vero细胞生产流感疫苗
疫苗生产用Vero细胞的控制
加强疫苗生产用Vero细胞的控制 洪小栩李琦涵 摘要：目前，传统病毒性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系、二倍体细胞系和传代细胞系。近年来，Vero细胞作为连续细胞系在我国越来越多地用于人用疫苗的生产。由于Vero细胞具有污染内源性或外源性感染因子以及细胞残留蛋白和DNA 具有潜在致瘤性和致癌性的风险，因此， Vero细胞系作为疫苗生产用细胞基质的安全问题备受关注，加强生产用Vero细胞库的管理和控制；优化疫苗生产工艺，提高对细胞残余蛋白和DNA的去除能力；执行严格的残留量限定标准，对保证Vero细胞生产疫苗的安全性具有重要意义。 关键词： Vero细胞、病毒性疫苗、致瘤性、致癌性 Strengthening the Control on the Vero Cell Used for the Production of Viral Vaccines Hong Xiaoxu Li Qihan Abstract: At present, the major cell substrates used for the traditional production of viral vaccines including the primary cell lines, diploid cell lines and continuous cell lines. The safety of the Vero cell strain is the main concerned on the potential risks of the endogenous and exogenous virus contamination, as well as the tumorigenicity and oncogenicity properties induced by the residual cellular protein and DNA. As this result, it will play very important role on improving the safety of viral vaccines by strengthening the management and control of the Vero cell bank, improving the production process, enhancing the ability of the removing the residual cellular protein and DNA, and carrying out the strict limit standard. Key words: Vero cell, viral vaccine，tumorgenicity, oncogenicity 作者单位：100060.北京. 国家药典委员会（洪小栩）；650118 昆明，中国医学科学院医学生物学研究所（李琦涵） 通信作者：洪小栩， Email： hongxiaoxu@https://www.360docs.net/doc/bd6977396.html,
病毒及其疫苗的生产制备技术.doc
第25章病毒及其疫苗的生产制备技术 第一节病毒的生产制备 病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。 一、病毒生产的目的和用途 1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。 4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。 5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。 二、病毒生产制备的方法 1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。 3、细胞培养法（详见第二篇第18章） 不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。 以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。 第二节病毒疫苗的生产制备 病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗 摘要 动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。 传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。 研究背景 动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。 流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示，每年有5%～15%的人会感染季节性流感，重症病例达三百万至五百万。 抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前，获准用于流感病毒感染治疗的四种药物：金刚胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制；扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂，可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒，但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点，面对大范围长时间的流感大流行，药物往往也无能为力。
Vero细胞在WAVE反应器中的微载体球转球放大
Vero细胞在WAVE反应器中的微载体球转球放大陆丽芳，Christain Kaisermayer, 姚钰舜，隋礼丽 通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，上海 概要 Vero细胞能被广泛应用于疫苗的生产。Vero细胞的培养技术能否成功放大对于该技术能否大规模应用于疫苗生产至关重要。作为贴壁细胞，我们的经验证明Vero细胞能够成功地用微载体技术在WAVE反应器中生长。为了进一步寻求放大培养的可能性，我们在WAVE反应器中进行了细胞从微载体Cytodex 1上的球转球实验。一系列的实验都相当成功。Vero细胞首先在10 L的培养袋中用Cytodex 1微载体培养到一定密度，生长在微载体上的细胞随后用胰蛋白酶消化，经消化后基本脱离微载体的细胞最终和旧的微载体根据一定的传代密度转移到新的微载体培养体系中并开始新一轮细胞培养。我们的结果显示，几次这样的转移传代前后，细胞的生长速度基本一致。Vero细胞的微载体培养技术在WAVE反应器中放大完全可能。进一步的实验显示，在现有的工作条件下，Vero细胞在Cytodex上的培养以及球转球工艺可以达到10倍的放大倍率。这为基于细胞培养的疫苗大规模工业化生产新前景提供了可靠的支持。 概要 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·1前言 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·2方法 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·2 WAVETM 反应器中Vero细胞的培养 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 2 在瓶子内进行球转球实验 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 2 在WAVETM培养袋内进行球转球实验 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3结果 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·3 各次球转球实验情形· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3 球转球前后细胞生长曲线· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·4 球转球前后细胞在微载体上的生长形态· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 4讨论· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8结论· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8参考文章· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 9 陆丽芳博士：通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，科学家
疫苗生产企业
我国目前大型疫苗生产企业33家，主要生产品种达49种，可以预防26种传染病。其中，用于预防乙肝、脊髓灰质炎、麻疹、百日咳、白喉、破伤风等儿科常见病的疫苗产量达5亿人份。 国内主要疫苗品种及生产企业： 一、疫苗名称生产企业 1、细菌性、类毒素 注射卡介苗成都所、上海所 无细胞百白破疫苗兰州所 吸附无细胞百白破联合疫苗武汉所、长春所、成都所、GSK 吸附百日咳、白喉、破伤风联合疫苗武汉所、成都所、上海所 口服痢疾双价活疫苗兰州所 吸附破伤风疫苗长春所、天坛生物、上海所 钩端螺旋体疫苗上海所、武汉所 破伤风疫苗武汉所、成都所、上海所、长春所 百日咳疫苗兰州所 吸附白喉疫苗兰州所、上海所 吸附百日咳白喉联合疫苗兰州所 白喉破伤风二联疫苗上海所、武汉所、天坛生物 白喉破伤风类毒素兰州所 2、减毒 冻干甲型肝炎减毒活疫苗长春所、浙江普康、医科院昆明所 口服轮状病毒减活疫苗兰州所
口服福氏、宋内氏痢疾双价活疫苗兰州所 麻疹减毒活疫苗兰州所、上海所、武汉所、天坛生物 风疹减毒活疫苗兰州所、上海所、天坛生物 乙型脑炎减毒活疫苗兰州所 腮腺炎减毒活疫苗兰州所、上海所、武汉所、浙江卫信 麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗上海所、武汉所 麻疹风疹联合减毒活疫苗天坛生物 麻腮风联合减毒活疫苗天坛生物、GSK 水痘减毒活疫苗上海所、长春所、GSK 皮上划痕人用炭疽活疫苗兰州所 皮上划痕人用布氏菌活疫苗兰州所 皮上划痕用鼠疫活疫苗兰州所 脊髓灰质炎减毒活疫苗天坛生物、医科院昆明所 乙脑减毒活疫苗兰州所、成都所、武汉所 黄热减毒活疫苗天坛生物 3、灭活 Ⅰ型肾综合征出血热纯化疫苗兰州所、上海所 双价肾综合征出血热灭活疫苗长春所 流行性出血热双价疫苗兰州所 流感灭活疫苗兰州所、长春所 流行性感冒裂解疫苗长春所、兰州所、北京科兴、浙江天元、GSK、华兰生物
中空纤维膜过滤技术在病毒类疫苗中的应用
中空纤维膜过滤技术在病毒类疫苗中的应用 Application of Hollow Fiber Filtration Technology in Virus Vaccine Production 苗景赟王奕军 (通用电气医疗集团 GE Life Sciences) 生命科学和生物技术的日新月异对疫苗的发展提供了新的契机：疫苗快速规模化生产、质量标准不断提高以及新技术的开发应用成为行业的技术发展趋势。 新型中空纤维膜过滤技术具有温和低剪切力、容尘量高、操作灵活、寿命长成本低、易于放大等优点，解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集两大技术难题，提供了较温和的超滤方法，因此广泛应用于疫苗等生物制药和生命科学研究领域。本文详述了中空纤维在狂犬疫苗和流感疫苗中的成功应用，结果表明新型中空纤维膜过滤技术有利于改进疫苗产品质量、提高生产效率。 将中空纤维膜过滤技术、新型WAVE波浪生物反应器和微载体细胞球转球放大培养工艺以及高选择性层析新填料技术相结合，可以更好的适应疫苗大规模生产的挑战。 1.病毒类疫苗的发展和面临的挑战 在人类与各种疫病的长期斗争过程中，没有任何其它医疗措施能像疫苗一样对人类的健康产生如此重大影响，也没有任何其它的治疗药品能像疫苗一样以其低廉代价把某种疾病从地球上消灭[1]。 近年国内外生物技术不断发展，出现多个年销售额超过10亿美元的重磅炸弹疫苗药物，如流感疫苗、肝炎疫苗、宫颈癌疫苗和肺炎多糖疫苗等。2008年到2010年全球疫苗年复合增长率超过14%，2009年全球疫苗总产值超过220亿美元，全球疫苗总产值在2012年预计将突破400亿美元[2]。国内疫苗市场在2009年也超过13亿美元，且以20%以上的速度复合增长，2009年SFDA疫苗批签发超过10亿剂量，病毒类疫苗约占60% [3]。 国内疫苗产业发展迅速，拥有近40家疫苗企业可以生产约50种疫苗药物，目前已建成年产超过1.6亿剂量的甲流疫苗生产线 [4]。但与此同时，国内疫苗企业也面临着诸多严峻挑战： (1) 生产规模小，产能不足 我国人口众多，人民群众对各种疫苗的需求增长迅速。而国内疫苗生产规模普遍较小，产能较低，难以满足疫苗规模化生产的需求。以狂犬灭活疫苗为例，国内部分厂家已经采用多个30L或14L小规模搅拌生物反应器结合微载体技术进行细胞培养平行放大代替转瓶工艺，但是多个反应器操作仍较繁琐，难以保证不同亚批产品的质量均一性，同时增加了工艺验证的难度。 新型WAVE生物反应器结合微载体细胞培养技术和球转球放大工艺为贴壁细胞规模化培养和放大提供了可能性，使用较大规模的生物反应器可以显著降低工作强度，减少生产批次和过程控制，提高产能和快速响应能力。目前WAVE已经成功的用于细胞流感疫苗、脊髓灰质炎、昆虫细胞VLP 新型疫苗 (Novavax, Inc) 等；2005年，以新型天花疫苗和治疗性HIV 疫苗著称的丹麦Bavarian Nordic 公司将WAVE 1000 成功的用于新型MVA疫苗的GMP生产 [5]。 中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的现代膜分离技术，寿命长成本低、可以直接线性放大，满足疫苗的大规模生产纯化需要。