人胰岛素前体在毕赤酵母中的组成型表达及其活性_郑国君

·基础研究·人胰岛素前体在毕赤酵母中的组成型

表达及其活性

郑国君1，倪玲2，郭德军1

1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；

2.大庆市中医院，黑龙江大庆163311

摘要：目的通过毕赤酵母GAP启动子高效分泌表达人胰岛素前体，并检测重组胰岛素类似物的生物活性。方法经密码子优化并人工合成人胰岛素前体基因IS基因，插入pGAPZaA组成型表达载体中，构建重组表达质粒pGAPZa-IS，电转化至感受态毕赤酵母SM1168菌株中，PCR鉴定阳性重组子；高抗性YPD平板筛选高蛋白表达株并优化表达条件；表达产物经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析；用吸附树脂吸附、阳离子交换层析、超滤纯化后，用经TPCK处理的胰蛋白酶切除人工C肽，经阴离子交换层析和醋酸锌沉淀纯化后，进行Tricine-SDS-PAGE分析；将12只链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致糖尿病模型的小鼠随机分为A组和B组，A组小鼠经腹腔注射含1.8%甘油的注射用水作为对照组，B组小鼠经腹腔注射用胰岛素类似物配制的0.05mg／ml注射用水剂（含1.8%甘油），10μl／g，空腹6h后，断尾取血，用血糖仪检测小鼠血糖值。结果重组表达质粒pGAPZa-IS经双酶切和测序鉴定，证明构建正确；共获得5株高抗性重组菌，其表达产物均可见相对分子质量约6000的目的蛋白条带，与小鼠抗胰岛素单克隆抗体不发生特异性反应，5号菌72h表达量最高；C肽切除后，获得了纯胰岛素类似物；模型小鼠在注射胰岛素类似物6h后，血糖值均明显降低，B组小鼠注射前后血糖值及A、B组间的血糖值差异均有统计学意义（P＜

0.01）。结论在毕赤酵母中，利用GAP启动子成功高效表达了胰岛素前体，并具有良好的降血糖活性。

关键词：胰岛素前体；毕赤酵母；基因表达；生物活性

中图分类号：R373.2R392-33文献标识码：A文章编号：1004-5503（2013）12-1753-06

Expression of human insulin precursor in Pichia pastoris using

GAP promoter and activity of expressed product

ZHENG Guo-jun*,NI Ling,GUO De-jun

*College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，Heilongjiang Province，China

Corresponding author：GUO De-jun，E-mail：guodejun356@https://www.360docs.net/doc/b58673599.html,

Abstract：Objective To express human insulin precursor in Pichia pastoris using glyceraldehyde-3-phosphate dehydro－genase promoter（pGAP），and determine the biological activity of recombinant insulin analogue.Methods Human in－sulin precursor IS gene was synthesized using P.pastoris preferred codons and inserted into vector pGAPZaA.The con－structed recombinant plasmid pGAPZa-IS was transformed to competent P.pastoris SMD1168strain by electroporation，and the positive recombinants were identified by PCR.The high protein-expressing strains were screened by highly zeocin-resistant YPD plate,and the condition for expression was optimized.The expressed product was identified by Tricine-SDS-PAGE and Western blot，adsorbed by adsorption resin，purified by cation exchange chromatography and ultrafiltration，then further purified by anion exchange chromatography and zinc acetate precipitation after removal of synthetic C pep－tide with TPCK-treated trypsin，and analyzed by Tricine-SDS-PAGE.Twelve diabetic mice caused by streptozotocin（STZ）were divided into control（A）and test（B）groups.The mice in group A were injected i.p.with water for injection，contain－ing1.8%glycerol,while those in group B with0.05／ml insulin analogue solution formulated with water for injection，con－taining1.8%glycerol，each at a dosage of10μl／g bodyweight.After a fast of6h,the mice were determined for blood sugar.Results Restriction analysis and sequencing proved that recombinant plasmid pGAPZa-IS was constructed correctly.

Five high zeocin-resistant recombinant strains were screened，in which the expressed product，with a relative molecular mass of about6000，showed no specific reaction with moue monoclonal antibody against insulin.The expression level in recombinant strain572h after culture was the highest in five strains.Pure insulin analogue was obtained after removal of

C peptide.The blood sugar level of diabetic mice decreased significantly6h after injection with insulin analogue，which

通讯作者：郭德军，E-mail：guodejun356@https://www.360docs.net/doc/b58673599.html,

showed significant difference in group B before and after injection and in groups A and B（P<0.01）.Conclusion Insulin precursor was successfully expressed in P.pastoris by using GAP promoter，which showed high hypoglycemic activity.

Key words：Insulin precursor；Pichia pastoris；Gene expression；Bioactivity

糖尿病（diabete）是一种慢性代谢性疾病，其对人类健康的威胁仅次于心脑血管疾病和癌症；据世界卫生组织（WHO）预测，2025年全球糖尿病患者将突破3亿；目前，我国糖尿病患者仅次于印度，达4000万［1］。胰岛素对于糖尿病，特别是胰岛素依赖性糖尿病的治疗至关重要。

基因重组技术为胰岛素的生产开创了新途径，重组人胰岛素成为第一个被投放市场的生物工程蛋白药物。目前，胰岛素产品多为基因工程产品，通过基因工程发酵生产胰岛素前体或类似物，再加工成有活性的胰岛素。胰岛素前体及其类似物在许多表达系统均成功获得表达，由于生产成本的缘故，较多采用大肠埃希菌表达系统和酵母表达系统［2］。大肠埃希菌表达系统是目前最常用的基因表达工具，其表达策略多种多样，但人胰岛素前体及其类似物的相对分子质量较小，易被大肠埃希菌的胞内酶所降解，也易在大肠埃希菌中形成包涵体，使后续加工难度增大，成本增加。酵母表达系统可将人胰岛素前体直接分泌至培养基中，极利于目的蛋白的提取和后续加工，使用AOX1（alcohol oxidase）启动子的重组酵母已逐步成为胰岛素前体的主要生产模式［3］。

胰岛素是由胰岛素原经后加工形成的。胰岛素原是由B链、C肽和A链3部分组成的一条含86个氨基酸的多肽，当C肽被切除后，即转化成含51个氨基酸的双链胰岛素。近年研究发现，C肽在AB 链的链接中仅起到分子内柔性连接的作用，缩短C肽可增加胰岛素原的表达水平［3］。本实验参照胰岛素的氨基酸序列，删除B链上Thr30，根据酵母的偏爱密码子，设计并合成了含3个氨基酸人工C肽的胰岛素前体DNA序列，尝试使用酵母GAP启动子和毕赤酵母SMD1168蛋白酶缺陷型菌株，分泌表达人胰岛素前体；提取和纯化目的蛋白，用胰蛋白酶切除C肽，获得B链上缺失Thr30的胰岛素类似物，并测定其降血糖活性，为利用基因工程技术生产化学修饰性的长效人胰岛素奠定基础。

1材料与方法

1.1质粒及菌株pGAPZaA组成型表达载体及毕赤酵母SMD1168菌株均购自美国Invitrogen公司；大肠埃希菌DH5α由黑龙江八一农垦大学食品学院生物技术实验室保存；pUC57质粒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2实验动物清洁级昆明小鼠，共12只，雄性，8周龄，每只重约20g，购自哈尔滨医科大学动物中心，动物合格证号：黑P0*******。

1.3主要试剂及仪器DNA小提质粒试剂盒和凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；T4DNA连接酶、LA Taq及限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ和BlnⅠ均购自日本TaKaRa公司；小鼠抗胰岛素单克隆抗体和HRP标记的羊抗小鼠IgG购自吉泰生物科技有限公司；PCR扩增仪（Gene Amp PCR System9600）为美国PERKIN-ELMER公司产品；截流相对分子质量30000和2000的Sartorius超滤包和超滤管购自北京新经科生物有限公司；DEAE Sepharose HP、SP Sepharose FF及AKTA100蛋白纯化系统购自美国GE公司；D3520吸附树脂购自天津南开合成科技有限公司；TPCK胰蛋白酶、链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4目的基因的设计及合成根据胰岛素的一级结构和人工C肽设计胰岛素前体结构，并利用软件优化基因密码子，加上XhoⅠ和XbaⅠ限制性酶切序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司化学合成该基因，命名为IS，连接至pUC57载体上，命名为pUC-IS，见图1。

图1人胰岛素前体的基因及氨基酸序列

Fig1.Gene and amino acid sequences of human insulin precursor

1.5重组表达质粒的构建将质粒pUC-IS和pGAPZaA分别经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，回收目的基因片段和载体片段，经T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5α，涂布含25μg／ml博来霉素（zeocin）的低盐LB平板，筛选阳性克隆，用含25μg／ml zeocin的低盐LB

液体培

养基振荡培养，提取质粒，经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pGAPZa-IS。

1.6重组子的构建及筛选重组表达质粒pGAPZa-IS经BlnⅠ酶切线性化后，电转化至感受态毕赤酵母SMD1168菌株中，用含100μg／ml zeocin的YPD平板进行重组子初筛，再用含500μg／ml zeocin的高抗性YPD平板进行复筛，选择长势较快的菌株进行YPD液体培养。利用pGAPZaA载体序列设计引物，序列如下：P1：5′-GTCCCTATTTCAATCAATTG-3′，P2：5′-GCGCTATTCAGATCCTCTTC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用玻璃珠法［4］提取重组子基因组DNA，以P1、P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸8min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7胰岛素前体的优化表达将高抗性YPD平板上筛选的阳性重组子接种至50ml YPD培养基中，30℃，240r／min振荡培养，分别于24、48、72和96h取样1ml，经12000r／min离心5min，取上清，经TCA法［4］浓缩后，沉淀溶于8mol／L尿素中，经Tricine-SDS-PAGE分析，筛选培养72h时的高产菌株并确定最佳表达时间，以携带空载体的毕赤酵母SMD1168菌株作为阴性对照。

1.8表达产物的鉴定采用Western blot法。取样经Tricine-SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF膜上，加入含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1h；用TBST buffer洗涤3次，加入小鼠抗胰岛素单克隆抗体（1∶500稀释），4℃孵育过夜；用TBST buffer洗涤3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶1000稀释），37℃孵育1h；用TBST buffer洗涤后，加入DAB显色。

1.9胰岛素前体的纯化及Ｃ肽的切除将高表达菌株接种至YPD培养基中，30℃，240r／min振荡培养72h；2000×g离心20min，取上清，调pH至3.5~4.0，经0.45μm滤膜过滤，用D3520吸附树脂吸附浓缩表达产物，经20%乙醇洗脱去除杂蛋白，经60%乙醇洗脱目的蛋白。用20mmol／L的乙酸钠-乙酸（pH4.0）平衡SP Sepharose FF柱，将60%乙醇洗脱的目的蛋白上样，经Tris-HCl（pH8.0）洗脱，收集洗脱峰，经截留相对分子质量为30000的超滤膜包进行超滤，收集滤过液，再经截留相对分子质量为2000的超滤膜包进行超滤浓缩，收集浓缩液。按1∶500（w／w）的比例加入TPCK处理的胰蛋白酶，4℃酶切过夜，切除C肽。用DEAE Sepharose HP进

一步纯化：以20mmol／L的Tris-HCl（pH8.0）为平衡液，以含1mol／L NaCl的20mmol／L的Tris-HCl （pH7.6）混合液梯度洗脱，收集洗脱峰，经截留相对分子质量为2000的超滤管浓缩后，加入3.6%（v／v）的醋酸锌溶液，调pH至6.0，4℃过夜；离心分离沉淀，经冷丙酮洗涤后干燥，即为胰岛素类似物。1.10胰岛素活性的初步检测用胰岛素类似物配制0.05mg／ml注射用水剂（含1.8%的甘油，pH3.0），无菌过滤后备用。于小鼠腹腔注射STZ，200mg／kg，66h后给小鼠进食，72h后称量小鼠体重并检测空腹血糖值，以体重明显减轻且血糖值≥16.7mmol／L 确定为小鼠糖尿病模型。将12只糖尿病模型小鼠随机分为A和B组：A组小鼠经腹腔注射含1.8%甘油注射用水作为阴性对照；B组小鼠经腹腔注射0.05mg／ml的重组胰岛素制剂10μl／g。空腹6h 后，断尾取血，用血糖仪检测小鼠血糖值。

1.11统计学分析应用SPASS17.0软件进行统计学分析，组间数据比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1重组表达质粒的鉴定重组表达质粒pGAPZa-IS的双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见180bp的目的基因条带和3000bp的pGAPZa载体条带，见图2。测序结果与合成的IS序列一致，表明重组质粒构建成功。

1：质粒的双酶切产物；2：DNA marker DL5000。

图2重组质粒pGAPZa-IS的双酶切鉴定（XhoⅠ／XbaⅠ）Fig2.Restriction map of recombinant plasmid pGAPZa-IS （XhoⅠ／XbaⅠ）

2.2重组子的筛选在含100μg／ml zeocin的YPD 平板上获得15株重组菌；在含500μg／ml zeocin的YPD平板上获得5株高抗性重组菌，见图3。5

株重

12bp

5000

3000

2000

1000

750

500

250

100

组菌的PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约500bp 的特异性条带，与预期结果一致，见图4，表明目的基因已整合至酵母染色体上。

图3高抗性YPD 平板筛选重组酵母菌

Fig 3.Screening of high zeocin -resistant recombinants on YPD plate

1～4，6：重组酵母菌株基因组PCR 产物；5：DNA marker DL2000。

图4重组酵母基因组的PCR 鉴定

Fig 4.Identification of genome of recombinants by PCR

2.3表达产物的鉴定Tricine -SDS -PAGE 分析显

示，5株高抗性重组酵母菌的表达产物在相对分子质量约6000处均可见增加的目的条带，其中5号菌株表达量最高，见图5；5号菌于24、48、72和96h 的表达上清经Tricine -SDS -PAGE 分析显示，在24~72h 之间，胰岛素前体的表达量逐渐上升，72h 时达到最高，之后逐渐下降，见图6。Western blot 分析显示，胰岛素前体未与小鼠抗胰岛素单克隆抗体发生特异性结合反应。

2.4纯化产物的鉴定Tricine -SDS -PAGE 分析显示，经吸附、阳离子交换层析、超滤等纯化，已获得了纯胰岛素前体；C 肽切除后，使用阴离子交换层析和醋酸锌沉淀，已获得了纯胰岛素类似物。见图7。2.5胰岛素活性小鼠腹腔注射STZ 72h 后，体重平均减轻5g ，血糖值均＞16.7mmol ／L ，表明小鼠糖尿病模型建模成功；模型小鼠在注射胰岛素类似物

6h 后，血糖值均明显降低，B 组小鼠注射前后血糖值及A 、B 组间的血糖值差异均有统计学意义（F =820.4，P ＜0.01），见表1。表明该重组胰岛素类似物具有明

显的降血糖活性。

1：1号菌株；2：5号菌株；3：6号菌株；4：7号菌株；5：低分子量蛋

白质marker ；6：阴性对照；7：13号菌株。

图55株高抗性重组酵母菌表达产物的Tricine -SDS -PAGE 分析

Fig 5.Tricine -SDS -PAGE profile of expressed products in five high zeocin -resistant recombinant P.pastoris strains

1：阴性对照（72h ）；2：低分子量蛋白质maker ；3：24h ；4：48h ；

5：72h ；6：96h 。

图65号菌株不同时间表达产物的Tricine -SDS -PAGE 分析

Fig 6.Tricine -SDS -PAGE profile of expressed product in strain 5cultured for various hours

1：72h 表达上清；2：纯化的胰岛素前体；3：低分子量蛋白质marker ；4：纯化后的胰岛素类似物。

图7纯化的胰岛素前体和胰岛素类似物的Tricine -SDS -PAGE 分析

Fig 7.Tricine -SDS -PAGE profile of purified insulin precursor and insulin

analogue

123456bp

2000

16001000750500

250

1234567

M r 4300014300290002010065

00

1

2

3

4

5

6

M r 43000

14300290002010065

00

1234M r 430001430029000

2010065002250

3300

表1小鼠体重及血糖值的变化

Tab1.Body weights and blood glucose levels of mice

A组B组

123456123456

建模前体重21.422.120.624.323.222.720.723.122.323.622.423.022.45±1.12

建模后体重15.717.216.018.618.917.514.818.517.618.717.618.217.44±1.31

建模前血糖值 3.7 3.9 4.0 3.8 3.4 3.5 3.8 3.7 4.0 3.5 3.8 3.6 3.73±0.20

建模后血糖值18.719.117.917.420.318.219.420.018.422.419.620.519.33±1.37

注射后血糖值22.624.021.522.024.122.822.83±1.05（A组）bb

11.914.012.412.813.513.713.05±0.82（B组）aa

注：aa表示与建膜后血糖值相比，P＜0.01；bb表示与B组注射后血糖值相比，P＜0.01。

检测项目x±s

3讨论

胰岛素由A、B链组成，A链有21个氨基酸，B 链有30个氨基酸，A、B两链间通过A7-B7、A20-B19两个二硫键相连，同时A链中A6-A11之间还存在1个链内二硫键；胰岛素原的一级结构是由B-C-A3个肽链连接成的1条肽链，胰岛素是由胰岛素原切除C 肽链而转化成的高活性小分子蛋白。C肽链的长度因种属的不同而不同，呈现非保守性，仅起到分子间柔性连接作用。80年代后，利用基因工程技术可获得氨基酸排列顺序及生物活性与天然人胰岛素完全相同的产品，其表达形式也由早期使用大肠埃希菌表达系统逐渐转化为使用酵母表达系统；胰岛素也由短效型向长效型不断发展，主要采用脂肪酸或PEG 对胰岛素B链上的第29位Lys进行修饰，延长其半衰期。在酵母中分泌表达胰岛素前体时，缩短C肽，可明显提高胰岛素前体的分泌表达量。Annibali［5］利用重组毕赤酵母成功分泌表达出带有2个氨基酸人工C肽的人胰岛素原B（1-30）-Y1-Y2-A（1-21），Y1和Y2可以是氨基酸R或K。Kjeldsen等［6］发现，当人胰岛素前体的小C肽为AAK时，可使每升培养基中胰岛素前体的表达量达到克级水平；当为EWK序列时，还可提高5倍的表达量。2004年上市的地特胰岛素就是去掉B链上第30位的Thr，在第29位Lys 连接上一个14C脂肪酸［7］。因此，本实验也将胰岛素原设计为B（1-29）AAK-A（1-21）结构，使用胰蛋白酶一次切除C肽，而获得B链仅有29个氨基酸的胰岛素类似物，为化学修饰胰岛素提供参考。

毕赤酵母表达系统是一种高效的异源蛋白表达系统，常用的分泌表达载体有pPICZaA和pGAPZaA［8］。pPICZaA是一种甲醇诱导型表达载体，使用紧密控制型乙醇氧化酶启动子AOX1，葡萄糖对其表达具有强烈的抑制作用，已成功高效表达多种异源蛋白，尤其适合表达一些毒性蛋白。pGAPZaA是一种组成型表达载体，使用3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子GAP。近年来研究发现，AOX1启动子与GAP启动子的基因启动能力基本相同［8］。pGAPZaA与pPICZaA相比，具有培养基配制更廉价、不使用甲醇、操作简单、更易大规模发酵等特点，因此，本实验使用组成型表达载体pGAPZaA表达该胰岛素前体。异源基因表达量的高低，除受表达载体启动子的影响外，还受表达宿主基因密码子的偏爱性、基因拷贝数、表达宿主类型和信号肽的分泌能力的影响［9］。为高效表达该胰岛素前体，本实验根据毕赤酵母基因密码子的偏爱性，整体优化了IS基因。使用高抗性平板有助于筛选多拷贝重组子，但拷贝数多少为最佳，尚无定论，也无理论可用于推测，不同的基因需要实验进行反复摸索。毕赤酵母常用的表达宿主有X-33、GS115、KM-71和SMD1168，其不同宿主间存在一些表型差异。小分子蛋白易降解，不易在培养基中长期积累，胰岛素家族中的Relaxin2前体在酵母中的表达就是一个很好的实例［10］。因此，本实验选用胞外蛋白酶缺陷型菌株SMD1168作为表达宿主，避免产物的降解，利于胰岛素前体在培养基中的表达积累。pPGAPZa分泌表达载体的a因子信号肽上，具有Kex2和Ste13两个信号肽切除位点，同时使用这两个切除位点时，经常会出现表达产物N-末端不均一的现象［11-12］。为了避免这一现象，本实验仅使用Kex2信号肽切除位点，从Tricine-SDS-PAGE中可以看出，胰岛素前体被成功分泌至培养基中。

本实验Western blot分析未见特异性条带，与高剑坤［13］的研究结果一致，也间接证明了所表达的目的蛋白的正确性。天然胰岛素抗原决定簇位于B链的C-末端，这可能是由于人工C肽将胰岛素前体B 链C-末端的抗原决定簇包裹起来或形成空间位阻，使得人胰岛素抗体不能结合到抗原决定簇上。

Tricine-SDS-PAGE是分离鉴定相对分子质量在10000以下的小分子蛋白的有效手段，分子越小电泳条带越容易发散；当分离鉴定相对分子质量小于

（下转第1763页）

（上接第1757页）

5000的蛋白时，在分离胶中加入适量的尿素，有利于蛋白条带的凝聚。用10%终浓度的三氯乙酸进行浓缩是实验常用的一种蛋白浓缩方法，但对于相对分子质量小于4000的蛋白无沉淀作用；在沉淀浓缩胰岛素原时，建议将三氯乙酸的浓度提高到15%，将丙酮洗涤干燥后的沉淀溶于8mol／L尿素中，有利于提高胰岛素原的沉淀效率和再溶解效果。反相层析已成为获得高纯度胰岛素原或胰岛素的一种有效手段，使用CT-8树脂替代Source30是一个可行的选择。

本研究已成功利用毕赤酵母组成型表达系统分泌表达了胰岛素前体，重组产物经加工后具有明显的降血糖活性，这为对其进行下一步的加工修饰，研制长效胰岛素奠定了基础。

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收稿日期：2013-04-04编辑：王佳凤

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收稿日期：2013-01-17编辑：李靓