细菌分离培养与鉴定程序

一、背景记录

1、猪的临床症状

2、不同猪的发病阶段（早、中、晚、解剖前宰杀还是解剖前已死亡）

3、解剖病变（保存好照片）

二、分离用培养基

1、常用培养基：鲜血琼脂培养基、巧克力培养基

2、非常用培养基：麦康凯培养基、沙门氏菌选择性培养基

三、病料的选取和保存

1、首选来自刚宰杀后的活畜禽或死后2-4小时内的畜禽

2、得到病料后应该立即进行细菌分离，分离细菌前最长保存时间（在4℃冰箱

内）最好不要超过3-4小时。分离细菌前应将病料保存在4℃冰箱不得放入-20℃冰箱。分离细菌后如需要根据细菌生长鉴定情况来决定病料用途（需再次接种、需再次触片、需接种动物等等）可先将病料暂存4℃冰箱，但不得超过2天。一般情况下分离细菌后应及时将需长期保存的少量病料分装到塑料瓶中进行记录保存，多余的病料进行无害化处理。

四、分离路线

1、选择分离细菌的目标脏器：

根据疑似疾病和病理变化确定，一般选病变比较严重的脏器做为分离细菌的目标脏器，并选择脏器的病健交界处做为细菌分离的最终部位。一头猪应该选择多个脏器或部位分离细菌。并对不同部位细菌在整个疾病中的作用有一定的评价，如：心血中的细菌多为全身感染分布的病原；关节、肠道、创口、及肺脏则可能只是局部分布的细菌。）

2、分离细菌

一般采用鲜血琼脂培养基划线培养、怀疑存在只能在巧克力培养基上且需要一定二氧化碳才能生长的细菌（如：副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌等）感染时、应同时采用巧克力培养基划线、放到烛缸进行培养。

划线时应该在做到无菌操作的前提下尽量取较大的一块组织或较多量的分泌物、先在培养基表面涂布一小片区域，然后弃去病料再用接种环从涂布区域开始进行划线。这样一方面可保证分离到病料中的细菌，另一方面也能保证长出单个菌落为进一步鉴定提供方便，同时也为评价病料中细菌含量及不同细菌数量比例的评价提供依据。

如果病料来自病程较长或死亡动物且细菌种类复杂、难以确定病原菌的情况下、可考虑分离细菌的同时取病料接种小鼠、再从小鼠分离细菌，二者互为参

考。

3、细菌的鉴定步骤

①生长特性及形态观察，②显微镜镜检，③PCR鉴定，④测序鉴定

一种细菌的鉴定并不一定都得经过以上4步鉴定，能确定细菌种类即可。

4、进行药物敏感性实验

5、细菌的保存

每一种细菌经鉴定后均应进行编号保存6管到-80℃冰箱，保存2管到-20℃冰箱。并及时记录到细菌档案中，鉴定清楚的菌种及时送交3-4管至余老师处。

6、细菌血清型的确定及致病性分析

有目的的选取分离到的细菌进行进一步实验。

五、每月进行一次病案讨论

细菌鉴定人员需进行全面的总结报告，总结报告内容包括：病料接收时间、地点、临床背景资料（免疫背景、流行情况、发病情况、死亡情况、畜主处理情况、效果），病变图片、该病料相关（该场的抗体检测结果、病原检测结果）的实验室诊断结果、最后处理（最后与畜主的联系及建议事宜）。细菌鉴定人员报告完毕后再由大家进行讨论分析。同时细菌鉴定人员应整理好病案讨论记录。

细菌分离鉴定工作值班表

注意事项：1、值班人员应该同颜老师联系，要求其有病料来时及时告知，便于进行记录采样。2、值班人员应注意及时订购培养基，不可出现有病料却没有培养基的情况。。

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心许银怀第一节概述志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容：细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据；缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍；志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大；洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化；目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。第二节病原学一、抗原分类志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你怎样运传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。实验十肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。一、大肠埃希菌大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。（一）形态与培养特性【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征培养基菌落特征普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色中国蓝平板呈蓝色伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽（二）生化反应【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。【结果】

细菌分离纯化及鉴定protocol

细菌分离纯化培养及鉴定protocol 样品菌株分离：准备工作 1用报纸将平板包好（约12个一包）灭菌后放入烘箱烘干，最好隔夜； 2按照培养基的配方配制好液体培养基后，调pH值（注意灭菌后培养基pH会略有升高），其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后，倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二，约一半左右；剩余液体培养基加入试管中，每支5ml（其中3ml用于保种，2ml用于提取菌株基因组DNA），用胶塞封好，与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌； 3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟，将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后，在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中，每块板中倒入约20ml，厚度约为培养皿的1/3~1/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内，待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的，可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称，标注日期，姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上，尽量把培养皿托平，将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全，待冷却后，在酒精灯下将液体涂布均匀（最好涂布至培养基将液体全部吸收）。 5将涂好的培养皿正置培养2小时后，用封口膜封好，倒置培养。

定时观察平板，描述菌落的颜色、形状，记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化： 1待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标出。 2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全，稍冷却后，在平板上进行Z字形三个方向划线。 3若在新板上又长出新菌落，再次分离划线 4划线需做至少2－3次，直至菌落完全纯化（纯化步骤很关键）保种： 1 将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内（注意要取单菌落），摇床150r/min， 28℃培养，直到其生长至指数期 2在2ml冻存管（预先灭菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油预先配置好灭菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，盖紧管盖，混匀后在管壁做好样品标记和日期，同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管，做好记录，放入冷存盒，放入－80度冰箱内，记录存放位置。 4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。 DNA的提取：可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行

病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。二、知识背景细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集（1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织（2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可

细菌分离及鉴定的实验方案

从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等相关培养基的配方:

1.1实验总流程 1土壤取样：

2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基

肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌得分离与鉴定一、实验目得（1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤（2）掌握平板划线分离法（3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义二、实验材料（1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程（1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。（2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。

（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。四、实验结果与分析（1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与

土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本科毕业论文（设计）题目：土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定学院：生物科学与工程学院姓名：学号：专业：生物工程年级：指导教师：职称：二0一一年五月

摘要目的：通过分离、筛选与纯化，从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。方法：根据解磷圈大小判断其解磷能力。从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌，通过平板法进行初筛，根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代，选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛，最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。结果：从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌，筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌，1号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.625，2号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.44，经过五代培养，将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天，然后进行解磷能力测定，测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L，菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L，具有较强解磷能力。结论：通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。关键词：果树根际土壤，解磷菌，无机磷，分离，鉴定

Abstract Objective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is, water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria. Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal

乳酸菌的分离纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。