SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAGE电泳标准操作流程
SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAGE电泳标准操作规程

1、目的

建立SDS-PAGE电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行,保证电泳的安全性、有效性。

2.范围与职责

适用SDS-PAGE电泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施负责,QA检查员、生产主管负责监督。

3.程序:

3.1. 制胶

3.1.1组装胶架

将洁净、无水的玻片对齐,形成空腔,插入塑料框的凹槽

中,注意箭头向上,并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧,

下端紧贴密封条。

3.1.2 分离胶的配置

3.1.2.1 10%分离胶配方如下表:

3.1.2.2 灌胶

混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃

板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。

3.1.2.3液封

在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气,使胶

面平整。静置约30min观察胶面变化,当看到水与凝固的

胶面有折射率不同的界限时,表明胶已完全凝固,倒掉上

层水,并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置

3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表:

3.1.3.2插入制胶梳

混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内

(分离胶上方),轻轻加入样品模板梳,小心避免气泡的出现。

约30分钟,聚合完全。

3.2. 电泳

3.2.1 安装电泳槽

将制备好的凝胶板取下,小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分

别插到U形橡胶框的两边凹形槽中,可往上提起使凝胶板紧贴

橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上,其下缘

与贮槽框下缘对齐,放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓

冲液。

3.2.2 样品处理

对于蛋白样品直接取80μl的样品,依次加上20μl 5x buffer (加了B-巯基乙醇),混匀。对于菌体或组织等固体样品,取少

量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3 加样

用移液枪取处理过的样品溶液10μl,小心地依次加入到各凝

胶凹形样品槽内,marker 加入到其中一个槽内,为区别两块板,marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4 电泳

将电泳槽放置电泳仪上,接通电源,正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时,关电源,把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶

把电泳槽取出,两块板拿下来,用刮片从长短玻片中间翘起,再把浓缩胶刮掉,取下。

3.3. 染色

放于加有R250染色液的染色皿中,染液漫过胶即可,置于摇床

上,转速约为45r/min,时间约1小时,完成后染液倒掉并用

水洗掉染液。

3.4.脱色

取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里,脱色液漫过胶即可,置于摇床上,转速约为45r/min,时间约1小时,本底色脱净,条带清晰可见即可,完成后倒掉脱色液。

3.5.拍照

将脱色后的胶置于透明文件夹中,把胶上面的气泡赶出(用前也可用酒精棉球擦干净文件夹),放到扫描仪上,拍照。

4. 注意事项

4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD

选用10%胶;50KD-30KD选用12%胶;30KD-10KD选用15%胶。

4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头

或清洗吸头后再点另一个样品。

4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时,倒胶后常漏出胶液,那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧,留有空隙,所以这步要特别留心操作。

4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。

4.5 电泳缓冲液可重复利用,如果胶上出现不正常痕迹,就要及时更换新液。

4.6 分离胶高度控制得当,确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。

4.7 电泳染色液注意进行回收再利用,一般可重复使用2-3次。

4.8 AP和TEMED是催化剂,加入的量要合适,过少则凝胶聚合很

慢甚至不聚合,过多则聚合过快,影响倒胶。

5.异常情况处理:

操作过程中设备发生不正常或故障时,应及时告知负责人,及时处理。

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