应用薄层色谱_生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性

应用薄层色谱2生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性谷丽华1,2,吴　弢1,23,张紫佳2,侴桂新1,2,王峥涛1,23

(1.上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室,上海201203;

2.上海中药标准化研究中心,上海201203)

摘要:目的　采用薄层色谱2生物自显影法研究与评价中药的抗氧化活性。方法　用1,12二苯基222苦肼基自由

基乙醇溶液(1,12di phenyl222p icrylhydrazyl,DPPH)和传统显色剂显色,拍摄图像,采用模拟扫描,获得各抗氧化成分的

峰面积。结果　以总峰面积大小为指标判定不同来源中药的抗氧化能力,结果表明浙江天台产乌药(94340)、四川

凉山产厚朴(175647)和收集于上海的紫苏子(153206)清除DPPH自由基能力最强。以化学对照品峰面积与总峰

面积的百分比来判定化合物抗氧化活性,表明去甲异波尔定(4318%～6610%)、厚朴酚与和厚朴酚(7312%～9312%)、木犀草素与芹菜素及成分“U”(4716%～6810%)分别是乌药、厚朴和紫苏子的主要抗氧化活性成分。结论

本方法在中药抗氧化活性成分筛选及质量评价方面具有操作简便、选择性高、重现性好等优点。

关键词:薄层色谱2生物自显影;抗氧化活性;乌药;厚朴;紫苏子;DPPH

中图分类号:R917;R93 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2006)10-0956-07 Evaluati on of anti oxi dant acti vity of Radi x L i n derae and other two Chi n ese drugs usi n g T LC2bi oautography

G U L i2hua1,2,WU Tao1,23,ZHANG Zi2jia2,CHOU Gui2xin1,2,WANG Zheng2tao1,23

(1.Key L aboratory of S tandardization of Chinese M edicines,M inistry of Education,Institute of Chinese M ateria M edica,

Shanghai U niversity of T raditional Chinese M edicine,Shanghai201203,China;

2.Shanghai R&D Center for S tandardization of Traditional Chinese M edicines,Shanghai201203,China)

Abstract:A i m　To evaluate the anti oxidant capacity and quality of traditi onal Chinese medicines using T LC2bi oaut ography.M ethods　T wo chr omat ogra m s of each crude drug sa mp le were obtained,after devel op ing,by s p raying with1,12di phenyl222p icrylhydrazyl(DPPH)s oluti on in ethanol and classical stained reagents,separately.The i m ages s p rayed with DPPH s oluti on were cap tured under light after the

p lates were heated at40℃f or30m in,and scanned using video scan s oft w are t o get peak areas of active compounds.Results　T otal peak areas of the s pots on T LC were calculated t o evaluate the anti oxidant capacity of the tested crude drugs fr om different habitats and s ources.The results indicated that Radix

L inderae cultivated in Tiantai(Zhejiang p r ovince),Cortex Magnoliae Officinalis cultivated in L iangshan (Sichuan p r ovince),and Fructus Perillae acquired in Shanghai have the highest scavenging p r operties

t owards DPPH in their res pective T LC2aut ographic assays.Noris oboldine,magnol ol and honoki ol, luteolin,ap igenin and an unknown compound“U”p r oved t o be the maj or anti oxidant components in the corres ponding crude drugs as they contribute the dom inating peak areas t o the t otal ones.Conclusi on

T LC2bi oaut ography can not only be used f or screening of the components with anti oxidant potency but als o

f or the pur pose of quality evaluati on of traditi onal Chinese medicines at the sa me ti m e,and the method

p r oved t o be selective,si m p le and rep r oducible.

Key words:T LC2bi oaut ography;anti oxidant;Radix L inderae;CortexMagnoliae Officinalis;Fructus

收稿日期:2005212219.

基金项目:国家中医药管理局中医药科技重大项目(02代08);上海市重点学科建设项目资助(Y0301);上海市科委启明星项目资助(06QA14047).

3通讯作者　Tel:86-21-51322513,Fax:86-21-51322519,E2mail:wutao@shutc https://www.360docs.net/doc/a415926555.html,

Perillae;DPPH

自由基与许多病理和生理现象,如肿瘤、炎症、动脉粥样硬化及衰老等有关,故寻找阻断自由基反应的抗氧化物质具有重要意义。用于筛选抗氧化剂及评价其活性强弱的方法很多,有比色法[1]、荧光法[2]、电子自旋共振(ESR)法[3]、化学发光法[4]等,常以测定清除自由基能力[5,6]或人体自由基代谢酶类活性,如超氧化物歧化酶(S OD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH2px)等[7]为指标。

薄层色谱鉴别多直接观察荧光、荧光淬灭或采用化学显色剂来检查样品色谱与对照物质(对照品、对照提取物、对照药材)色谱之间斑点或谱带的异同,或利用薄层扫描法对特定斑点进行含量测定,并根据某成分的有无或含量高低判别待检中药质量的真伪优劣。这种方法具有快速、易操作等特点,成为中药质量控制的常用手段,但有一定的局限性。首先,薄层色谱上显色(或荧光)斑点的有无和强弱只能说明某成分的有无与含量的高低,不能反映其生物活性;其次,常用化学显色剂(如10%硫酸香草醛2硫酸等)多为通用显色剂,缺乏专属性。

薄层色谱2生物自显影技术结合了比色法(或荧光法)与色谱分离技术两者的优点,是一种集鉴定、分离和活性测定于一体的药物筛选方法。该方法不需要特殊的仪器设备,操作简单,实验耗费低,适合一般实验室操作。人们最早采用纸色谱2生物自显影技术[8]对抗菌药物进行筛选,而后发展到采用薄层色谱与生物显色剂联合用于食品、工业污染等微生物的测定以及各类天然抗菌成分的筛选[9],此外,在胆碱酶抑制剂[10,11]和抗氧化剂的筛选[12,13]等方面都得到广泛应用。1967年,Galvind等提出以1,12二苯基222苦肼基自由基(1,12di phenyl222 p icrylhydrazyl,DPPH)为显色剂,定量测定清除自由基活性的想法,而L i等[14]正式在第十届国际油菜籽会议上提出该方法,指出该方法与视频扫描技术联用可以用于油菜籽的抗氧化活性评价。

DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基,若被测物能清除它,则提示被测物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的有效浓度,打断脂质过氧化链反应的作用[15]。DPPH本身显紫色,具有清除DPPH自由基能力的物质能使其还原成DPPH2H而呈现黄色。目前,国内外广泛采用DPPH分光光度法筛选天然抗氧化剂。以DPPH乙醇液为显色剂的T LC2生物自显影技术筛选植物中的抗氧化活性成分国外也有报道,但多停留于对单体的筛选,用于中药抗氧化活性成分的筛选和质量评价研究尚未见报道。

乌药、厚朴和紫苏子均为《中国药典》(2005版一部)收载品种。乌药以乌药醚内酯为指标成分,但该成分药理活性的相关报道甚少,而且乌药醚内酯属脂溶性成分,传统的水煎法不易溶出。有研究显示乌药醇提取物具有明显的抗炎抗风湿作用[16,17],推测其活性成分可能为中等极性的生物碱类成分。厚朴以厚朴酚与和厚朴酚为指标成分。1998年以来,翁新楚等[18]对700余种中药和香辛料的抗氧化活性进行了大规模筛选,发现中药厚朴具有很强的抗氧化作用。保志鹃等[19]认为厚朴酚及和厚朴酚具有抑制细胞中产生的H

2

O2,O?-2,HO?及清除DPPH自由基作用。紫苏子尚没有建立质量评价指标,很多文献以不饱和脂肪酸为其指标成分,也有文献[20,21]报道紫苏子和炒紫苏子醇提物和水提物具有较强的清除自由基作用,并认为该活性成分可能是黄酮等酚类化合物。本文选此三味中药为研究对象,分别以去甲异波尔定、厚朴酚及和厚朴酚、木犀草素及芹菜素为对照成分,以DPPH自由基为显色剂,研究三味中药抗氧化活性成分的同时,探讨薄层色谱2生物自显影技术在中药质量评价方面的应用。并为同类中药的质量控制和药效评价标准提供参考依据。

材料与方法

试药及仪器　薄层色谱摄像系统(Rep r ostar3 and W in Cats4,瑞士CAMAG);薄层色谱视频扫描软

件(V ideo scan s oft w are,瑞士CAMAG)。硅胶GF

254预制板10c m×10c m(MN,德国);定量毛细管(D ru mmond,美国);自动点样仪(Aut osa mp ler3,瑞士CAMAG),加热板(T LC Plate Heater III,瑞士CAMAG),双槽展开缸(T win tr ough cha mber,瑞士CAMAG)。

去甲异波尔定(noris oboldine)、厚朴酚(magnol ol)、和厚朴酚(honoki ol)、木犀草素(luteolin)、芹菜素(ap igenin)对照品由上海中药标准化研究中心提供; 1,12二苯基222苦肼基自由基(1,12di phenyl222 p icrylhydrazyl,DPPH,Sig ma)。石油醚、甲醇均为分析纯。乌药、厚朴和紫苏子药材来源见表1～3,经

上海中医药大学中药研究所吴立宏博士鉴定,凭证

标本存放于上海中药标准化研究中心标本室。

样品制备与薄层色谱分析

乌药　取乌药粉末1g,加石油醚(沸程30～60℃)30mL,超声处理10m in,过滤,滤液弃去,药渣加甲醇30mL,超声处理30m in,过滤,滤液挥干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取去甲异波尔定对照品,加乙酸乙酯制成每1mL 含2mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2μL,分别点于同一硅胶GF

254

薄层板上,以氯仿2甲醇(6∶1)为展开剂,展开、取出、晾干。相同条件下制备两张薄层板备用。

厚朴　取厚朴粉末015g,加甲醇25mL,超声处理45m in,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇3mL使溶解,作为供试品溶液。另取厚朴酚与和厚朴酚对照品,分别加甲醇制成每1mL各含015mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述样品溶液1μL,对照品溶

液各3μL,分别点于同一硅胶GF

254

薄层板上,以甲苯2甲醇(20∶1)为展开剂,展开、取出、晾干。相同条件下做两张薄层板备用。

紫苏子　取紫苏子粉末2g,加甲醇30mL,超声处理30m in,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取木犀草素与芹菜素对照品,分别加甲醇制成每1mL含014mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述样品溶液3μL,对照品溶

液各215μL,分别点于同一硅胶GF

254

薄层板上,以正己烷2甲苯2乙酸乙酯2甲酸(2∶5∶215∶015)为展开剂,展开、取出、晾干。相同条件下做两张薄层板备用。

分别将一张乌药、厚朴与紫苏子展开后的薄层板喷以0104%DPPH乙醇溶液,于40℃下加热30 m in后在可见光下检识,拍摄照片(图1A,2A,3A),自动生成轮廓扫描图谱(图4),同时获得积分数据(表1,2,3),作为对照。将另一张乌药薄层板用碘蒸气熏,在可见光下检识;厚朴薄层板用1%香草醛的10%硫酸乙醇溶液显色,在105℃下加热至斑点清晰,在可见光下检识;紫苏子薄层板用1%三氯化铝乙醇溶液显色,在紫外灯(366nm)下检识。于检识时拍摄照片(图1B,2B,3B)。

抗氧化作用的评价　采用薄层色谱视频模拟扫描软件,通过测算各药材活性斑点总峰面积的大小,用以比较不同产地或批次的药材样品的抗氧化能力,总峰面积越大,抗氧化能力越强。以单个斑点的峰面积占总峰面积的百分率来评价该成分在相应药材中抗氧化的贡献,百分率越大,贡献越大。

结果

乌药的道地产区为浙江天台。从表1可见浙江天台产乌药的色谱峰积分总面积最高,说明其清除DPPH自由基能力最强,为天台乌药是道地药材提供了佐证。去甲异波尔定占各样品总峰面积的4318%～6610%。是乌药清除自由基活性的主要成分。

Table1　Data of peak area fr om five Radix L inderae sa mp les

No.Habitat Noris oboldine Total

Noris oboldine

/t otal(%) 1Quzhou,Zhejiang34425522006610

2Tiantai,Zhejiang41337943404318

3Changde,Hunan41355723455712

4Jixi,Anhui38600749025115

5Shexian,Anhui40337815974914从表2可见,5批厚朴样品中以四川凉山产厚朴色谱峰积分总面积最大,浙江产厚朴总面积最小,两者相差5倍以上。其中厚朴酚与和厚朴酚之和占各样品总面积的7312%～9312%。表明厚朴酚及和厚朴酚是厚朴中清除自由基活性的主要成分。

表3表明,5份紫苏子样品色谱峰积分总面积相差不大,说明该5份紫苏子清除自由基能力相当。其中木犀草素、芹菜素与未知成分“U”(图3)面积之和占总面积的4716%～6810%,是紫苏子药材清除自由基活性的主要成分之一。

Table2　Data of peak area fr om five Cortex Magnoliae Officinalis sa mp les

No.Habitat Magnol ol

(1)

Honoki ol

(2)

1+2Total

(1+2)/t otal

(%)

1Hubei47567688071163741358418517 2L iangshan,Sichuan51847767301285771756477312 3Huangshan,Anhui392221814157363738307717 4Dujiangyan,Sichuan29560654336102387229312 5Zhejiang23275356126836288939219

0104%DPPH in ethanol;B:Exposed t o i odine vapour.S:Noris oboldine;1-5:Extracts of sa mp les

F i gure2　T LC2bi oaut ographic and conventi onal chr omat ogra m s of CortexMagnoliae Officinalis.A:Sp rayed with a

0104%s oluti on of DPPH in ethanol;B:Sp rayed with a1%s oluti on of vanillin in sulfuric acid in ethanol(1→

10).S1:Magnol ol;S2:Honoki ol;1-5:Extracts of sa mp les

F i gure3　T LC2bi oaut ographic and conventi onal chr omat ogra m s of Fructus Perillae.A:Sp rayed with a s oluti on of 0104%DPPH in ethanol;B:Sp rayed with alu m inu m trichl oride TS.S1:Luteolin;S2:Ap igenin;U:Unknown

substance;1-5:Extracts of sa mp les

F i gure4　V ideo scanning p r ofiles of T LC2bi oaut ographic chr omat ogra m s.A:Radix L inderae(A2S:Noris oboldine reference,A21-5:Sa mp les);B:Cortex Magnoliae Officinalis(B2S:Magnol ol and Honoki ol,B21-5:

Sa mp les);C:Fructus Perillae(C2S:Luteolin and Ap igenin,C21-5:Sa mp les)

Table3　Data of peak area fr om five Fructus Perillae sa mp les

No.Habitat Character Luteolin

(1)

Ap igenin

(2)

U

(3)

1+2+3T otal

(1+2+3)/t otal

(%)

1Bozhou,Anhui W ild,S mall seed459461007443186992061459196810% 2Shanghai W ild,S mall seed462461106342062993711532066419% 3Guangzhou W ild,S mall seed21298558247803746831218906113% 4Nanning,Guangxi Cultivated,Large seed8010250056208667181300055113% 5Zhengzhou,Henan Cultivated,Large seed3732270548610550471156414716%

讨论

采用DPPH生物显色剂与常规的化学显色剂分别对乌药等三味中药的比较研究结果显示,T LC2生物自显影法既反映了中药指标性成分的有无,即实现了传统薄层鉴别目的,又反映了各指标性成分的活性强弱;既能发现中药中存在的具有抗氧化活性的其他化学成分,又能反映不同产地或来源药材的抗氧化活性强弱即质量优劣。能够同时达到中药活性筛选与品质评价两个目的。例如相同点样量,和厚朴酚清除DPPH自由基活性明显强于厚朴酚,木犀草素的活性明显强于芹菜素。又如本实验紫苏子以木犀草素和芹菜素为指标成分,野生品(小籽)(1～3号)的质量明显优于栽培品(大籽)(4～5号);以抗氧化活性为指标,则野生品、栽培品质量相当。但是大籽紫苏子脂肪酸含量明显高于小籽,提示仅以脂肪酸含量或单一指标成分评价紫苏子质量优劣不够全面。

常规抗氧化剂筛选方法ESR法、荧光法、分光光度法等技术在促进天然抗氧化剂的发展起到重要作用。但是这些方法常需要特殊的仪器或者无法消除样品中其他成分干扰等缺点。相比之下,薄层色谱2生物自显影法用于天然抗氧化成分的筛选及用于治疗由于自由基损伤所致疾病的中药分析与评价,具有操作简便、快速、样品用量少、准确性高等优点。此外,薄层色谱2生物自显影技术还可以与常规化学显色剂结合,能快速准确地确定中药的抗氧化成分的化学类型。如研究发现紫苏子薄层色谱R

f 值约为011左右的亮黄色斑点U(DPPH显色),是一个抗氧化能力很强的未知成分,通过预试,初步断定为酚类成分,具体结构有待于进一步分离鉴定。

中药成分复杂,其质量控制与评价方法一直是国际医学界关注的热点。目前,各种色谱、波谱以及计算机联用技术已经越来越多地应用于中药、天然药物的鉴别和质量控制,如以“单一”成分的含量测定和多成分的指纹图谱技术。不管是单一成分的测定还是“全息指纹”的分析,基本上还是基于单纯化学成分“量”的表征,均不能完全反映中药的内在质量。而薄层色谱-生物自显影技术将化学成分分离-活性评价有机结合,将中药指纹图谱中化学成分的变化与其生物活性联系起来,建立真正意义上的中药指纹图谱“谱效关系”,为中药的质量控制和药效评价标准提供科学依据[22]。当然,以不同抗氧化机制和其他生理活性为指标的薄层色谱2生物自显影方法的建立还有待于进一步研究与开发。

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