荧光探针的应用

荧光探针的应用
荧光探针的应用

荧光分析法检测原理及应用举例

1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态,当其从激发态回到基态时,过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光,称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光,供能一旦停止,荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光,由光激发引起的荧光称为光致荧光,课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同,荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光,课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上,分子对此光有吸收作用,光能量被分子所吸收,分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级,称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态,并随时在激发态的不同振动能级下降至基态,在下降过程中,分子产生发光现象,此过程为释放能量的过程,即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区,光具有较高的能量,当某一特征波长的光照射分子时,是的分子会吸收此特征波长的光能量,能量由光传递到分子上,此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程,在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差,即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中,存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1,它表示电子在自转过程中,具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的,那么2S+1=1,电子所处的激发态为单重态, 用S i 表示,由此可推出,S 即为基态的单重态,S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态,S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对,说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化,存在不配对的电子为2个,2S+1=3,电子 在激发态中位于第三振动能级,称为三重态,用T i 来表示,T 1 即为第一激发态中 的三重态,T 2 即为第二激发态中的三重态,以此类推。

2017肿瘤检测相关公司汇总

厦门艾德 K-ras ;BRAF ;PIK3CA ;NPM1; 突变检测或多态性检测;荧光定量/毛细管电泳 EGFR ;EML4-ALK 有无医疗器械证 江苏为真 EGFR ;KRAS ;EML4-ALK ;KRAS ;BRAF ;PI3K ;C-kit ;P DGFRA Taqman-ARMS qPCR-HRM ERCC1; BRAC1; TUBB3; BRAC1; STMN1; RRM1; RRM1; EGFR 荧光定量PCR CYP19A1;UGT1A1;CYP2D6;MTHFR ;DPD ;ERCC1;GSTP1; XRCC1 荧光定量PCR+高分辨率熔点曲线 分析(HRM ) EML4-ALK 融合基因检测试剂盒 通过RT-PCR 方法检测EML4-ALK 的多种融合突变 武汉友芝友 人类EGFR 基因29种突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 采用ARMS-PCR 荧 光定量技术 人类KRAS 基因7种突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 采用ARMS-PCR 荧 光定量技术 人类BRAF V600E 突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 采用ARMS-PCR 荧光定量技术 北京雅康博 人EGFR 基因突变检测试剂盒(荧光PCR 法) 采用荧光PCR 技术 人KRAS 基因突变检测试剂盒(荧光PCR 法) 采用荧光PCR 技术 人PIK3CA 基因突变检测试剂盒(荧光PCR 法) 人EML4-ALK 融合基因检测试剂盒(荧光PCR 法) 人VEGF 基因表达量检测试剂盒(荧光PCR 法) 人RRM1基因表达量检测试剂盒(荧光PCR 法) 人ERCC1基因表达量检测试剂盒(荧光PCR 法)

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1):1.识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键,氢键等作用实现。2.信号报告基团(发色团, F),把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用,它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择,一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[21] +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1.2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测,要求荧光基团要有强的荧光(高荧光量子产率,有利于提高检测的灵敏性),Stokes 位移要大(可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象),荧光发射最好要在长波长区(最好位于500 nm 以上,可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命)。(b) 受体分子的识别基团:受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等)作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

荧光比率探针及其应用研究进展

7 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中,可被紫外线或蓝紫光(短波长光)激发而发射荧光的染料,称为荧光染料(荧光色素)。可被长波长光激发,这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色,以及或活细胞中的应用, 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、PH值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物(如生命金属离子)进行结合后,引起荧光特性发生变化,通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等,获得相关信息。 荧光方法测定中,荧光探针在与反应物结合后,出现激发或发射光谱移位的探针,可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定,称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据, 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比,比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常,这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变(溶剂化显色迁移),同外部电场的交互作用(电致显色迁移)和在发色团中的双电弛豫(双电弛豫迁移)。 另外一种结合探针,荧光谱包括2个或更多的谱带。通常,是这些谱带相对强度的改变,激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳* ,郭成海,张国胜 (防化研究院第四研究所,北京 102205) 摘要 本文介绍了荧光比率探针,包括阳离子探针、阴离子探针、pH值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析,比率测量 *作者简介:杨柳(1975-),男,助理研究员,博士研究生,E-mail:yangliujinjin@sina.com 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素(照明稳定性)引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除,如AM酯可被P糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后,出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准,可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Bright等(1989)发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响,包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内(区室化作用引起)或不同细胞群之间(负载效率差异造成)的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域:离子探针(阳离子探针Ca2+、Mg2+,Zn2+,Ag+等)阴离子探针(Cl-,CN-,F-等),膜探针、活性氧和一氧化氮探针,极性探针、PH值探针等等。 1应用比率测量的阳离子探针: 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用, 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分,参与并调节生物体的代谢活动等,荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 1.1 Ca2+检测的比率测量探针: 探针与Ca2+结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括:Fura-2、双- Fura-2、Fura-4F、Fura-5F、Fura-6F、 indo-1、indo-5F、mag-Fura-2

细胞示踪荧光探针的基础知识概述

细胞荧光探针北欧广泛应用于测定细胞总量、干细胞体外实验、追踪活细胞行踪,细胞荧光探针有许多种,由于篇幅原因这就主要介绍以下三种:细胞增殖示踪荧光探针CFDA SE、活细胞荧光示踪探针VFSE 450、DiI(细胞膜红色荧光探针)。 细胞增殖示踪荧光探针CFDA SE CFDA SE的全称为Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester,是一种近年来被广泛应用的细胞增殖检测用荧光探针,也可以用于细胞的荧光示踪。 基于CFDA SE荧光标记的细胞增殖检测和[3H]-thymidine掺入、BrdU标记获得的检测结果完全一致,但同时可以提供更多的细胞增殖信息。使用CFDA SE检测可以提供整个细胞群中有多少比例的细胞分裂了1次、2次或更多次数,同时如果和其它荧光探针联用,可以获取不同分裂次数细胞的其它相关信息。 CFDA-SE的分子式为C29H19NO11,分子量为557.47,CAS number为150347-59-4。CFDA SE 可以通透细胞膜,进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成CFSE,CFSE可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基发生结合反应,并标记这些蛋白。在加入荧光探针CFDA SE后大约24小时,即可充分标记细胞。被CFDA SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定,稳定标记的时间可达数个月。CFDA SE标记细胞的荧光非常均一,比以前使用的其它细胞示踪荧光探针例如PKH26的荧光更加均一,并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。 由于CFDA SE标记细胞的荧光非常均匀和稳定,每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半,这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞,分裂一次的细胞(1/2的荧光强度),分离两次的细胞(1/4的荧光强度),分裂三次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其它分裂次数的细胞。采用CFDA SE通过流式细胞仪检测获得的检测结果参考右图。每一个峰代表一种分裂次数的细胞,从右至左的峰通常依次为分裂0次、1次、2次、3次等次数的细胞。分裂次数较多后,分裂0次或1次等没有分裂或分裂次数较少的细胞会逐渐减少直至检测不到。 使用CFDA SE可以检测分裂多达8次或更多次数的细胞增殖。 目前CFDA SE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。最常用于淋巴细胞的增殖检测,也可以用于成纤维细胞、NK细胞等其它细胞的增殖检测,甚至还可以用于细菌增殖的检测。 CFDA SE标记细胞呈绿色荧光,检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为518nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。CFDA SE标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察。 CFDA SE标记的细胞无论在体外还是体内都不会使邻近细胞染色。即CFDA SE荧光探针完成标记后不会从一个细胞转移到邻近细胞。 CFDA SE标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞,最佳标记时间需自行摸索。 CFDA SE可以使用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制,配制浓度通常为2-10mM。配制好的溶液宜当天使用完毕,不宜长时间保存。CFDA SE标记细胞时的最终浓度通常为0.2-10μM或更高一些。 在工作浓度为5μM时,一个包装的本产品共可以标记约1.8升的细胞。

荧光探针汇总

1.Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱,进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3,从而被滞留在细胞内,和细胞内游离 的钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果,因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm (绿色) 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM(钙离子荧光探针) 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2,从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合,结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光,而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度,可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异,荧光探针的渗 漏,细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果,因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm (蓝色) 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM (钙离子荧光探针) 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F,它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时,Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似,所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果,因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm (绿色) 备注用激光器激发时荧光强度强,因此不推荐 4.DCFH-DA (活性氧荧光探针) 原理DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm (绿色) 备注推荐使用 5.DHR 123 (活性氧荧光探针) 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm (绿色) 备注氧化后成罗丹明123,荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 (线粒体膜电位荧光探针) 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm (绿色) 生理意义检测线粒体膜电位

荧光探针汇总

精心整理 1. Fluo-3AM (钙离子荧光探针) 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱,进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3,从而被滞留在细胞内,和细胞内游离的钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果,因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm (绿色) 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM (钙离子荧光探针) 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm (绿色) 备注氧化后成罗丹明123,荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23(线粒体膜电位荧光探针) 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm (绿色) 生理意义检测线粒体膜电位

备注正在使用 7.Hoechst33342(DNA荧光探针) 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm(蓝色) 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI( 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性,因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光,且细胞毒性很低,适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm(绿色) 备注跟FDA功能类似,细胞毒性很低,可以长时间标记细胞,但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料,BCECF-AM没有荧光,进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF,从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH

基于EET机理比率型荧光探针的研究进展

有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE * E-mail: yuhaibo@https://www.360docs.net/doc/af11556208.html, Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010). 国家自然科学基金(No.21302080),辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目. DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文 基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展 陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,* (a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036) (b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024) 摘要 激发态能量转移(Excitation Energy Transfer, EET )作为一类重要的光物理现象,被广泛用于比 率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖,通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程,实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响,以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离,获得识别不同客体的比率型荧光探针,并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。 关键词 荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团 Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a * (a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang) (b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian) Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted. Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore 随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展,基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变,借助于荧光信号的变化,荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测,并被广泛用于分析化学,生物化学,医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型:淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后,荧光输出信号增强,在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏,故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。 与增强型荧光探针相比,比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势,近些年来,比率型荧光探针的设计

QPCR原理及指导应用

QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测,很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑,不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起,包括real-time qPCR的原理,实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教你从各个方面了解real-time qPCR,彻底的从菜鸟到高手! 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点,real-time qPCR 由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年,美国PE公司(已经并入Invitrogen公司)成功研制了Taqman 技术,1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统,通过检测每个循环的荧光强度,通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISMStepOneTM系列;BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列;Stratagene MxTM系列;Roche LightCycler系列;Eppendorf Masercycler;Corbett Rotor-GeneTM;Cepheid SmartCycler和BIOER 的LineGene系列。

SNP检测方法汇总

现在SNP的常用检测方法主要有:Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。Taqman法:准确性高,适合于大样本、少位点,价格比较贵;质谱法:准确性高,适合于大样本、多位点(能检测25个位点);芯片法:准确性较低,适合于超多位点分析;测序法:非常准确,但是价格也非常的高,但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP的方法有许多种,本文收集目前还在用的方法,按通量从高到低排列: 全基因组测序 这是最贵的方法,但也是看SNP最全的方法 大概一个人样本,花2万元 外显子组测序 外显子组测序,也可以得到较全面的SNP信息 大概一个人样本,花1.5万元 随着人全基因组测序的价格降到2万元左右,外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理,核酸杂交,荧光扫描

Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片,例如: Affymetrix: CytoScan,SNP 6.0, Illumina: 660,中华,450K等 SNP芯片,在2000~5000元每样本,还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法 原理,精确测量PCR产物的分子量,就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的 单个位点、单个样本的费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了 如果测几十个点,到上百个点,是很方便的方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创,一次测几百个位点 原理: 用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段

荧光定量pcr法原理汇总

我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品,显然,作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的,比如,由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物,也不能区分不同探针,所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法;需要在PCR后进行熔链曲线分析;也不能做多重PCR检测(Multiplex)。 上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术,将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑,之后在此基础上发展出了杂交探针法,以及荧光引物法,是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。 要提到荧光探针或者荧光引物,有一个基础概念需要首先明确,那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET):一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠,当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时,激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收,使得供体发射的荧光强度衰减,受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。 实时荧光PCR中另一个很重要的概念,即Ct值.C代表循环(Cycle),T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 一:水解探针法 TaqMan技术

浅谈荧光分析法的特点及在环境分析中的应用

荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要:论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点,以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用,测定范围和发展情况。 关键词:荧光分析;环境分析;应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质,有很多还具有时间性和空间性,因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低,灵敏度高,选择性好,取样量少,方法简捷快速等特点,是一种重要的光谱化学分析手段,其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此,在对环境的分析中,荧光分析法应用非常广泛,从天然水、饮用水到废水、污水;从土壤、大气到动植物;从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官,涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后,电子从基态跃迁到激发态,然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态,即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光,而当紫外光停止照射时,所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光,真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象,由于分子对光的选择性吸收,不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长,并记

荧光分析法检测原理及应用举例

1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态,当其从激发态回到基态时,过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光,称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光,供能一旦停止,荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光,由光激发引起的荧光称为光致荧光,课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同,荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光,课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上,分子对此光有吸收作用,光能量被分子所吸收,分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级,称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态,并随时在激发态的不同振动能级下降至基态,在下降过程中,分子产生发光现象,此过程为释放能量的过程,即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区,光具有较高的能量,当某一特征波长的光照射分子时,是的分子会吸收此特征波长的光能量,能量由光传递到分子上,此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程,在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差,即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中,存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中,具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的,那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态,用S i 表示,由此可推出,S0 即为基态的单重态,S1 为第一跃迁能级激发态的单重态,S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对,说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化,存在不配对的电子为2个,2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级,称为三重态,用T i 来表示,T1 即为第一激发 态中的三重态,T2即为第二激发态中的三重态,以此类推。 分子跃迁至各个激发态中,状态不稳定,随时会释放出能量,释放能量的类型有两种:一种是辐射跃迁,另一种是非辐射跃迁,释放能量会回到稳定的基态。

荧光探针在蛋白质研究中的应用

第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用 Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮 (中国科技大学化学系 合肥230026) 大学化学 摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白 质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。 一、 引言 荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离 子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ )等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。 二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征 1. 有机荧光探针的某些特征 最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3 N θH θθSO -3N H θ H 3C θθS O O Cl N H 3C CH 3 1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl 图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构 这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极 Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。

荧光探针的发展和应用

Supplementary materials for: Perylene diimide based “turn-on” fluorescence sensor for detection of Pd2+ in mixed aqueous media Hai-xia Wang a, b,*, Yue-he Lang a, Hui-xuan Wang a, Jing-jing Lou a, Hai-ming Guo a, b, Xi-you Li c,* a School of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Green Chemical Media and Reactions of Ministry of Education, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China b School of Environmental Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China email: hxwang5270@https://www.360docs.net/doc/af11556208.html, (H. Wang) c School of Chemistry an d Chemical Engineering, Shandong University, Jinan 250100, China email: xiyouli@https://www.360docs.net/doc/af11556208.html, (X. Li) Contents Page S1: Title of the paper, authors along with the contents. Page S2-S4: Copy of the 1H and 13C NMR spectra of PDI-1, PDI-2 and PDI-3. Page S5:Photophysical properties of PDI-1, PDI-2and PDI-3derivatives in different solvents at room temperature; Fluorescence spectra change of PDI-2and PDI-3 upon addition of different metal(8.0 equiv) ions; UV-vis spectra of PDI-1 (6.0 μM) in the presence of different metal ions (8.0 equiv). Page S6: Job’s plots in DMF/H2O (v/v, 7/1) and acetonitrile; Fluorescence spectra changes of PDI-1 (5.0 μM) in the presence of Pd2+in acetonitrile and chloroform;ESI mass spectra of PDI-1 in the presence of 1.0 equiv PdCl2 in CH3CN. Page S7: Job’s plots of PDI-1 (5.0 μM)in the presence of Pd2+in chloroform; Influence of pH on fluorescence intensity of PDI-1 (5.0 μM) in the absence and presence of 1.0 eq Pd2+; Benesi-Hildebrand analysis results.

时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的,自1978年提出以来[1],已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域,并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质,时间分辨荧光测定的原理,时间分辨荧光免疫分析技术,时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇,共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2,由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用,导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的,只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强,这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为例,其荧

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