微生物工程 - 02

工业微生物菌种

一、常用的工业微生物（industrial microbe）

1.微生物工业对菌种的要求

菌种（strain/spawn）：微生物工业发酵所用的微生物。

例如：发酵生产碱性蛋白酶的生产菌种——地衣芽孢杆菌。

用于大规模发酵生产的菌种应该符合以下基本要求：

（1）生长繁殖能力强，在较短的发酵周期内即可产生大量有价值的发酵产物。Grow fast

（2）发酵培养基应价格低廉、来源充足、被转化为产品的效率高。Cheap medium （3）发酵副产物少，产品相对容易分离。Less by-products

（4）培养条件易于控制，并具有抗噬菌体感染的能力。Good controllability

（5）遗传特性稳定，不易变异和退化。Stable hereditary feature

（6）对人、动植物和环境不应造成危害。Harmless / environmentally friendly

2.常用的工业微生物菌种

微生物通常是指用肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括病毒（viruses）、真细菌（bacteria）、古细菌（archeobacteria）、真菌（fungi）、原生动物（protozoan）和某些显微藻类（algae）。

微生物的特点：个体微小、结构简单，代谢能力强，繁殖速度快，适应能力强、易变异，种类多、分布广等。

（1）细菌（bacteria）

细菌是一类细胞细而短、结构简单、细胞壁坚韧、主要以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。按其基本形态可分为球菌、杆菌和螺旋菌。

根据革兰氏染色法可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

细菌细胞的构造可分为一般构造和特殊构造。一般构造包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、核糖体、间体、内含物等；特殊构造主要有鞭毛、菌毛、性菌毛、糖被和芽孢等。

革兰阳性菌：芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）等

革兰阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、醋杆菌属（Acetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）等

（2）放线菌（actinomycete）

放线菌是具有菌丝、以孢子繁殖、革兰染色阳性的一类原核微生物。根据菌丝的形态与功能不同，分为基内菌丝、气生菌丝与孢子丝。

如：链霉菌属（Streptomyces）、诺卡菌属（Nocardia）、小单孢菌属（Micromonospora）、链孢囊菌属（Streptosporangium）等

（3）酵母菌（yeast）

酵母菌是一群属于真菌的单细胞微生物。

如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、卡尔斯伯酵母、异常汉逊酵母、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）等

（4）霉菌（mould）

也称丝状真菌，是真菌的一部分。其菌丝有2类：一类无横膈膜，如根霉、毛霉、犁头霉等；另一类有横膈膜，如青霉、曲霉等。

霉菌可进行无性繁殖和有性繁殖，产生无性孢子和有性孢子。无性孢子有孢囊孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子；有性孢子有卵孢子、接合孢子、子囊孢子等。

发酵工业中常用的霉菌如下：

毛霉属（Mucor）常用于豆腐乳生产；

根霉属（Rhizopus）常用来发酵豆类和谷类食品；

曲霉属（Aspergillus）黑曲霉是酶制剂发酵工业上应用最广泛的微生物菌种之一，也是目前工业发酵生产柠檬酸的主要菌种；

红曲霉属（Monascus）红曲可用于酿酒、制醋、做豆腐乳的着色剂和调味剂，也可做中药；

青霉素（Penicillium）产黄青霉（P. chrysogenum）是青霉素最重要的生产菌；

木霉属（Trichoderma）绿色木霉和康氏木霉是纤维素酶的主要生产菌

二、工业微生物菌种的选育（selection and breeding）

1.菌种的分离（Spawn Isolation）和筛选（Strain Screening）

发酵工业获得生产菌株的途径主要有：（1）从自然界分离筛选；（2）向菌种保藏中心、各实验室索取或购置菌株，从中筛选；（3）直接购置专利菌种或向生产单位购置优良生产菌种。

菌株的分离筛选一般可分为采样、富集、分离、筛选。

（1）采样（sampling）

采样是指从自然界中采集含有目的菌的样品。

土壤中含细菌数量最多，放线菌次之。

要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地点去采样。

●根据不同的土壤特点和气候条件确定采样地点。采土样最好的土层是5-25cm。秋

季采土样较理想。采土样的方法：P14第2段。

●根据微生物营养类型和生理特点确定采样地点。枯枝落叶烂木头——纤维素酶产

生菌；饭店肉类加工厂——蛋白酶和脂肪酶产生菌；糕点面粉加工厂——淀粉酶

产生菌；蜂蜜甜果植物汁——酵母菌；腐烂果蔬果园土——果胶酶产生菌；温泉

堆肥火山灰——高温菌；

●在局部环境和极端环境条件下采样。日本人发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌可

以生产EPA（二十碳五烯酸，是一种人体必需脂肪酸）和DHA（二十二碳六烯酸）。

极端环境微生物（extreme environmental microorganism），简称嗜极菌

（extremophiles），包括嗜冷、嗜热、嗜酸、嗜碱和嗜压微生物等。

（2）富集（enrichment culture）

富集培养的定义：是指在目的微生物含量较少时，根据其特点，制定特定条件，使其迅速生长、数量增加，以利于后续分离。

●控制营养成分。淀粉（葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨不合适）为唯一碳源——产淀粉

酶的微生物

●控制培养条件。通过热处理较易分离到产芽孢的细菌（将样品稀释经80℃水浴处

理10min左右）。

●使用抑制剂。青霉素——抑制细菌和放线菌；放线酮——抑制酵母菌和霉菌。

（3）分离（isolation）

把目的菌从样品中分离出来，有时无需富集也能直接进行分离。

●常规分离法。倾注平板分离法、涂布平板分离法、平板划线分离法（最为常用）

和组织分离法

●平皿生化反应分离法。利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的

方法。分离培养基根据目的菌特殊的生理特性或代谢产物来设计。如：

（4）筛选（screening ）

● 初筛。以定性为主，淘汰多数无用的微生物。平板筛选法。

● 复筛。精确检测产量水平。摇瓶振荡培养。

2.诱变育种（mutation breeding ）

人工育种的方法主要包括诱变育种mutation breeding 、杂交育种cross breeding 、原生质体融合Protoplast Fusion 、基因工程genetic engineering 等。

诱变育种方法的优点是简单、投资少、收获大，缺点是缺乏定向性。

诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择、菌悬液的制备、诱变剂的选择、诱变剂处理方式、突变株的分离与筛选。

（1） 出发菌株的选择original/stating strain

应挑选对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。

用作诱变育种的出发菌株常从以下3类菌株中选取：

● 自然界新分离的野生型菌株；

● 生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株；

● 每次诱变处理都有一定提高的菌株。

（2） 单细胞菌悬液的制备bacterial suspension

目的是为了使出发菌株细胞均匀地接触诱变剂。

菌悬液的制备应注意以下几点：

● 新培养的细胞，生理状态同步，处于旺盛的对数期；

● 菌悬液细胞处于良好的分散状态；

● 菌悬液的浓度要适当；

● 选择合适的介质（生理盐水或缓冲液）。

（3） 诱变剂及其剂量的选择mutagen

诱变剂主要是指某些能引起生物细胞DNA 结构改变的物理或化学因子，其作用是提高变异频率、扩大变异幅度、改变产量。

常用的诱变剂见P20表2-1。

近期研究发现，较低剂量比较容易出现正突变菌株。

（4） 诱变剂处理方式treatment method

单一诱变剂处理——复合诱变剂处理

单一诱变剂处理可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使得筛选工作趋向简单化。缺点是突变率比复合诱变剂处理要低，突变类型较少。

复合诱变剂处理容易得到更多的突变类型，能导致较大的突变。

（5） 突变株的分离与筛选isolation and screening

微生物通过诱变处理，群体中产生各种类型的突变体，有正突变型、负突变型和稳定型。

抗性突变株或营养缺陷型突变株，常用选择培养基进行筛选。

高产突变株的筛选较难。

平皿生化反应分离法

目的微生物 分离培养基 透明圈法

淀粉酶产生菌 淀粉+碘液 变色圈法

果胶酶产生菌 果胶+0.2%刚果红溶液 抑菌圈法

抗生素产生菌 工具菌：抗生素敏感菌 生长圈法 氨基酸、核苷酸和维生

素等的产生菌 工具菌：某生长因子的营养缺陷型菌株

总的来说，诱变育种已取得了显著的效果，比如：青霉素在1943年开始生产时发酵效价仅为20U/ml，目前已超过8.5×104U/ml；谷氨酸产生菌经紫外诱变处理，产率提高了31%。