Chromatin Immunoprecipitation Kit
EZ ChIP? KIT COMPONENTS
A．提供的试剂盒成分（注意储存温度）
保存于4℃：
蛋白G琼脂糖/鲑鱼精DNA，Catalog#16-201c. 每瓶含1.5ml有600μg声波处理的鲑鱼精DNA,1.5mgBSA和约4.5mg重组蛋白G的密封微球. 以50%凝胶浆形式提供，每瓶终体积3ml.悬浮于TE buffer中，pH 8.0，含0.05%叠氮化钠.液体悬浮液.
ChIP稀释缓冲液，Catalog # 20-153. 每瓶含24ml 0.01%SDS，1.1% TritonX-100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1,167mM NaCl.
低盐免疫复合物漂洗缓冲液，Catalog # 20-154. 每瓶含24ml 0.1%SDS，1%Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.
高盐免疫复合物漂洗缓冲液，Catalog # 20-155. 每瓶含24ml 0.1%SDS，1%Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.
LiCl免疫复合物漂洗缓冲液，Catalog# 20-156. 每瓶包含24ml 0.25M LiCl, 1% IGEPAL-CA630, 1% 脱氧胆酸(钠盐), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.
TE Buffer, Catalog # 20-157. 两瓶,每瓶含24ml 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0.
0.5M EDTA, Catalog # 20-158.每瓶含250μl 0.5M EDTA, pH 8.0.
5M NaCl, Catalog # 20-159. 每瓶含500μl 5M NaCl.
SDS裂解液, Catalog # 20-163. 每瓶含10ml 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris, pH 8.1.
1M Tris-HCl, pH 6.5, Catalog # 20-160. 每瓶含500μl 1M Tris-HCl, pH 6.5.
10X 甘氨酸, Catalog # 20-282. 每瓶含11ml 1.25M Glycine.
10X PBS, Catalog # 20-281. 每瓶含24ml 10X PBS.
保存于-20℃：
蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ，Catalog # 20-283. 两瓶，每瓶含110μl 200X 蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ于DMSO中.
RNase A, Catalog # 20-297. 每瓶含600μg RNase A于60μl无菌水中.
蛋白酶K，Catalog # 20-298. 每瓶含600μg 蛋白酶K于60μl 50mM Tris-HCl中, pH 8.0, 10mM CaCl2.
1M NaHCO3, Catalog # 20-296. 每瓶含600μl 1M NaHCO3.
10X PCR Buffer, Catalog # 20-295. 每瓶含200μl 750mM Tris-HCl, pH 8.8, 200mM
(NH4)2SO4, 0.1% Tween○R-20, 25mM MgCl2.
参照引物, Catalog # 22-004. 每瓶含75μl5μM的人类GAPDH基因特异性引物.
FOR: 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’
REV: 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'
反义RNA 聚合酶II, clone CTD4H8, Catalog # 05-623B. 每瓶含25μg反义RNA 聚合酶II, clone CTD448.
Normal Mouse IgG, Catalog # 12-371B. 每瓶含25μg normal mouse IgG.
室温存放：
20% SDS, Catalog # 20-280. 每瓶含242μl 20% SDS.
离心过滤柱，Catalog # 20-290. 每袋有22个装在收集管中的离心过滤柱.
收集管，Catalog # 20-291. 每袋22个收集管.
结合剂A，Catalog # 20-292. 每瓶含25ml 结合剂A.
漂洗剂B，Catalog # 20-293. 每瓶含12.5ml 洗涤试剂B
洗脱剂C，Catalog # 20-294. 每瓶含1.5ml 洗脱剂C.
B. 不提供的材料
试剂
●实验所需刺激或处理过的细胞●染色质免疫沉淀所需抗体
●37%甲醛
●Taq DNA 聚合酶
●dNTPs, 每个2.5mM
●无DNase 和RNase的无菌水设备
●漩涡振荡器
●转轮/转台？
●计时器
●不同体积的枪和枪头●离心机
●可变温水浴
●细胞刮棒
●超声波发生器
● 1.5ml离心管
●实施定量仪
●0.2ml PCR管
●过滤嘴枪头
IV. CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION PROTOCOL A．体内交联与裂解
开始这部分之前：
●如需要，刺激或处理哺乳动物粘附细胞在含10ml培养基的100mm培养皿中贴壁生长
汇合至80-90%的状态.
对HeLa细胞来说，约为2 x 107 个细胞.这可产生可用于10次独立的免疫共沉淀的染色质.
包括一个额外的仅用于估计细胞数目的培养皿.
●取冰用于PBS保温（见步骤3）和培养皿的保温（见步骤6）
●每个培养皿准备21ml 1×PBS（2.1ml10×PBS+18.9ml H2O)，置于冰上.用于漂洗并
需保持冰冷.
●SDS裂解缓冲液热至室温以保证SDS在继续裂解细胞之前处于溶解状态.
●移开蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ并于室温下融化，用于步骤3和13. 此物含DMSO，在
18.4℃以下为凝结状态.
1． 10ml培养基中加入270ul 37%甲醛（或540ul新配制的18.5%甲醛）用于交联，温和地转动培养皿使其混合.
●终浓度为1%.
●使用高质量的甲醛.如果甲醛过期请勿使用.每次使用前配制新鲜甲醛，见附录B.
2．室温下孵育10min.
●不需搅动细胞.
3．同时，吸取1ml冷的1×PBS至单独的管中，加入5ul蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ(每个皿1m l ×1PBS).
4．每个皿加入1ml 10×Glycine以抑制未反应的甲醛.
5．转动混匀，室温孵育5min.
6．将培养皿置于冰上.
7．吸取培养基，尽可能将培养基除去，注意不要搅动细胞.
8．加入10ml冷的1×PBS漂洗细胞.
9．除去PBS，重复PBS漂洗，步骤8,9.
10．往培养皿中加入10ml含1×蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ的1×PBS（步骤3中配制）.
11．将每个培养皿中的细胞刮下置于离心管中.
12．4℃下700 x g（这个转速要怎么算？？依据离心力？？G=mrw2=700 x g？？已经混乱了...）
离心2-5min使细胞成颗粒状? （这翻译真纠结…..）
13．离心的同时，将5ul 蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ加入每份1ml SDS裂解缓冲液.
本实验方案推荐每2 x 107个HeLa细胞使用1ml SDS裂解缓冲液.依据不同细胞浓度调整，裂解液与细胞密度的比例对细胞完全裂解是很重要的.
14．除去上清.（细胞可在这一步冻存于-80℃.）
15．在含1×蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ的1ml SDS裂解缓冲液中，重悬细胞.
16．每个离心管分装300-400ul.（裂解产物可冻存于-80℃.）
17．如果已确定声波降解的最优条件，继续Section B.若没有，参阅附录A.
蛋白质复性方法
包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体： 包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，具有很高的密度（约ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以
蛋白的变性和复性备课讲稿
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性 变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的. 蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制. 变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。 引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。 蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面： （一）生物活性丧失
蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。 （二）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。 （三）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 复性：如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。如果变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低, 一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
电气原理图设计方法及实例分析
电气原理图设计方法及实例分析 【摘要】本文主要对电气原理图绘制的要求、原则以及设计方法进行了说明，并通过实例对设计方法进行了分析。 【关键词】电气原理图；设计方法；实例 继电-接触器控制系统是由按钮、继电器等低压控制电器组成的控制系统，可以实现对 电力拖动系统的起动、调速等动作的控制和保护，以满足生产工艺对拖动控制的要求。继电-接触器控制系统具有电路简单、维修方便等许多优点，多年来在各种生产机械的电气控制 中获得广泛的应用。由于生产机械的种类繁多，所要求的控制系统也是千变万化、多种多样的。但无论是比较简单的，还是很复杂的控制系统，都是由一些基本环节组合而成。因此本节着重阐明组成这些控制系统的基本规律和典型电路环节。这样，再结合具体的生产工艺要求，就不难掌握控制系统的分析和设计方法。 一、绘制电气原理图的基本要求 电气控制系统是由许多电气元件按照一定要求连接而成，从而实现对某种设备的电气自动控制。为了便于对控制系统进行设计、研究分析、安装调试、使用和维修，需要将电气控制系统中各电气元件及其相互连接关系用国家规定的统一图形符号、文字符号以图的形式表示出来。这种图就是电气控制系统图，其形式主要有电气原理图和电气安装图两种。 安装图是按照电器实际位置和实际接线电路，用给定的符号画出来的，这种电路图便于安装。电气原理图是根据电气设备的工作原理绘制而成，具有结构简单、层次分明、便于研究和分析电路的工作原理等优点。绘制电气原理图应按GB4728-85、GBTl59-87等规定的标 准绘制。如果采用上述标准中未规定的图形符号时，必须加以说明。当标准中给出几种形式时，选择符号应遵循以下原则： ①应尽可能采用优选形式； ②在满足需要的前提下，应尽量采用最简单形式； ③在同一图号的图中使用同一种形式。 根据简单清晰的原则，原理图采用电气元件展开的形式绘制。它包括所有电气元件的导电部件和接线端点，但并不按照电气元件的实际位置来绘制，也不反映电气元件的大小。由于电气原理图具有结构简单、层次分明、适于研究等优点，所以无论在设计部门还是生产现场都得到广泛应用。 控制电路绘制的原则： ①原理图一般分主电路、控制电路、信号电路、照明电路及保护电路等。 ②图中所有电器触头，都按没有通电和外力作用时的开闭状态（常态）画出。 ③无论主电路还是辅助电路，各元件应按动作顺序从上到下、从左到右依次排列。 ④为了突出或区分某些电路、功能等，导线符号、连接线等可采用粗细不同的线条来表示。 ⑤原理图中各电气元件和部件在控制电路中的位置，应根据便于阅读的原则安排。同一电气元件的各个部件可以不画在一起，但必须采用同一文字符号标明。 ⑥原理图中有直接电联系的交叉导线连接点，用实心圆点表示；可拆卸或测试点用空心圆点表示；无直接电联系的交叉点则不画圆点。 ⑦对非电气控制和人工操作的电器，必须在原理图上用相应的图形符号表示其操作方式。 ⑧对于电气控制有关的机、液、气等装置，应用符号绘出简图，以表示其关系。 二、分析设计法及实例设计分析 根据生产工艺要求，利用各种典型的电路环节，直接设计控制电路。这种设计方法比较简单，但要求设计人员必须熟悉大量的控制电路，掌握多种典型电路的设计资料，同时具有丰富的设计经验，在设计过程中往往还要经过多次反复地修改、试验，才能使电路符合设计
重组蛋白包含体的复性
重组蛋白包含体的复性 [摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。 [关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成 Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins. Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond 大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。 包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。 1. 蛋白质的体内折叠 细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键)[1]。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。 近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。 重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环境－－真核细胞。蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有
蛋白质、包涵体复性
目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性
一、
二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
电力电气图基础知识
电力电气图基础知识 电气图纸一般可分为A、B两类： A：电力电气图，它主要是表述电能的传输、分配和转换，如电网电气图、电厂电气控制图等。 B：电子电气图，它主要表述电子信息的传递、处理；如电视机电气原理图。 电力电气图分一次回路图、二次回路图。 一次回路图也叫一次系统图，是表示一次电气设备(主设备)连接顺序的电气图。 电力的生产、输送和分配、使用需要大量各种类型的电气设备。比如变压器、断路器、互感器、隔离开关等直接参加电能的发、输、配主系统的设备，这就是一次设备。这些设备连接在一起所形成的电路叫一次回路，它们之间的连接称之为一次接线或主接线。、 二次回路图是表示二次设备之间连接顺序的电气图。 为了确保主系统安全可靠、持续稳定地运行，加装继电保护、安全自动装置以及监控、测量、调节和保护等装置，以向用户提提供充足的、合格的电能，这就是二次设备。比如各种测量仪器、仪表、控制、信号器件及自动装置等。这些设备根据特定的要求连接在一起所形成的电路叫二次回路，也称之为二次接线，二次回路依电源及用途可分为电流回路、电压回路、操作回路、信号回路。 一次系统图：（系统原理图） 用比较简单的符号或带有文字的方框，简单明了地表示电路系统的最基本结构和组成，直观表述电路中最基本的构成单元和主要特征及相互间关系的电路图。 二次原理图：（电路原理图） 二次原理图又分为集中式、展开式两种。集中式电路图中各元器件等均以整体形式
集中画出，说明元件的结构原理和工作原理。识读时需清楚了解图中继电器相关线圈、触点属于什么回路，在什么情况下动作，动作后各相关部分触点发生什么样变化。 展开式电路图在表明各元件、继电器动作原理、动作顺序方面，较集中式电路图有其独特的优点。展开式电路图按元件的线圈、触点划分为各自独立的交流电流、交流电压、直流信号等回路．凡属于同一元件或继电器的电流、电压线圈及触点采用相同的文字。展开式电路图中对每个独立回路，交流按U、V、W相序；直流按继电器动作顺序依次排列。识读展开式电路图时，对照每一回路右侧的文字说明，先交流后直流，由上而下，由左至右逐行识读。集中式、展开式电路图互相补充、互相对照来识读更易理解。 二次接线图（也叫安装接线图或工厂化图纸） 二次接线图是以电路原理为依据绘制而成，是现场维修中不可缺少的重要资料。安装图中各元件图形、位置及相互间连接关系与元件的实际形状、实际安装位置及实际连接关系相一致。图中连接关系采用相对标号法来表示。 1．学习掌握一定的电子、电工技术基本知识，了解各类电气设备的性能、工作原理，并清楚有关触点动作前后状态的变化关系。 2．对常用常见的典型电路，如过流、欠压、过负荷、控制、信号电路的工作原理和动作顺序有一定的了解。 3．熟悉国家统一规定的电力设备的图形符号、文字符号、数字符号、回路编号规定通则及相关的国标。了解常见常用的外围电气图形符号、文字符号、数字符号、回路编号及国际电工委员会(IEC)规定的通用符号和物理量符号。 4．了解绘制二次回路图的基本方法。电气图中一次回路用粗实线，二次回路用细实线画出。一次回路画在图纸左侧，二次回路画在图纸右侧。由上而下先画交流回路，
蛋白质变复性
变复性的过程 E.coli 中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。 生产研究中为了得到较高的目的蛋白的表达量，通常会采用较强的启动子(如λPL 、T7 或串联启动子) ,使外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10 %～50 %. 然而胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 .绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式, 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作, 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。 包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH 值、离子强度、温度等) 都可导致包涵体的形成. 包涵体形成原因 1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。 3. 重组蛋白所处的环境，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。 蛋白复性的必要性 细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。复性过程是变性蛋白的重折叠过程。 对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠（即变性溶解) ,然后采用合适的复性方法促进变性，蛋白再折叠进而恢复活性. 一．包涵体的分离纯化 ①含包涵体的宿主菌细胞的破碎； ②将破碎液离心除去可溶蛋白（9000r 15min 4℃），获得包涵体； ③洗涤包涵体,以除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤，温和去垢剂TritonX-100等洗涤包涵体,然后离心（12000r 5min 4℃）取上清洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白。
绘制层次电路原理图讲解
《电路CAD 》课程实验报告 实验名称绘制层次电路原理图实验序号实验二姓名张伟杰系专业电科班级一班学号201342203 实验日期5月5日指导教师曹艳艳组名第一组成绩 一、实验目的和要求 1 掌握层次原理图的绘制方法。 2 理解层次原理图模块化的设计方法。 二、实验设备 计算机、Altium Designer 10 三、实验过程（步骤、程序等） 1 新建工程项目文件 1）单击菜单File/New/PCB Project，新建工程项目文件。 2）单击菜单File/Save Project保存工程文件，并命名为“洗衣机控制电路.PrjPCB”。 2 绘制上层原理图 1）“在洗衣机控制电路.PrjPCB”工程文件中，单击菜单File/New/Schematic，新建原理图文件。 2）单击菜单File/Save As..，将新建的原理图文件保存为“洗衣机控制电路.SchDoc” 3) 单击菜单Place/Sheet Symbol或单击“Wring”工具栏中的按钮，如图1所示，依次放置复位晶振模块，CPU模块，显示模块，控制模块四个模块电路，并修改其属性，放置后如图2所示
图1 模块电路属性 图2 放置四个模块电路 4）单击菜单P1ace/Add sheet Entry或单击“Wring”工具栏的按钮，放置模块电路端口，并修改其属性，完成后效果如图3所示 图3 放置模块电路端口
5）连线。根据各方块电路电气连接关系，用导线将端口连接起来，如图4所示 图4 连线 3 创建并绘制下层原理图 1)在上层原理图中，单击菜单Design/Create Sheet From Symbol，此时鼠标变为十字形。 2)将十字光标移到“复位晶振模块”电路上，单击鼠标左键，系统自动创建下层原理图“复位晶振模块.SchDoc”及相对应的I/O端口。如图5所示。 图5 自动生成的I/0端口 4）绘制“复位晶振模块”电路原理图。 其用到的元件如下表1所示。绘制完成后的效果如图6所示。 表1 “复位晶振模块”电路元件列表 元件标号元件名所在元件库元件标示值元件封装R1 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 270ΩAXIAL0.4 R2 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 C1 Cap Miscellaneous Devices.IntLib 33pF RAD-0.3 C2 Cap Miscellaneous Devices.IntLib 33pF RAD-0.3 C3 Cap Miscellaneous Devices.IntLib 33pF RAD-0.3 S1 SW-PB Miscellaneous Devices.IntLib SPST-2 Y1 XTAL Miscellaneous Devices.IntLib R38 VCC 电源工具栏 GND 电源工具栏
蛋白质变性机理
蛋白质变性机理 1、蛋白质介绍 2、蛋白质变性结果 1)活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。 2）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来, 分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低 蛋白质分子凝聚从溶液中析出
3）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 4）致变因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。 反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。蛋白质的变性很复杂，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视是物理变化 加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质生成，因此是物理变化。 否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。而我们知道，熟鸡蛋依然有营养价值，其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收。 5）复性
如何看懂电气图
如何看懂电气图【工控老鬼转载】 1．详看图纸说明 拿到图纸后，首先要仔细阅读图纸的主标题栏和有关说明，如图纸目录、技术说明、电器元件明细表、施工说明书等，结合已有的电工知识，对该电气图的类型、性质、作用有一个明确的认识，从整体上理解图纸的概况和所要表述的重点。 2．看概略图和框图 由于概略图和框图只是概略表示系统或分系统的基本组成、相互关系及其主要特征，因此紧接着就要详细看电路图，才能搞清它们的工作原理。概略图和框图多采用单线图，只有某些380／220V低压配电系统概略图才部分地采用多线图表示。
3．看电路图是看图的重点和难点 电路图是电气图的核心，也是内容最丰富、最难读懂的电气图纸。 看电路图首先要看有哪些图形符号和文字符号，了解电路图各组成部分的作用、分清主电路和辅助电路，交流回路和直流回路。其次，按照先看主电路，再看辅助电路的顺序进行看图。 看主电路时，通常要从下往上看，即先从用电设备开始，经控制电器元件，顺次往电源端看。看辅助电路时，则自上而下、从左至右看，即先看主电源，再顺次看各条支路，分析各条支路电器元件的工作情况及其对主电路的控制关系，注意电气与机械机构的连接关系。 通过看主电路，要搞清负载是怎样取得电源的，电源线都经过哪些电器元件到达负载和为什么要通过这些电器元件。通过看辅助电路，则应搞清辅助电路的构成，各电器元件之间的相互联系和控制关系及其动作情况等。同时还要了解辅助电路和主电路之间的相互关系，进而搞清楚整个电路的工作原理和来龙去脉。 4．电路图与接线图对照起来看 接线图和电路图互相对照看图，可帮助看清楚接线图。读接线图时，要根据端子标志、回路标号从电源端顺次查下去，搞清楚线路走向和电路的连接方法，搞清每条支路是怎样通过各个电器元件构成闭合回路的。 配电盘(屏)内、外电路相互连接必须通过接线端子板。一般来说，配电盘内有几号线，端子板上就有几号线的接点，外部电路的几号线只要在端子板的同号接点上接出即可。因此，看接线图时，要把配电盘(屏)内、外的电路走向搞清楚，就必须注意搞清端子板的接线情况。 二、看电气控制电路图的方法 看电气控制电路图一般方法是先看主电路，再看辅助电路，并用辅助电路的回路去研究主电路的控制程序。 1．看主电路的步骤 第一步：看清主电路中用电设备。用电设备指消耗电能的用电器具或电气设备，
绘制层次电路原理图
《电路CAD 》课程实验报告 按钮，如图
图2 放置四个模块电路 ）单击菜单P1ace/Add sheet Entry或单击“Wring”工具栏的按钮，放置模块电路端口，并修改其属性，完成后效果如图3所示 图3 放置模块电路端口
图4 连线 创建并绘制下层原理图 在上层原理图中，单击菜单Design/Create Sheet From Symbol，此时鼠标变为十字形。 将十字光标移到“复位晶振模块”电路上，单击鼠标左键，系统自动创建下层原理图“复.SchDoc”及相对应的I/O端口。如图5所示。 自动生成的I/0 晶振模块”电路原理图。 所示。绘制完成后的效果如图 晶振模块”电路元件列表 所在元件库
图7 DS80C310-MCL元件搜索图8 CPU电路模块 表3 显示模块电路元件列表 元件标号元件名所在元件库元件值元件封装 Miscellaneous Devices.IntLib LEDDIP-10
R3 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R4 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R5 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R6 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R7 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R8 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R9 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 R10 RES2 Miscellaneous Devices.IntLib 1k AXIAL0.4 VCC 电源工具栏 图10 控制电路模块
绘制电气原理图时一般要遵循以下基本规则
绘制电气原理图时一般要遵循以下基本规则： (1) 为了区别主电路与控制电路，在绘线路图时主电路(电机、电器及连接线等)，用粗线表示，而控制电路(电器及连接线等) 用细线表示。通常习惯将主电路放在线路图的左边(或上部)，而将控制电路放在右边(或下部)。 (2) 动力电路、控制电路和信号电路应分别绘出： 动力电路——电源电路绘水平线；受电的动力设备（如电动机等）及其它保护电器支路，应垂直电源电路画出。 控制和信号电路——应垂直地绘于两条水平电源线之间，耗能元件（如线圈、电磁铁，信号灯等）应直接连接在接地或下方的水 平电源线上，控制触头连接在上方水平线与耗能元件之间。 (3) 在原理图中各个电器并不按照它实际的布置情况绘在线路上，而是采用同一电器的各部件分别绘在它们完成作用的地 方。 (4) 为区别控制线路中各电器的类型和作用，每个电器及它们的部件用一定的图形符号表示，且给每个电器有一个文字符号， 属于同一个电器的各个部件(如接触器的线圈和触头)都用同一个文字符号表示。而作用相同的电器都用一定的数字序号表示。 (5) 因为各个电器在不同的工作阶段分别作不同的动作，触点时闭时开，而在原理图内只能表示一种情况，因此，规定所有 电器的触点均表示正常位置，即各种电器在线圈没有通电或机械尚未动作时的位置。如对于接触器和电磁式继电器为电磁铁未 吸上的位置，对于行程开关、按钮等则为未压合的位置。 (6) 为了查线方便。在原理图中两条以上导线的电气连接处要打一圆点，且每个接点要标一个编号，编号的原则是：靠近左 边电源线的用单数标注，靠近右边电源线的用双数标注，通常都是以电器的线圈或电阻作为单、双数的分界线，故电器的线圈 或电阻应尽量放在各行的—边（左边或右边）。 (7) 对具有循环运动的机构，应给出工作循环图，万能转换开关和行程开关应绘出动作程序和动作位置。 (8) 原理图应标出下列数据或说明： 1）各电源电路的电压值，极性或频率及相数。 2）某些元器件的特性（如电阻，电容器的参数值等）； 3）不常用的电器（如位置传感器，手动触头，电磁阀门或气动阀，定时器等）的操作方法和功能。 6.5.1 电气工程制图内容 电气原理图是根据电路工作原理，它采用规定的图形符号合文字符号，具有结构简单、层次分明、便于研究合分析电路的工作原理等优点，在电气设计合现场维护中都得到了广泛的应用。原理图、元件布置图、互联图 6.5.2 电气工程制图图形符号 电气图用图形符号是按照功能组合图的原则，由一般符号、符号要素或一般符号加限定符号组合成为特定的图形符号及方框符号等。一般符号是用以表示一类产品和此类产品的特征的简单图形符号。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项 蛋白前期准备 （1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。 （2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。（3）透析Buffer的选择可参考文献。 蛋白复性 包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。 包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。 如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。 包涵体的洗涤 破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。 超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装 40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。 包涵体的溶解
包涵体的复性
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。 一、包涵体： 1.1包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 1.2包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2] 1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解 1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3] 1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性 变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的. 蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制. 变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。 蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面： （一）生物活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。（二）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。 （三）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白
重组蛋白的表达
重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的