通心络含药血清，作用12h 对脑血管内皮细胞可能具有促增殖的作用；4种药物血清浓度在3个作用时间内对正常的脑血管内皮细胞均无明显的细胞毒性作用。
进一步的研究发现，体外模拟缺血再灌注损伤细胞后，其细胞形态出现明显异常改变，且O D 值明显低于正常组﹙P <0.01﹚，说明氧糖剥夺方法造模成功。通心络含药血清干预后，其中10%通心络含药血清治疗组作用24h 后细胞O D 值明显高于模型组﹙P <0.01﹚，表明10%通心络含药血清能够提高细胞生存活性，有效保护内皮细胞，减轻缺血再灌注造成的损伤。根据以上结果，确定通心络含药血清干预BM EC 体外缺血再灌注损伤的剂量及作用时间。
3.2通心络含药血清对内皮细胞活性影响的机制N O 是一种具有广泛生物活性的信使分子，在缺血再灌注损伤中，N O 的作用十分复杂，随着实验条件的不同所得的结果也不
尽相同［8］
。在神经系统中，N O 具有双重作用，一方面N O 作为神经介质在传递信息中起重要作用，另一方面还参与了神经毒性作用，其产生的自由基进入细胞后影响线粒体功能，可加重神经元的损伤；还可介导缺氧时N M D A 受体和谷氨
酸诱导的神经毒性而致神经元损害［9］
；N O 还可通过干扰能量代谢、损伤D N A 和与细胞因子作用诱导神经细胞凋亡［10］
。内源性的N O 是在一氧化氮合酶﹙ni t r i c oxi de syn-t hase，N O S ﹚的催化下合成的。内皮细胞可以表达两种类型的N O S：内皮型N O S ﹙eN O S ﹚和诱导型N O S ﹙i N O S ﹚。研究表明i N O S 基因启动子区域有多个转录因子的结合位点，包括N F ?Κ
B 、A P ?1、I L ?6等，N O 还可以通过I CA M ?1等黏附分子参与介导内皮细胞与白细胞的黏附，在脑缺血再灌注损
伤中的炎症反应发病过程中具有重要意义［11］
。在本实验中，笔者根据CCK ?8法确定了通心络含药血清对损伤内皮细胞具有保护作用的浓度和时间为10%通心络含药血清作用24h，以此浓度的含药血清和作用时间加以干预，结果显示，体外模拟缺血再灌注损伤模型组细胞培养上清液中N O
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含量明显升高，而通心络含药血清可明显降低N O 的水平，
提示通心络含药血清对缺血再灌注脑微血管内皮细胞的保护作用可能通过其抑制N O 的分泌有关，N O 分泌减少可减轻缺血再灌注损伤中各种神经细胞的凋亡，减少迟发性神经元坏死，最终达到保存神经细胞的作用。
vW F 是一种重要的内皮下黏附蛋白，其存在于血小板颗粒和内皮细胞中，血浆中的vW F 绝大部分是血管内皮细胞分泌的，在血小板和内皮细胞连接过程中起桥联作用，主要
参与凝血功能［12］
，因此，在其受刺激损伤活化的情况下，内
［4］李卫红，青学梅，华茜，等.大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液
对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用［J］.中华中医药杂志，2006，21﹙6﹚：334?337.［5］Bai guer a S，ConconiM T，G ui dol i n D ，etal .G hr el i n i nhi bi t s i n vi t r o
angi ogeni c act i vi t y ofr atbr ai n m i cr o vas cul ar endot hel i alcel l s［J］.I nt J M ol M ed，2004，14﹙5﹚：849?854.［6］ZhangW ，Sm i t h C ，Shapi r oA ，etal .I ncr eas ed expr es s i on ofbi oact i ve
chem oki nes i n hum an cer ebr o m i cr o vas cul ar endot hel i al cel l s and as t r ocyt es s ubj ect ed t o s i m ul at ed i s chem i a i n vi t r o［J］.J our nal of N eur on i m m unol ogy，1999，101﹙2﹚：148?160.2014年第34卷7月第7期河南中医H EN A N TR A D I TI O N A L CH I N ESE M ED I CI N E Jul y 2014
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缺血性卒中静脉溶栓流程图 卫生部北京医院神经内科 姓名性别年龄体重（kg）病历号病人出处 联系方式： 联系人姓名：与患者关系：电话： 静脉溶栓治疗适应证 确定时间（ 24 小时制） 发病时间：年月日时分（最后看起来还正常是什么时候？） 来院时间：年月日时分 来诊时发病在 4.5 小时之内（ rtPA）是□否□ 来诊时发病在 6.0 小时之内（尿激酶）是□否□ 如“是”，考虑溶栓治疗，行以下程序。如“否”，本流程终止。 开溶栓检查套餐 快速血糖、血常规、血生化、凝血相（包括 D 二聚体）、心梗三项（督促血标本送检及化验 ! ） 头 CT 或 CTA 筛查静脉溶栓标准 【适应证】是否年龄 18～ 80岁□□溶栓开始时发病在 4.5h 以内（ rtPA ）或 6h内 ( 尿激酶 ) □□脑功能损害的体征持续存在超过1h，且比较严重（ NIHSS 5-25 ）□□脑 CT已排除颅内出血，且无早期大面积脑梗死影像学改变□□患者或家属签署知情同意书□□ 以上必须为“ 是” ，为“否”者不能溶栓
【禁忌证】 严重脑卒中（临床 NIHSS>25分，和/ 或影像提示急性低密度或脑沟消失>1/3MCA 供血区、明显占位效应伴中线移位） 在开始治疗前卒中症状迅速改善 尽管头 CT未见异常，临床仍怀疑蛛网膜下腔出血 此次神经功能缺损为癫痫发作的后遗症状 未控制的高血压：（间隔至少 5min 重复 3次测得）收缩压 >180mmHg，或舒张 压 >100mmHg；或需要强力（静脉内给药）治疗手段以控制血压 既往有颅内出血史，包括可疑蛛网膜下腔出血；有动脉瘤或动静脉畸形史 近3个月内有有脑梗死史（但不包括未遗留神经体征的陈旧小腔梗） 近3个月内有心肌梗死史； 近3个月内有头颅外伤或严重创伤史； 近3个月内有胃肠溃疡史； 近3周内有胃肠或泌尿系统出血； 近2周内进行过大的外科手术； 近 10天曾进行有创心外按压、分娩、及不易压迫止血部位的动脉或静脉穿刺（如锁骨下或颈静脉） 有出血倾向的肿瘤史； 严重的肝病：包括肝功能衰竭、肝硬变、门静脉高压（食道静脉曲张）及活动性肝炎史 严重心、肾功能不全或严重糖尿病患者 妊娠； 已知的出血体质； 中枢神经系统的肿瘤及手术史； 细菌性心内膜炎或心包炎； 急性胰腺炎； 体检发现有活动性出血或外伤( 如骨折 ) 的证据 已口服抗凝药，且INR>1.5 ； 48h内接受过肝素治疗（APTT超出正常范围）。 血小板计数低于 100× 109／L，血糖 <2.7 mmol ／L（ 50mg/dl ）或高于 22.2mmol/L (400mg/dl) 。 患者不能配合治疗 以上必须为“否”，为“是”者不能溶栓。
实验动物大鼠原代脑微血管内皮细胞
实验动物（大鼠）原代脑微血管内皮细胞 产品编号：RAT-iCELL-n001 产品规格：>5×105细胞数 产品价格：3750 包装规格：T-25培养瓶 细胞详述： 脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。 脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；脑微血管的内皮细胞间衔接得十分紧密，不象其他组织的血管内皮细胞那样有较大的缝隙脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低；脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化”的表现型。与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。 细胞特性: 1)组织来源于实验动物的脑动脉组织。 2)细胞鉴定：血管假性血友病因子（vWF）免疫荧光染色为阳性。 3)经鉴定细胞纯度高于90%。 4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。 5)细胞生长方式：铺路石状细胞，不规则细胞，贴壁培养。 产品的运输和保存：
视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。 1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进 行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。 2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生 长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。 推荐培养基： 我们推荐使用iCell原代内皮细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-002）作为体外培养原代脑动脉血管内皮细胞的培养基。 产品使用： 1)本产品仅能用于科研 2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核 3)本产品未通过用于活体诊断的审核
急性脑卒中溶栓指南
中国急性缺血性脑卒中静脉溶栓指导规范 国家卫生计生委脑卒中防治工程委员会 2016年5月
中国急性缺血性脑卒中静脉溶栓指导规范 组长：刘鸣 成员：崔丽英贺茂林徐运 增进胜刘峻峰畅雪丽
急性缺血性脑卒中的发病率、致残率和病死率均高，严重影响人类健康和生活。目前超早期采用重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasmmogen activator, rt-PA) 静脉溶栓是改善急性缺血性脑卒中结局最有效的药物治疗手段，已被我国和许多国家指南推荐，但目前急性缺血性脑卒中溶栓治疗的比例仍然很低。 近期研究显示，约20% 的患者于发病 3 小时之内到达急诊室，12.6% 的患者适合溶栓治疗，只有 2.4% 的患者进行了溶栓治疗，其中使用rt-PA静脉溶栓治疗为1.6% 。开展急性缺血性脑卒中超早期溶栓治疗的一个主要难点是，大多数患者没有及时送达医院或各种原因的院内延迟。 为使更多急性缺血性脑卒中患者获得溶栓治疗并从中受益，美国等西方发达国家已普遍进行相应的医疗救治体系改革，包括完善院外医疗急救转运网络，组建院内卒中快速抢救小组，开通急诊“绿色通道”，建立卒中中心和卒中中心的认证体系等措施，其核心就是要让公众都知道卒中是急症，卒中发生后应尽快送达有能力进行卒中溶栓治疗的医院，并获得规范性溶栓治疗。 为使溶栓这一有效疗法能更好、更广泛地在我国使用，提高缺血性脑卒中急性期的救治率，脑防委特组织全国脑血管病权威专家制定静脉溶栓指导规范如下，其中的推荐强度和证据等级采用《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》的标准。 一、溶栓相关公众教育 为使急性缺血性脑卒中患者获得及时救治，首先应能够识别脑卒中的发生。研究显示公众对脑卒中临床表现的相关知识仍然十分匮乏。根据加利福尼亚州急性卒中登记（California Acute Stroke Pilot Registry, CASPR) 报告若所有患者能在发病后早期就诊，则 3 h 内溶栓治疗的总体比例可由 4.3% 上升至28.6%, 因此开展更多的以教育卒中患者更早寻求治疗的宣传活动是必要的。 有效的社区教育工具包括印刷材料、视听节目、网络在线宣传、社区宣讲、板报以及电视广告。卒中教育不应仅针对潜在的患者，也应包括他们的亲属、公共服务部门比如警察以及医护人员，使他们能够在必要时启动急救医疗
小鼠心肌微血管内皮细胞使用说明
小鼠心肌微血管内皮细胞 小鼠心肌微血管内皮细胞产品说明: 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠心肌微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠心肌微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠心肌微血管内皮细胞产品简介: 1、产品名称：小鼠心肌微血管内皮细胞 2、组织来源：小鼠心肌血管组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠心肌微血管内皮细胞简介： 小鼠心肌微血管内皮细胞分离自正常小鼠心肌血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。 本公司生产的小鼠心肌微血管内皮细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 小鼠心肌微血管内皮细胞培养基信息：
脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1Th2相关细胞因子的表达
脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1/Th2相关细胞因子的表达 罗文芳 1 唐涛黎杏群林源罗杰坤钟鹏程刘清娥 （中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南 长沙410008） 〔摘 要〕目的 体外观察脑微血管内皮细胞（MVECs ）对来自大鼠海马神经干细胞（NSCs ）免疫相关细胞因子表达的影响。方法 采用Tran- swell 建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型（NSCs +MVECs ），用荧光免疫化学和RT-PCR 测定NSCs 中与Th1相关的IFN-γ、IL-2及与Th2相关的IL-4、IL-10的表达。结果两种细胞共培养后，神经干细胞呈INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10阳性；同时INF-γ、IL-2mRNA 的表达上调，而IL-4、IL-10mRNA 的表达下调，与空白对照组比较明显差异（P ＜0.01）。结论 脑微血管内皮细胞（MVECs ）有可能使神经干细胞的INF-γ、 IL-2表达上调，IL-4、IL-10的表达下调。 〔关键词〕脑微血管内皮细胞；神经干细胞；Th1细胞因子；Th2细胞因子〔中图分类号〕R743.34 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0512-05；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.034 The expressions of Th1/Th2related cytokines after co-cultured microvascular endothelial cells with neural stem cells in vitro LUO Wen-Fang ，TANG Tao ，LI Xing-Qun ，et al . TCM Research Insitute of Xiangya Hospital Central-South University ，Changsha 410008，Hunan ，China 【Abstract 】Objective To investigate microvascular endothelial cells （MVECs ）on the expressions of IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10of NSCs in vitro.Methods Rat neural stem cells （NSCs ）aged 3 5day were adopted for amplification in vitro ，and co-cultured microvascular endothelial cells with neural stem cells.After 48h ，the expressions of IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10were assayed by immunohistochemistry and RT-PCR.Results After 48h of co-cultured ，the NSCs was positive of expressions in cytokines INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10；and the expres-sions of INF-γ，IL-2were increased ，the expressions of IL-4，IL-10were deceased （P ＜0.01）.Conclusions MVECs maybe up-regulate the expressions of IFN-γ，IL-2and down-regulate the expressions of IL-4，IL-10of NSCs.【Key words 】Microvascular endothelial cells （MVECs ）；Neural stem cells ；Th1cytokines ；Th2cytokines 基金项目：国家自然科学基金资助项目（30472264）1 南华大学附属第一医院中医科 通讯作者：黎杏群（1933-），女，教授，主要从事中西医结合脑血管病及 肿瘤病研究。 第一作者：罗文芳（1980-），男，硕士，主要从事中西医结合脑血管病及 肿瘤病研究。 Th 细胞是决定移植免疫排斥的关键成分，Th1细胞产生IFN-γ和IL-2介导细胞免疫；Th2细胞则产生IL-4、IL-10等，介导体液免疫。针对同种异体抗原的移植免疫应答主要是由Th1细胞介导。研究发现，在移植器官功能发生障碍之前，常检测到IFN-γ、 IL-2基因表达增高〔1〕 。侧脑室的脑室下带（Svz ）和海 马的颗粒下带（SGz ）集中于血管周围，而且和内皮细胞间仅隔一层基板，这种解剖上的毗邻关系暗示了NScs 和内皮细胞间存在密切的联系。本实验模拟内皮细胞与神经干细胞的体内环境建立共培养模型，观察Th1/Th2细胞相关细胞因子的变化，探讨同种异体内皮细胞与神经干细胞的免疫反应关系。1材料与方法1.1材料1.1.1 实验动物 新生3d 的Sprague-Dawley 乳鼠6只，新生 7 10d Sprague-Dawley 乳鼠20只，雌雄不拘，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。 1.1.2主要试剂及药物M199干粉培养基、D-Hank's 液干粉 （Hyclone ），谷氨酰胺（上海伯奥），肝素钠、明胶、台盼蓝、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma ），胎牛血清（杭州四季青），DNase Ⅰ（Roche ），多聚赖氨酸（武汉博士德），bFGF 、EGF （Pepro Tech EC ），抗Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（美国PharMingen ），Trizo1试剂盒、DNA Marker 、逆转录（RT ）试剂盒、Pre Mix Taq （宝生物大连），β-actin 引物（上海生工），一抗（Abcam ），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 、辣根酶标记链霉亲和素、浓缩DAB 试剂盒（北京中山），其他常用试剂为国产分析纯产品。1.1.3 主要仪器 OLYMPUS IXTO 倒置显微镜（日本OLYM-PUS ），QWJ300TVBB 型CO 2培养箱（美国产），Sanyo 超低温冰箱（日本三洋），ELX800酶标仪（美国产），超净工作台（苏州净化）， E260电子天平（梅特勒），Beckman J2-21型低温离心机（美国产），Beckman DU-640紫外分光光度计（美国产），Nikon 倒置荧光相差显微镜（日本尼康）， PCR 仪（美国ABI ），DDY 多导电泳仪（北京六一）， UPW-5超纯水仪（美国产），DHW-60恒温水浴箱、DHP-81恒温箱（上海医用仪器厂），50ml 培养瓶、培养板、滤器等耗材（Costar 、Millipore 等公司）。1.2方法 1.2.1 血管内皮细胞培养液的配制 用超纯水溶解M199干 粉培养基，配制成体积比为1?1的M199无血清培养基（每1000ml 培基中另加2.2g 碳酸氢钠、1g 葡萄糖、0.9g 谷氨酰
毛细血管(二)
毛细血管（二） 毛细血管（capillary）是管径最细，分布最广的血管。它们分支并互相吻合成网（图8－8）。各器官和组织内毛细血管网的疏密程度差别很大，代谢旺盛的组织和器官如骨骼肌、心肌、肺、肾和许多腺体，毛细血管网很密；代高血压较低的组织如骨、肌腱和韧带等，毛细血管网则较稀疏。 图8-8 人胃粘膜血管铸型扫描电镜像示毛细血管网 （一）毛细血管的结构 毛细血管管径一般为6～8μm，血窦较大，直径右达40μm。毛细血管管壁主要由一层内皮细胞和基膜组成。细的毛细血管横切面由一个内皮细胞围成，较粗的毛细血管由2～3个内皮细胞围成。内皮细胞基膜外有少许结缔组织。在内皮细胞与基膜之间散在有一种扁而有突起的细胞，细胞突起紧贴在内皮细胞基底面，称为周细胞（pericyte）（图8－9，8－10）。周细胞的功能尚不清楚，有人认为它们主要起机械性支持作用；也有人认为它们是未分化的细胞，在血管生长或再生时可分化为平滑肌纤维和成纤维细胞。 图8-9 毛细血管扫描电镜像示周细胞 P 周细胞胞体 1、2周细胞突起
图8-10 毛细血管电镜像 左图连续毛细血管，中图有孔毛细血管，右图毛细血管扫描电镜像示内皮孔 E 内皮细胞，P周细胞，↑内皮细胞孔 (二)毛细血管的分类 光镜下观察，各种组织和器官中的毛细血管结构相似，但在电镜下，根据内皮细胞等的结构特点，可以将毛细血管分为三型。 1．连续毛细血管连续毛细血管（continuous capillary）的特点为内皮细胞相互连续，细胞间有紧密连接等连接结构，基膜完整，细胞质中有许多吞饮小泡。连续毛细血管分布于结缔组织、肌组织、肺和中枢神经系统等处。肺和中枢神经系统内的毛细血管内皮细胞甚薄，含吞饮小泡较少（图8－10）。 2．有孔毛细血管有孔毛细血管（fenestrated capillary）的特点是，内皮细胞不含核的部分很薄，有许多贯穿细胞的孔，孔的直径一般为60～80nm（图8－10）。许多器官的毛细血管的孔有隔膜封闭，隔膜厚4～6nm，较一般的细胞膜薄。内皮细胞基底面有连续的基板。此型血管主要存在于胃肠粘膜、某些内分泌腺和肾血管球等处。肾血管球的内皮细胞的孔没有隔膜。 3．血窦血窦（sinusoid）或称窦状毛细血管（sinusoid capillary），管腔较大，形状不规则，主要分布于肝、脾、骨髓和一些内分泌腺中。血窦内皮细胞之间常有较大的间隙，故又称不连续毛细血管（discontinuous capillary）。不同器官内的血窦结构常有较大差别，某些内分泌腺的血窦，内皮细胞有孔，有连续的基板；有些器官如肝的血窦，内皮细胞有孔，细胞间隙较宽，基板不连续或不存在。脾血窦又不同于一般血窦，其内皮细胞呈杆状，细胞间的间隙也较大。 （三）毛细血管与物质交换 毛细管是血液与周围组织进行物质交换的主要部位。人体毛细血管的总面积很大，体重60kg的人，毛细血管的总面积可达6000m2。毛细血管管壁很薄，并与周围的细胞相距很近，这些特点是进行物质交换的有利条件。 物质透过毛细血管壁的能力称毛细血管通透性（capillary permeability）。毛细血管结构与通透性关系的研究表明，内皮细胞的孔能透过液体和大分子物质，吞饮小泡能输送液体，细胞间隙则因间隙宽度和细胞连接紧密程度的差别，其通透性有所不同。基板能透过较小的分子，但能阻挡一些大分子物质。另外一些物质，如O2、CO2和脂溶性物质等，可直接透过内皮细胞的胞膜和胞质。
脑卒中患者静脉溶栓护理常规
脑卒中患者静脉溶栓护理常规 一、rtPA（阿替普酶）溶栓入选标准 1、年龄18-80岁（最新指南无年龄上限） 2、临床诊断为缺血性脑卒中、并引起可评估的神经功能缺失（如语言、运动功能、认知的 损害、凝视障碍、视野缺损或/和视觉忽视）。缺血性组中定义为突然发生的急性局灶性的神经功能缺损，推测原因为脑缺血，CT除外出血。 3、症状出现3小时内（最新指南为4.5小时内）开始溶栓治疗 4、组中症状持续至少30分钟，治疗前无明显改善，临床表现必须和全脑缺血（如晕厥）、 癫痫或偏头痛鉴别 二、rtPA溶栓排除标准 1、CT或MRI检查发现出血、明显的占位效应伴中线移位（梗塞范围大）、急性低密度病 灶或脑沟消失，>MCA供血范围的1/3、颅内肿瘤、动静脉畸形或蛛网膜下出血征象。 2、昏迷或临床评估（如NIHSS>25）和/或其他合适的影响学证实为严重卒中 3、发病时伴有癫痫发作 4、3月内有过卒中史 5、发病前48小时内应用肝素，并且APTT超出实验室正常值上限 6、既往有卒中史且合并糖尿病病史 7、血小板计数<100,000/mm3 8、积极的降压治疗后高血压仍未得到控制，未控制的高血压是指间隔至少10分钟，重复3 次测得的收缩压>185mmHg或舒张压>110mmHg 9、血糖<2.7mmol/l 或>22.2mmol/l 10、目前或既往6个月内有显著出血性疾病 11、患者正在口服抗凝药（如华法令），INR>1.5 12、已知有颅内出血病史或怀疑颅内出血（包括蛛网膜下腔出血） 13、妊娠期或哺乳期 14、有严重中枢神经系统损害的病史（如肿瘤、动脉瘤、颅内或脊髓手术） 三、溶栓前准备： 抽血（血常规+血型，凝血四项，生化），ECG，CT，建立2条静脉通路，给予吸氧，心电监护，备好微量泵，溶栓药物，抢救设施和药品。 四、溶栓药物及用法：阿替普酶 ?总量0.9mg/KG，总用量不大于90mg,加入生理盐水中， ?先10%静推（弹丸式给药，1分钟内） ?余量1小时内泵入 五、溶栓后观察要点： ?生命体征、瞳孔， ?意识状态 ?头痛 ?出血征象，血常规、凝血功能监测 ?NIHSS评分 ?4及24小时复查CT ?24小时内绝对卧床、避免插胃管、尿管 1、溶栓时护士须严密监测患者呼吸，脉搏，意识，瞳孔及血压变化，尽量排除一切影响患者呼吸、脉搏、意识、瞳孔及血压变化的因素，嘱患者安静休息，避免紧张激动等，溶栓开
最新脑卒中静脉溶栓流程图(试行)
精品文档 精品文档 急性脑梗死静脉溶栓流程（试行） ⑴ 通知脑卒中小组成员（神经内科主任王晶、韩淑祯、倪中华等） 卒中小组成员立即行 1、初步评估（神经系统相关检查、NIHSS 评分、绝对禁忌症排除）。 2、如果评估患者为脑卒中，有溶栓可能，与家属初步沟通，签署溶栓治疗沟通意向书。 3、急诊完成溶栓前相关检查（急诊凝血7项、急诊肾功 及电解质、血糖、血常规、）不要求查动脉血气 4、护理组留置针（肘静脉）开放通道。 （要求15五分内钟完成）。 静脉溶栓（要求60分内钟内完成） 经过神经内科急会诊，患者有静脉溶栓指征 急诊检验 急诊卒中小组人员追踪急诊血生化结果回报（要求45五分内钟完成） 为争取时间，必要时可由患者家属送检血标本 急诊卒中小组人员送患者到CT 室行急诊头颅CT 平扫，根据CT 扫描结果判断，并且电话联系神经内科值班医师PACS 系统读片会诊；（要求25五分内钟完成） 结果判定（要求45五分内钟完成） 1. 急诊卒中小组人员根据急诊CT 平扫结果判断决定； （1） CT 发现脑梗死的责任病灶，电话联系神经内科值班医师到急诊或CT 室急会诊； （2）CT 发现脑出血，根据出血量联系神经内科、神经外科医师到急诊会诊，必要时急诊CTA 检查。 （3） CT 发现蛛网膜下腔出血，电话联系神经外科值班医师PACS 系统读片会诊后，请神经外科医师到急诊会诊。 急诊分诊台通知急诊值班医生，初步判断卒中可能 评估时间窗完成流程可能 （要求5分钟内完成） 根据会诊及CTA 检查结果 120接到脑梗死可能患者，主动通知神经内科病区。 电话：7231358 患者家属护送来院 通知CT 室准备急诊CT
小鼠视网膜微血管内皮细胞使用说明
小鼠视网膜微血管内皮细胞 小鼠视网膜微血管内皮细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠视网膜微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠视网膜微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠视网膜微血管内皮细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠视网膜微血管内皮细胞（Mouse Retinal Microvascular EndothelialCells） 2、组织来源：小鼠视网膜组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠视网膜微血管内皮细胞简介： 小鼠视网膜微血管内皮细胞（Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells）来源于成年小鼠视网膜组织，其是组成血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在视网膜血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。 本公司生产的小鼠视网膜微血管内皮细胞采用胶原酶消化和密度梯度离心制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有
大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定
相类似。 本研究提示SARS 病毒并非来源于人工驯养的野生动物,而是来源于野生动物,其中蛇、鹰、蛤蚧、鳖最为可能。广西原发病例接触病死猫后发病,因而老鼠仍很可能是SARS 病毒的最原始宿主,但其极低携带率和极低病毒量不但难于直接传给人类,而且也难检测到阳性老鼠。SARS 抗体阳性的鹰,蛇、龟、蛤蚧均为食肉动物,而且高空飞翔的鹰和冬眠的蛇均有利于病毒繁殖和携带的低氧分压状态。这些野生动物通过对鼠等动物的猎食而感染、富集。然后在其体内繁殖和携带。当被人类猎捕后,在冬末早春气温较暖湿度大的南方,长途运输严重缺氧使病毒发生变异,形成毒力和侵袭力强的SARS 病毒,在贩运人员和厨师近距离接触和捕杀过程中受伤感染而发病,然后通过家人护理或就医的医院医护人员诊疗中密切接触造成人间传播和暴发流行。2003年我国成功扑灭SARS 的疫情,其中严格禁止捕猎贩运和宰杀野生动物是最主要的措施之一,与本研究结果相吻合。因此,应禁止捕猎贩运和宰杀野生动物、每年冬春季节加强对发热肺炎病人监测,尤其是捕猎贩运和宰杀野生动物史或实验室病源研究史的发热肺炎病人监测排查、同时大搞爱国卫生运动、降低甚至消除鼠类等传播疾病的病原媒介是防范SARS 的发生和控制扑灭SARS 疫情的首要措施。至于疑为SARS 病毒最原始宿主鼠类和蝙蝠及其通过食物链进入二级宿主野生动物的过程和机理仍有待以进一步的研究。(参加本文工作的还有杨庆利、钟革、蓝光华、冯向阳、熊绮梦、陈岳波、韦东禄、刘志高、石友盟、李建民、蒙世安,在此一并致谢) 参 考 文 献 1 王汉章,王茂武,王建伟,等主编1传染性非典型肺炎防 治培训教材(修订版).北京:中国协和医科大学出版社, 2003.3210. 2 廖祯华主编.广西壮族自治区地图集.北京.星球地图出 版社.2003.42247. 广西医科大学学报 2006Feb ;23(1) 3广西区卫生厅资助课题(Z2002098)收稿日期:2005202201 大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定3 滕晓茗 周微雅 黄 燕 周祥祯 (广西壮族自治区人民医院 南宁 530021) 摘要 目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定。结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,透射电镜可见Weibel 2Palade 小体。第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性。结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。关键词 脑微血管;内皮细胞;体外培养 中国图书资料分类法分类号 R331;R322113 THE METH ODS OF CU LTURING AN D IDENTIFYING CEREBRAL MICR OVASCU LAR EN 2DOTHE L IAL CE LL IN RATS Teng Xiaoming ,Zhou Weiya ,Huang Yan ,et al.(The People ’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region ,Nanning 530021China )Abstract Objective :To explore t he met hods of cult uring rat cerebral microvascular endot helial cells (RC 2M ECs ),so as to build up t he basis for t he st udies of vascular endot helial cells.Methods :After t he RCM EC were digested wit h collagenase Πto make suspension which are cultivated ,t he RCM EC were identified by immunohistochemical met hods and observed wit h light micro scope and elect ron microscope.R esult :Isolated RCM ECs grow to mo nolayer after one week of external cultivation.They present polygonal and arrange like pavement stones under light micro scope.Weibel 2Palade (W 2P )body can be seen under transmission e 2lect ron micro scope.Correlation antigens of Ⅷfactor are positive by fluorescent stain.Conclusion :The met hods for t he cultivation and identification of RCM ECs could cultivate cerebral microvascular endot helial cells. K ey w ords cerebral microvascular ;endot helial cell ;cultivation in external ? 05?广西医科大学学报 2006Feb ;23(1)
人脑微血管内皮细胞培养
Human Brain Microvascular Endothelial Cells 人脑微血管内皮细胞 人脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，并使其能够限制可溶性和细胞样物质从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些特性：如1）脑微血管内皮细胞有许多细胞间紧密连接，这些连接造成很高的跨内皮阻抗，并能延迟细胞旁的通量；2）脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞窗孔结构并且其液相物质胞饮水平低；3）脑微血管内皮细胞具有不对称定位的酶和载体介导的转运系统，从而造成“两极分化”的表现型。与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子以调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞应来源于拟研究的疾病的相关组织。 细胞培养说明 注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。将小瓶置于37°C水浴融化细胞，然后尽快移入培养物(液)中，尽量减少操作。 经过以下步骤后开始培养细胞 1.准备纤维连接蛋白包被的培养瓶(2 μg /cm2，推荐用T-75的培养瓶)。向培养瓶中加入10 ml 无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS），然后加入150 μl 纤维连接蛋白原液(1 mg/ml, Sigma cat. no. F1141)。将培养瓶放入培养箱中孵育过夜。 2.准备完全培养基：用70%的酒精消毒培养基和添加物的外表面，然后放到无菌的地方。在无菌环境下打开每一个添加物管并用吸管将其加入到基本培养基中。以保证添加物全部加入基本培养基中。 3.吸出纤维连接蛋白溶液并向瓶内加入20 ml完全培养基。将培养瓶放入超净台中，然后准备融化细胞。纤维连接蛋白溶液可以使用两次。 4.将小瓶放入37°C水浴中，握住并轻轻旋转小瓶直到其内细胞完全融化。将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹。eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。 5.将管内容物均匀的放入纤维连接蛋白包被的培养瓶中。推荐的接种密度为7,500 cells/cm2。注意：不推荐在细胞融化后进行稀释和离心，因为这些操作比培养基中的DMSO残留物对细胞的伤害更大。需要注意的是，内皮细胞接种在纤维连接蛋白包被的培养瓶中能够促进细胞的帖壁。 6.盖好培养瓶的盖子，轻轻地摇动培养瓶以使细胞分布均匀，如需气体交换则适当放松瓶盖。 7.将培养瓶放入培养箱中。 8.为了得到良好的结果，在培养开始后至少16个小时内不要动培养物。第二天更换培养基以去除残留的DMSO和未贴壁的细胞，然后每隔一天进行如上操作。培养良好的细胞将呈现鹅卵石形或纺锤体形，细胞质无颗粒且细胞数量在培养2-3天后会倍增。
脑卒中静脉溶栓及护理
脑卒中静脉溶栓及护理 神经内一科 孙倩玉 一：溶栓疗法 应用纤溶酶原激活剂一类的溶栓药物，直接或间接的使血栓中的纤维蛋白溶解，从而使被阻塞的血管再通，这种治疗方法称为溶栓疗法。 二溶栓药物 1、链激酶 用量（1.5~15）×105U 和尿激酶均为非选择性纤维蛋白溶解剂，使血栓及血浆内纤溶酶原均被激活，导致全身溶栓及抗凝状态，有引起脑出血危险。 有3个大型的随机试验都因为应用链激酶致出血率和死亡率增加而暂停。所以除非有进一步应用链激酶的临床试验来证实链激酶应用的适应症，不应使用链激酶治疗脑卒中。 AHA和ANA也不主张采用链激酶进行溶栓治疗 2、尿激酶 国内多以25~250万U静脉滴注；国外研究及报道均较少，可借鉴经验少。 容易得到，抗原性小，半寿期短。最近有报道，对于发病3-6小时内的大脑中动脉闭塞的患者动脉予尿激酶原溶栓治疗是有益的(IIb级)。 3、组织型纤溶酶原激活酶 rt-PA和SW-PA有更高的纤维蛋白特异性和更短的半寿期（5～8min），rt-PA的安全性和有效性已得到证实。rt-PA为本科主要溶栓药物。 三溶栓药物的选择 1、链激酶： 有3个大型的随机试验都因为应用链激酶致出血率和死亡率增加而暂停。所以除非有进一步应用链激酶的临床试验来证实链激酶应用的适应症，不应使用链激酶治疗脑卒中。 AHA和ANA也不主张采用链激酶进行溶栓治疗 2、尿激酶：容易得到，抗原性小，半寿期短。最近有报道，对于发病3-6小时内的大脑中 动脉闭塞的患者动脉予尿激酶原溶栓治疗是有益的(IIb级)。 3、rt-PA：和SW-PA有更高的纤维蛋白特异性和更短的半寿期（5～8min），rt-PA的安全 性和有效性已得到证实。 四溶栓的必要性 1、脑血管闭塞后，体内纤溶系统激活，闭塞血管44％～75％可自然再通 2、再通时间：发病后数小时～数天。高峰期：发病后3～4天 3、此时缺血半暗带的脑组织已出现不可逆损害，因此促进血栓溶解，恢复脑血流，挽救尚 未形成永久损害的脑组织是治疗急性缺血性脑卒中的关键 五治疗时间窗 1、因缺血半暗区仅存在几小时，故多数临床治疗时间限制在出现症状后6～8小时，头颅 CT扫描尚未形成低密度病灶 2、也有在症状出现几天后溶栓治疗有效，且不会增加危险性 3、理论上治疗时间越早越好，美国心脏病学会（AHA）和美国神经病学会（ANA）建议对
2.04 缺血性脑卒中静脉溶栓治疗流程
缺血性脑卒中静脉溶栓治疗流程
东莞市大朗医院神经内科 急性脑梗死溶栓治疗规范 一、医疗流程 （一）神经科医生初步检查临床初步确认脑卒中，送往急诊CT，示未见脑出血，进行溶栓适应症及禁忌症表格的填写。如患者家属有溶栓意愿，通知护理人员准备溶栓，启动溶栓流程。 （二）急查指尖血糖、血常规、血电解质、肾功、凝血功能、D-二聚体，行心电图检查，进行NIHSS评分、格拉斯哥评分。 （三）向患者家属交代病情，告知患者及家属患者或家属了解溶栓治疗是目前唯一有效的急性期治疗药物，是全世界各国普遍采用的标准治疗。每治疗100例约32例获益，3例出现出血，或溶栓治疗使患者获益的可能是受害的可能的10倍，但单个个体溶栓治疗的获益尚不能准确的预测。治疗越早，利弊比越好，要求患者家属尽快做出决定（每分钟死亡190万个神经元细胞）。 （四）让患者家属签署静脉溶栓知情同意书。如患者或家属拒绝溶栓，签署拒绝溶栓协议书。 （五）根据患者体重算出阿替普酶剂量，按照0.9mg/Kg计算。 （六）核对患者所有检查及化验报告、确认血压值、血糖值是否适合溶栓。 若血糖高，静脉应用胰岛素尽快将血糖水平控制在8mmol/L以下。
溶栓过程中或溶栓后——维持血压低于180/105mmHg。如果发现2次或持续性收缩压大于185 mmHg或舒张压大于大于110 mmHg （血压检查间隔至少10分钟），则给予乌拉地尔25mg缓慢静注。如果血压仍大于185/110 mmHg，可重复给药（至少间隔5分钟）。最大总剂量不超过50mg。在静脉注射后，为维持其降压效果，可持续静脉点滴。液体按以下方法配置：通常将250mg乌拉地尔加入静脉输液中，如用输液泵，将20ml注射液（=100mg乌拉地尔）加入输液泵中，再稀释至50ml。静脉输液的最大药物浓度是4mg/ml乌拉地尔，输液速度根据患者的血压酌情调整。初始输液速度可达2mg/分，维持给药速度为9mg/小时。 （七）抽出溶栓总剂量10%的阿替普酶在1分钟内静推，其余药物在1小时内静脉泵入完毕。 （八）溶栓过程及溶栓后注意检测神经功能（NIHSS评分）：最初2小时内，1次/15分钟，随后6小时，1次/60分钟，此后1次/4小时。直至24小时。 （九）rt-PA输注过程中注意事项。出现下列情况，停止输注。 1、过敏反应：显著的低血压、舌源性肿胀。 2、神经功能恶化：意识水平下降（GCS眼运动项评分下降2分），病情加重（NIHSS评分增加4分） 3、血压大于185/110mmHg持续存在或伴神经功能恶化 4、严重的全身出血：胃肠道或腹腔内出血。 （十）过敏反应处理
脑内皮细胞
HBMEC (Human Brain Microvascular Endothelial Cells 人脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。如：1）脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；2）脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低；3）脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化”的表现型。与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。 大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障[1]。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点[1]，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。自从Panula等[2]首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法已有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主[3,4]，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的[5]，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养[6~9,11,12]。由于原代培养中无法避免地混杂成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞等其他细胞的生长，而且工作量大、过程繁琐且费用高[1]，进行较纯的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养一直是国内外的一个难点。 本人参照文献[6]、[7]、[8]的方法，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。 1.材料与方法 1.1 实验动物 每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。 1.2 试剂