第十章维生素的分析测定

第十章维生素的分析测定

第一节概述

一、食品中的维生素及分类

维生素亦名维他命，是维持人体生命活动必须的一类微量天然有机化合物。维生素在体内的含量虽少，但不可或缺。虽然各种维生素的化学结构以及性质不同，但它们却有着下列共同的特点：

维生素或其前体化合物（维生素原）都存在于天然食物中。

一般在体内不能合成，或者合成量太少而不能满足机体的需求，也不能充分贮存在组织里，必须经常通过食物供给。

维生素在体内不提供能量，不参与机体组织的构成，主要参与机体代谢的调节。

它们参与维持机体正常的生理功能，日常需求量极少，通常以毫克（mg）或微克（ug）计算，当机体缺乏时，将会表现出不同的缺乏症。许多维生素是辅基或辅酶的组成部分。

近年来的研究表明，一些维生素的作用不仅仅限于预防维生素的缺乏病，在预防多种慢性退化性疾病方面也发挥着不可忽视的营养保健作用。

维生素的种类繁多，而且这些有机物的结构也很复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于胺类，有的属于醛类，有的属于醇类，还有的属于酚或醌类化合物等。目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。由于它们的化学结构和生理功能差异很大，无法按照结构或功能分类。一般按维生素溶解性能将它们分成两大类：一类是能溶于脂肪，叫脂溶性维生素（如A、D、E、K）；另一类是能溶解于水，叫水溶性维生素，目前主要有维生素C和维生素B族（如B1、B2、B6、C、H、B12等）。有些物质在化学结构上类似于某种维生素，经过简单的代谢反应即可转变成维生素，此类物质称为维生素原。

脂溶性维生素均不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、苯及氯仿等脂溶性有机溶剂和脂肪中，因此命名为脂溶性维生素。通常在食物中与脂类共存，进入消化道后，一定要有脂肪作为载体存在，并经胆汁乳化，人体才能吸收，吸收进血液以后，也要和某种蛋白质结合，才能运转到全身。可见脂溶性维生素在机体内的吸收与机体对脂肪的吸收密切相关，且被吸收后大部分积存在体内，若脂溶性维生素摄入过多，可引起中毒。

水溶性维生素易溶于水，而不溶于脂肪及脂溶剂。水溶性维生素经血液吸收过量时，多余部分会碎尿液排出，体内贮存极少，一般无毒，一旦及大量摄入，可对机体产生不良影响。

相比之下，水溶性维生素直接可被肠道细胞吸收，吸收过程快，且排泄快，不易出现中毒现象。

类维生素:

类黄酮，胆碱，肌醇，肉碱等

测定维生素的意义

食品各种维生素的含量主要取决于食品的类别，另外与食品的加工工艺及贮存等条件有关，由于大多数维生素对光、热、氧、PH敏感，若加工条件不合理或贮存不当都会造成维生素的丢失。为保证人体因缺乏维生素而引起疾病，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒；开发利用富含维生素的食品资源；研究维生素在食品建工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的加工工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素，所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。

维生素的检验方法有化学法、仪器法、微生物法和生物图鉴法。其中紫外可见分光光度法、荧光光度法，这两种是多种维生素的标准分析方法。灵敏、快速，有较好的选择性。另外，各种色谱法以其高分离效能，在维生素分析方面占有重要的地位。在现有这些维生素中，人体比较容易缺乏而在营养上又较重要的维生素有：A、D、C 、E、B1、B2、B6、B5。因此，在这一章节中主要介绍食品中维生素A、维生素D、维生素B1、维生素B2、维生素C、β-胡萝卜素的检测方法。

第二节脂溶性维生素的测定

维生素A、D、E与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。

脂溶性维生素具有以下理化性质：

1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂

2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸

3．耐热、耐氧化性

耐热性氧化性

V A 好，能经受煮沸易被氧化（光、热促进其氧化）

VD 好，能经受煮沸不易被氧化

VE 好，能经受煮沸在空气中能慢慢被氧化（光、热、碱促进其氧化）

根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常先皂化样品，再水洗去除类脂物然后使用有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)，浓缩提取物，最后溶于适当的溶剂来进行结果测定。

在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。

一．食品中维生素A测定(GB/T5009.82—2003)

维生素A是一种不饱和的一元醇类，属脂溶性维生素。由于人体或哺乳动物缺乏维生素A时易出现干眼病，故又称为抗干眼醇。已知维生素A有A1和A2两种，A1存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又称为视黄醇，天然维生素A主要以此形式存在。A2主要存在于淡水鱼的肝脏中。维生素A1是一种脂溶性淡黄色片状结晶，熔点64℃，维生素A2熔点17～19℃，通常为金黄色油状物。许多植物如胡萝卜、番茄、绿叶蔬菜、玉米含类胡萝卜素物质，如α、β、γ-胡萝卜素、隐黄质、叶黄素等。其中有些类胡萝卜素具有与

维生素A1相同的环结构，在体内可转变为维生素A，故称为维生素A原,β-胡萝卜素含有两个维生素A1的环结构，转换率最高。

其化学结构式如下：

（一）高效液相色谱法

说明：按《食品中维生素A和维生素E的测定》(GB/T5009.82—2003)编写，有关维生素E的测定内容。

1.原理

试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。

2.试剂

?无水硫酸钠；

?抗坏血酸溶液（100g/L）：临用前配制；

?氢氧化钾溶液（1+1）；

?氢氧化钠溶液（100g/L）；

?硝酸银溶液（50g/L）；

?无水乙醚：不含有过氧化物；

过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用；

去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。

?无水乙醇：不得含有醛类物质；

检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛；

脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L 乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。

?甲醇：重蒸后使用；

?重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏；

?银氨溶液：加氨水至硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解；

⑴维生素A标准液：视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度；

⑵维生素E标准液：α-生育酚（纯度95%），γ-生育酚（纯度95%），δ-生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度；

⑶内标溶液：称取苯并[e]芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10μg苯并[e]芘的内标溶液；

⑷pH1～14试纸。

3. 仪器与设备

?实验室常用设备；

?高压液相色谱仪带紫外分光检测器；

?旋转蒸发器；

?高速离心机，配有小离心管，具塑料盖1.5mL～3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）；

?高纯氮气；

?恒温水浴锅；

?紫外分光光度计。

4. 分析步骤

?试样处理

皂化

称取1g～10g试样（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg）于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL10%抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。加10mL氢氧化钾（1＋1），混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。

提取

将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。

洗涤

用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。

浓缩

将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250mL～300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。

将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000r / min）。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容，并记下体积比。

?标准曲线的制备

维生素A标准浓度的标定：取维生素A标准液各若干微升，稀释至3.00ml乙醇中，并按给定波长测定各维生素的吸光值。用此吸光系数计算出该维生素的浓度。

测定条件如表10-1所示

液相色谱的测定条件表10-1

标准加入标准的量V/μL 比吸光系数E1%1cm 波长λ/nm

视黄醇10.00 1835 325

α—生育酚100.0 71 294

γ—生育酚100.0 92.8 298

δ—生育酚100.0 91.2 298

浓度计算公式：

式中ρ－维生素浓度，g/mL；

A－维生素的平均紫外吸收值；

V－加入标准溶液的量，μL；

E－某种维生素1%比吸光系数；

3.00/(v×10-3)－标准液稀释倍数。

标准曲线的制备

本方法采用内标定法定量。把一定量的维生素A、α—生育酚、γ—生育酚、δ—生育酚及内标苯并[e]芘液混合均匀。选择合适的灵敏度，使上述物质的各高峰约为满量程70%为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点（其内标苯并[e]芘的浓度值不变），用此种浓度的混合标准液进行色谱分析，结果见色谱图（图10-1）。维生素标准曲线绘制式维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标、维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用两点内标法进行定量。

色谱图片

?高效液相色谱分析

预柱: ultrasphere ODS 10μm, 4mm×4.5cm；

分析柱:ultrasphere ODS 5μm, 4.6mm×25cm；

流动相:甲醇:水＝98:2 混匀,于临用前脱气；

紫外检测器波长：300nm。量程0.02；

进样量：20μL ；

流速：1.7mL/min。

?试样分析

取试样浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。

定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。

定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，此比值在标准曲线上查得起含量。或用回归方程求出其含量。

5. 结果计算

式中X－某种维生素含量，mg/100g；

ρ－由标准曲线上查到某种维生素含量，g/mL；

V－式样浓缩定容体积，mL；

m－试样质量，g（计算结果表示到三位有效数字）。

本方法测量结果在重复性条件下获得的两次独立测量结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

6. 说明及注意事项

（1）高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离、同时测定维生素A和维生素E。最小检出量分别为V A：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。

（2）维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。

（3）在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。

（4）提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。

（5）洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。

（6）无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。

（7）在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。

（8）用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。

（二）三氯化锑比色法

1．原理

在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑可相互作用，生成蓝色可溶性配合物，其颜色深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质在一定时间内可用分光光度计测定其吸光度（于620nm波长处有最大吸收峰），从标准曲线中求得试样提取液中维生素A含量，再计算试样中维生素A的含量。

2．试剂

?无水硫酸钠：不吸附维生素A；

?乙酸酐；

?无水乙醚：不含过氧化物；

?无水乙醇：不含醛类物质；

?三氯甲烷：不含分解物

检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水少许摇振，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。

处理方法：试剂应先测验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏。

?250g／L三氯化锑一三氯甲烷溶液

三氯化锑－三氯甲烷溶液（250g/L）：用三氯甲烷配制三氯化锑溶液，将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中，振摇，使之溶解，再加无水硫酸钠10g，用时取上清液。

?500g/L 1：1氢氧化钾溶液（50%）；

?0.5mol／L氢氧化钾溶液；

?维生素A标准溶液

视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为每毫升维生素A标准溶液相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。

维生素A标准溶液浓度的标定：取维生素A标准溶液10.00μL，用乙醇稀释成3.00mL，临用前用紫外分光光度法测定维生素A的吸光度，计算出维生素的浓度。

酚酞指示剂（10g/L）：用95%乙醇配制。

3．仪器和设备

?实验室常用设备

?分光光度计

?回流冷凝装置

4．操作步骤

?样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法

皂化法:适用于维生素A含量不高的样品(可减少脂溶性物质的干扰,但费时,维生素A易损失)

皂化

称取0.5～5g经组织捣碎机捣碎或充分混匀的样品于三角瓶中，加入10mL（1：1）氢氧化钾及20～40mL乙醇，于电热板上回流30min。加入10mL水，稍稍振荡，若无浑浊现象，表示皂化完全。

提取

将皂化瓶内混合物移至分液漏斗，以30mL水分两次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中（如有渣子用脱脂棉滤入分液漏斗）。再用50mL乙醚分两次洗皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇2min并注意放气，提取不皂化部分。静置分层后，水层放入第二个分液漏斗中。皂化瓶再用30mL乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗。振摇后，静置分层，水层放入第三分液漏斗中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至醚层不再使三氯化锑一三氯甲烷溶液呈蓝色为止。

洗涤

用30mL水加入第一个分液漏斗中，轻摇，静置片刻，放去水层，加15～20mL0.5mol/L 氢氧化钾溶液于分液漏斗中，轻摇后，弃去下层碱液（除去醚溶性酸皂）。再用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止。醚层液静置10～20min，小心放出析出的水。

浓缩

将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠2次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，收回乙醚。直到瓶中剩约5mL时取下，用减压抽气法至干，立即准确加入一定量的三氯甲烷（5mL），使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内（3～5μg/mL）。

研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定（步骤简单，结果准确）

研磨

精确称取2～5g样品，放入盛有3～5倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。

提取

小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50～100mL乙醚，紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中，使其自行澄清（或离心澄清）。

浓缩

取澄清乙醚液2～5mL，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽气蒸干，立即加入1mL 三氯甲烷溶解残渣。

?标准曲线的绘制

准确取一定量的维生素Ａ标准液于5～6个容量瓶中（0.0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL），以三氯甲烷配制标准系列使用液。再取相同数量3cm比色管顺次取标准系列使用液各１mL，各管加入乙酸酐1滴制成标准比色系列。于620nm波长处，以10mL三氯甲烷加1滴乙酸酐调节吸光度至零点，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入９mL三氯化锑－三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度(每支比色管都在临测前加入显色剂)，以维生素A为横坐标，吸光度为纵坐标绘出标准曲线图。

?样品测定

于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1mL 三氯甲烷，其余比色管中分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐其余步骤按标准曲线的制备。分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素A的含量。

5．结果计算

式中X—样品中维生素Ａ的含量, mg/100g（若按国际单位，每国际单位相当于０.3μg 维生素Ａ即1IU=0.3μg维生素A）；

ρ—由标准曲线上查得样品溶液中含维生素Ａ的含量，μg／mL；

ρ0—由标准曲线上查得样品空白溶液中含维生素Ａ的含量，μg／mL；

m—样品质量，g；

V—提取后加三氯甲烷定量之体积，mL;

100/1000—将样品中维生素A由μg／g换算成mg／100g的换算系数。

6．说明及注意事项

①乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。

②所用氯仿中不应有水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫升氯仿中加一滴乙酸酐，以保证脱水。

③三氯化锑腐蚀性强，不能粘在手上；由于三氯化锑遇水产生沉淀，因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。

④由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s后便开始比色，因此要求反映在比色管中进行，产生蓝色后立即读取吸光度。

（三）紫外分光光度法

1．原理

维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。

2. 试剂

维生素A标准溶液等试剂同三氯化锑比色法；异丙醇。

3. 仪器

紫外分光光度计。

4. 操作步骤

?样品处理

按照三氯化锑比色进行。

?标准曲线绘制

分别取维生素A标准溶液（10IU/mL）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于棕色瓶中，用异丙醇定容。以空白液调仪器零点，用紫外分光光度计在325nm波长下分别测定吸光度，绘制标准曲线。

?样品经皂化、提取、洗涤、浓缩后，迅速用异丙醇溶解并移入50mL容量瓶中，用异丙醇定容，于紫外分光光度计325nm处测定其吸光度，从标准曲线上查出相当的维生素A的含量。

5. 结果计算

式中X—维生素A含量，IU/100g；

c—由标准曲线查得的维生素A含量，IU/mL；

V—样品的异丙醇溶液体积，mL；

m—样品质量，g。

6. 说明

本法的最低检测限为5μg／g,。由于许多伴随物对325nm的紫外光均有吸收，故在测定前必须对样品进行分离纯化处理。

二、维生素D的测定(三氯化锑比色法，AOAC方法)

维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，具有维生素D活性的化合物约有10种，其中最重要的是D2和D3及维生素D。原植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体

内都存在。植物中的麦角醇为维生素D2原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化醇；人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素D3原，在紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化醇。以D3为最重要。维生素D2 药片吃多了中毒。

分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。是AOAC选定的正式方法。

维生素D的结构

(一)三氯化锑比色法

1．原理

在三氧甲烷中，维生素D与三氯化锑生成橙黄色化合物，并在500 nm波长处有最大吸收，呈色强度与维生素D的含量成正比。

2．试剂

①氯仿、乙醚、乙醇，同三氧化锑比色法测定维生素A。

②三氯化锑一氯仿溶液

用三氯甲烷配制三氯化锑溶液，将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中，振摇，使之溶解，再加无水硫酸钠10g，用时取上清液。

③三氧化锑一氯仿一乙酰氯溶液：取上述三氯化锑一氯仿溶液，加入其体积3％的乙酰氯，摇匀。

④石油醚：沸程30~60℃，重蒸馏。

⑤维生素D标准溶液：称取0.2500 g维生素D，用氯仿稀释至100 mL，此溶液浓度为2.5 mg/mL，临用时，用氯仿配制成0.025~2.5μg／mL的标准使用液。

⑥聚乙二醇(PEG)600。

⑦白色硅藻土：Celite545(柱层析载体)。

⑧无水硫酸钠。

⑨0.5mol/L氧氧化钾溶液。

⑩中性氧化铝：层析用，100~200目。在550℃高温电炉中活化5.5 h，降温至300℃左右取出装瓶。冷却后，每100 g氧化铝中加入水4 mL，用力振摇，使无块状，瓶口密封后贮存于干燥器内，16 h后使用。

3．仪器

①分光光度计。

②层析柱：内径2.2cm，具活塞，砂芯板。

③实验室常用仪器。

4．操作步骤

?样品的处理：皂化和提取同维生素A的测定。如果样品中有维生素A共存时，必须进行纯化、分离维生素A。

纯化

分离柱的制备

在内径为22 mm具活塞和砂芯板的玻璃层析柱中先加1～2 g无水硫酸钠，铺平整，此为第一层。第二层，称取15 g Celite 545置于250 mL碘价瓶中，加入80 mL石油醚，振摇2 min，再加入10 mL聚乙二醇600，剧烈振摇10 min使其黏合均匀。将上述黏合物加到玻璃层析柱内。第三层，黏合物上面加人5 g中性氧化铝。第四层，再加2～4 g无水硫酸钠。轻轻转动层析柱，使柱内的黏合物高度(第二层)保持在12 cm左右。

纯化

柱装填后，先用30 mL左右的石油醚进行淋洗，然后将样品提取液倒人柱内，再用石油醚淋洗，弃去最初收集的10mL，再用200 mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗液的流速

保持在2～3 mL/min。将淋洗液移人500 mL分液漏斗中，每次加入100~150 mL水用力振摇，洗涤三次，弃去水层(水洗主要是去除残留的聚乙二醇，以免与三氧化锑作用形成浑浊，影响测定)。将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水，移入锥形瓶或脂肪烧瓶中，在水浴上浓缩至约5 mL在水浴上用水泵减压至恰干，立即加入5mL氯仿，加塞摇匀备用。

?测定

标准曲线的绘制

准确吸取维生素D标准使用液(浓度视样品中维生素D含量高低而定)0.0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于6个10mL容量瓶中，用氯仿定容，摇匀。分别吸取上述标准溶液各1mL于1 cm比色皿中，置于分光光度计的比色槽内，立即加入三氧化锑一氯仿一乙酰氯溶液3 mL，以0管调零，在500 nm波长下于2 min内测定吸光度值，绘制标准曲线。

②样品的测定

吸取上述已纯化的样品溶液l mL于1 cm比色皿中，以下操作同标准曲线的绘制。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出其相应的含量。

5．计算

式中X－样品中维生素D的含量，mg/100g；

ρ－标准曲线上查得样品溶液中维生素D的含量，μg／mL（如按国际单位，每1IU相当于0.025μg维生素D）；

V－样品提取氯仿定容之体积，mL；

m－样品质量，g。

6．说明

①测定中加入乙酰氯可以消除温度、湿度等于扰因素的影响。

②食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇等成分的含量往往大大超过维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此测定前须经柱层析除去这些干扰成分。

③本法测定的是维生索D2、维生素D3的总量

（二）高效液相色谱法

1．原理

试样经皂化后，用苯提取不皂化物，馏去苯后，使用第一阶段的分取型HPLC（反相C18柱），分取维生素D组分，以去除大部分干扰物质。得到的维生素D组分，用于第二阶段分析型HPLC（正相色谱），得样品色谱图，与按同样操作条件得到的维生素D标准品的色谱图比较进行定量。

2．试剂

①10%焦性没食子酸一乙醇溶液。

②90％KOH溶液。

③1 mol/LKOH溶液。

④无醛乙醇。

⑤苯：特级。

⑥正己烷。

⑦乙腈。

⑧异丙醇。

⑨甲醇：色谱纯。

⑩维生素D标准溶液：称取0.2500 g维生素I)2，用乙醇稀释至100 mL，此溶液浓度

为2·5 mg。mL叫(相当于100 000 IU·mL一’)。临用时，用乙醇配制成0．1肛g．mL 一’(相当于4 IU·mL叫)的标准使用液。

3．仪器

①高效液相色谱仪，附紫外检测器。

②馏分收集器。

③实验室常用设备仪器。

4．色谱条件

?第一阶段(分取用)

色谱柱：反相柱Nucleosil 5 C18，7.5×300 mm。

流动相：乙腈：甲醇=1：1。

流速：2.0 mL／min。

紫外检测器：波长254 nm。

?第二阶器(分析用)

色谱柱：正相柱Zorbax SIL，4.5x250 mm。

流动相：0.4 %异丙酮的己烷溶液。

流速：1.6 mL／min。

紫外检测器：波长254 nm。

5．测定步骤

?样品的皂化及不皂化物的提取

称取粉碎的样品1～10 g(维生素D含量在2 IU下)置于皂化瓶中，ImA 40 mL 10 9／6焦性没食子酸一乙醇溶液及10 mL 90％KOH溶液，装上回流装置，在沸水浴上皂化30 min，然后用流动冷水冷却至室温，准确加入100 mL苯，塞上瓶塞，激烈振混15 min，然后移入200~250 mI．分液漏斗中(如有沉淀物就留在烧瓶中，此时不需要用苯洗皂化瓶)，加入1mol/L KOH溶液50 mL，振混后静置，弃去水层。再加0.5 mol/LKOH溶液50 mL，振混后静置，弃去水层。再每次用50 mL水洗涤苯层数次。直至用酚酞检验时洗液不呈碱性为止。分液漏斗静止几分钟，直至最后一滴水分离，弃去水。

?维生素D的分取

准确吸取上述苯溶液80 mL于圆底烧瓶内，在40℃以下的温度减压蒸去苯，所得残留物中准确加入5 mL正己烷使之溶解，取4.5 mL置于10 mL具塞试管内，减压蒸去溶剂，残留物中准确加入乙腈一甲醇(1：1)溶液500弘L使之溶解。准确吸取该溶液200uL，注入分取用色谱柱中。事先用标准维生素D确定其溶出位置，用馏分收集器收集维生素D组分(本实验色谱条件下维生素D保留时间大约为17~18min，收集其16~19 min溶出的组分)。

?维生素D的定量

减压蒸馏维生素D组分中的溶剂，残留物溶解在200弘L的0.4％异丙酮正己烷溶液中，取其中100弘L注入分析用色谱柱中，得样品色谱图。取维生素D标准液1 mL，按上述操作，得标准维生素D色谱图。

6．计算

7．说明

①分取的维生素D应在半日内更换柱子后测定，如超过半日应封入惰性气体冷冻保存、再改换柱子测定。本法对维生素D。和D。不加区别，两者混合存在时，以总维生素D定量。

②水洗苯提取的不皂化物时，为防止因形成胶粒而在水中损失，用1 mol/LKOH溶液、

0.5 mol/L KOH溶液及水洗，使碱的浓度逐渐降低。

维生素的活性以维生素D。为参考标准，1ug维生素D3—40 IU(国际单位维生素)D3。

三、β-胡萝卜素的测定(纸色谱法，GB/T5009.83—2003)

胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，但以胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。它有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有β一紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，其中以β—胡萝卜素效价最高。

胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。

胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取β一胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。

β—胡萝卜素的结构

纸色谱法

1. 原理

试样经过皂化后，用石油醚提取果品制品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。

2. 试剂

试剂除特别标明外，均为分析纯。

3.1 无水硫酸钠；

3.2 氢氧化钾溶液（1+1）：称取50g氢氧化钾溶于50mL水中；

3.3 无水乙醇：不得含有醛类物质；

3.4 石油醚：沸程30℃～60℃，又作展开剂；

3.5 β-胡萝卜素标准溶液：

3.5.1 β-胡萝卜素标准贮备液：准确称取50.0mgβ-胡萝卜素标准品，溶于100.0mL三氯甲烷中，浓度约为500μg/mL，准确测其浓度。标定浓度的方法如下：

取标准贮备液10.0μL，加正己烷3.00mL混匀，测其吸光度，比色杯厚度为1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。

中华人民共和国国家标准