胸腺嘧啶二聚体的产生
中文名称：嘧啶二聚体
英文名称：pyrimidine dimer
定义：DNA链上相邻嘧啶以共价键连成的二聚体，由紫外线照射产生。最常见的是胸腺嘧啶二聚体。
由来：紫外线可以造成DNA的损伤，将DNA分子中的胸腺嘧啶以环丁基环形成二聚体，称为胸腺嘧啶二聚体。这种变化在DNA链上相邻近的胸苷酸容易发生。二聚形成后，RNA引物的合成将停止在而具体处，DNA的合成也受阻。
修复：紫外线照射形成了胸腺嘧啶二聚体是以UvrABC进行修复的（某些化学造成的损伤也是以此方式修复的）。DNA损伤时，局部有一膨胀的变型区，蛋白质UvrA及UvrB结合在此变性区，并促使DNA解链，ATP参与此过程。随之，Uvr C蛋白结合到损伤部位的复合物上。在损伤部位相邻的12个核苷酸间距的两端被切开，在解链酶的作用下，损伤部位的12个核苷酸片段经解链脱出，随后，在DNA聚合酶1的作用下补充了空隙，最后在连接酶的作用下完成了额修复。反应完成之后，Uvr A、B、C在蛋白酶水解下被破坏。修复完成。
引物的原理
引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， 引物长度和专一性 ?常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 ?引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 3’-序列
基因工程习题
基因工程习题及参考答案02 工具酶部分——限制性内切核酸酶 一、填空题 1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。 基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。 2．年Luria 和Human 在T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。 3．1970 年，Smith 和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。 它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA 杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有，产生末端的DNA 片段或的DNA片段。作用时需要作辅助因子，但不需要和。 6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。 7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。 根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。 8．EcoK 是I 类限制性内切核酸酶，分子组成是α2 β2 γ，分子量300kDa。在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。9．个体之间DNA 限制性片段长度的差异叫。 10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。11．限制性内切核酸酶Acy I 识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。12．在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2 秒钟，其目的是和。13．部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。14．第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是。 15．限制性内切核酸酶BsuRI 和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是，它们属于。 16．由于DNA 是由4 种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是。 17．Sal I 和Not I 都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb 片段中，找到NotI 切点的概率是。 18．部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA 序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是。
怎样PCR减少引物二聚体
引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体Primer dimer。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA的片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。 形成引物二聚体原因 1, 最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。 2，模板量过低; 3, 引物浓度多大; 4, 退火时间过长. 可以通过下面的方法来减少引物二聚体： 1. 适度减少引物的浓度（0.1－0.5pm）对于30轮放大足够 2. 检查引物的自身结构，有无复杂的2级结构和FORWARD/REVERSE之间的配对，尤其是3'端互补结构 3. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。我试过，的确如此。 4. 可以考虑加DMSO,甘油，BSA以及其他添加剂，解除引物二聚体。 5. 如果PCR产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量，以及胶内显色物质（如减少EB的量）一般PCR体系的引物和ｄＮＴＰ的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不是引物和ＮＴＰ。 PCR时，引物不要加太多，退火温度适当调高一点。 减少PCR产物中引物二聚体的方法: 1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量； 3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度； 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性； 6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。 7.增加循环数； 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）； 9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍； 不管是引物的哪一端形成了二聚体都会随着温度的上升而解开. 而与延伸的时间和温度是
基因突变(二)
基因突变(二) (总分：240.00，做题时间：90分钟) 一、填空题(总题数：37，分数：90.00) 1.高等生物的自发突变率为______；细菌的自发突变率为______。 （分数：2.00） 填空项1:__________________ （正确答案：1×10-5～1×10-101×10-4～4×10-10） 解析： 2.DNA复制中的错误包括 1等。 （分数：1.00） 填空项1:__________________ （正确答案：基因替换、移码突变、缺失和重复） 解析： 3.常见的自发损伤有 1等。 （分数：1.00） 填空项1:__________________ （正确答案：脱嘌呤，脱氨基，氧化性损伤碱基） 解析： 4.SOS修复与______基因和______基因有关，在正常细胞内SOS系统是______的。 （分数：3.00） 填空项1:__________________ （正确答案：recA lexA 关闭） 解析： 5.任何离开野生型等位基因的变化称为______突变；任何回复野生型的变化称为______。 （分数：2.00） 填空项1:__________________ （正确答案：正向反突变或回复突变） 解析： 6.突变引起的表型变异是多样的，根据明显的表型特征可分为______、______、______、______。 （分数：4.00） 填空项1:__________________ （正确答案：形态突变生化突变条件致死突变致死突变） 解析： 7.基因突变的发生，受到很多环境因子和生理因子的影响，其中以生物的______、______和______的影响最为明显。 （分数：3.00） 填空项1:__________________ （正确答案：DNA复制错误自发损伤转座因子） 解析： 8.性细胞中的显性突变在______代就可表现，隐性突变多在______代及以后世代中表现出来，体细胞的显性突变多在______代表现，使植株出现嵌合现象。 （分数：3.00） 填空项1:__________________ （正确答案：子一子二当） 解析： 9.如果突变发生在合子中、合子第一次分裂后的一个子细胞中或叶芽中，个体的表现型分别为______、 ______、______。 （分数：3.00） 填空项1:__________________ （正确答案：突变体嵌合体变异枝条） 解析： 10.基因突变与染色体畸变的主要区别是： 1。 （分数：1.00） 填空项1:__________________ （正确答案：染色体畸变是染色体水平上的变化，可涉及多个基因，多在细胞学水平可以观察到的突变现象。基因突变是基因内部发生的改变） 解析：
引物设计注意事项
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
分子生物学-2.doc
分子生物学-2 (总分：100.00，做题时间：90分钟) 一、判断题(总题数：20，分数：50.00) 1.用重组修复和SOS修复的方式修复DNA损伤，在修复完成后都会产生较高的基因突变概率。（分数： 2.50） A.正确 B.错误 2.DNA错配修复不需要消耗能量。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 3.紫外线照射损伤DNA的主要原因是形成了嘧啶二聚体。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 4.只有DNA聚合酶Ⅰ参与了大肠杆菌的错配修复过程。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 5.点突变不会造成移码突变。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 6.切除修复不能修复嘧啶二聚体造成的DNA损伤。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 7.大肠杆菌的DNA同源重组修复不需要DNA聚合酶。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 8.核苷酸的插入或缺失突变不一定会造成移码突变。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 9.碱基类似物造成DNA突变的主要原因是其掺入DNA后抑制了DNA复制。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 10.真核生物的DNA错配修复需要PCNA的参与。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 11.大肠杆菌的错配修复机制能修复所有可能的碱基错配。 （分数：2.50） A.正确 B.错误
12.DNA损伤的光复活修复过程需要内切酶的参与。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 13.镰状细胞贫血是由于血红蛋白β链基因发生了缺失突变。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 14.胸腺嘧啶二聚体可以使DNA聚合酶失活，因而阻碍了DNA合成。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 15.紫外线照射不会造成DNA的单碱基突变。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 16.通常情况下SV40基因组的突变率比HIV低。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 17.参与大肠杆菌SOS修复的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅲ。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 18.DNA修复过程通常需要DNA连接酶。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 19.DNA中的碱基G如果发生脱氨基反应将导致DNA发生突变。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 20.着色性干皮病人的DNA错配修复系统存在缺陷。 （分数：2.50） A.正确 B.错误 二、选择题(总题数：20，分数：50.00) 21.以下哪一项不会引起插入/缺失(insertion/deletion)突变?（分数：2.50） A.胞嘧啶的脱氨基作用 B.DNA复制过程中发生的错误 C.转座作用 D.吖啶的诱变作用 22.由于碱基突变使编码Cys的密码子TGC突变为TGA，这种突变称为：（分数：2.50） A.无义突变 B.错义突变 C.沉默突变 D.移码突变 23.下列哪种因素不会诱发DNA突变：（分数：2.50） A.放射性同位素辐射
引物设计-总结
引物设计 一.引物设计原则 首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 二.引物设计注意的要点 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高 的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不 同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反 应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在
Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部 碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生 引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要 插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 三.引物设计的步骤 1.打开NCBI的主页，选择UniSTS,填写目的基因，选择符合要求的引物，导入blast和primer5检测是否符合要求，如果不符合要求再自己重新设计。 2.打开NCBI页面，选择Gene,填写需要查找的基因及源种（例如小鼠mus）,找到mRNA的序列号，点击打开，找到相应的mRNA，把序列或者mRNA的accession序号导出到word里面，找出含有内含子的位置，做好标记(从进入Gene页面后，点击Genbank,可以了解这个基因的大小，以及内含子与外显子的大小)或者把mRNA的accession序号导入priemer Designing tool里面，扩增产物是200-250（100-250），TM 58-62（60±3），至少包含一个内含子，内含子长度可慢慢调试，最终要求
引物二聚体
我做的RT-PCR电泳后发现有引物二聚体和杂带，请问是什么原因？应该怎样处理才能解决这个问题？ 1、引物二聚体的产生原因比较多，其中很重要的一个就是引物自身的原因，也就是设计的引物特异性不好，不能有效的和模板进行结合，而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现；其次还可能是PCR体系及反应条件的问题，如果PCR体系中引物、镁离子以及酶浓度过高等，都容易产生二聚体，这时要适当降低浓度，比如20uLPCR体系中，一般10pmol/ul 的引物，加0.2ul就可以了；还有可能是退火温度的问题，可以做个梯度PCR或降落PCR，来摸索一个合适的退火温度，也可有效地减少二聚提的出现。 2、杂带的出现在很大程度上来源于两个方面：一是引物的特异性问题，包括引物的长度和与模板的匹配度等。二就是退火温度的问题，一般适当提高退火温度可有效地减少非特异性扩增，从而减少杂带的出现。 一般来说减少杂带的方法有：热启动PCR(加热启动酶或先把PCR仪预热）、提高退火温度、做降落PCR(每个循环降低0.5度）、降低底物浓度、降低镁离子浓度、减少循环次数等；其次，有些共溶剂（甲酰胺，DMSO）和添加剂（氯化四甲铵，谷氨酸钾，硫酸铵）能够降低高水平的错误引导与提高富含G+C模板的扩增效率。另外还需要注意一些细节问题，如PCR反应体系的最好在冰上配制，TAq酶最后加，PCR结束后产物勿放置在室温下过长时间等。 你的问题RT-PCR有：杂带和引物二聚体 RT中非特异性条带的产生和解决 1.首先，要排除污染。建议用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。 2.在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。 3.由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。 引物二聚体 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题（可能cDNA有降解，这里我考虑你用的2步法）； 3. 模板浓度过小，适当加大模板量； 4. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）； 5. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 ＰＣＲ时出现较明显引物二聚体，但无所要目地带，或部分有较亮目地带仍伴较明显引物二聚体，我该如何处理？引物二聚体的形成对目地带的产生及产量有多大影响？另在ＰＣＲ时，我所需目地带应为２７０bp,但多次ＰＣＲ产物跑胶时在约５００bp处可见很亮带，而２７０bp处仅有很淡条带或无目地带，Ｗhy?我该如何处理，恳请各大侠．高手指点，在下万份感激，急盼佳音，多谢！ 你可以少加点引物或者提高些退火温度，如果还不行可以考虑换一种引物 500bp的带很可能是污染了，出现假阳性
引物二聚体的形成
什么是引物二聚体？怎样消除引物二聚体? 是引物的3'端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。 减少PCR产物中引物二聚体的方法: 1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法; 2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量; 3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度; 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性; 6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。 7.增加循环数; 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些); 9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l 没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。 10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。 反应成分问题：
引物设计的原理与方法
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
医学遗传学试题
绪论 1.遗传病最基本的特征是（） A．先天性B．家族性C．遗传物质改变D．罕见性E．不治之症 2．下列哪种疾病不属于遗传病（） A．单基因病B．多因子病C．体细胞遗传病D．传染病E．染色体病 3.医学遗传学研究的对象是______。 A.遗传病 B.基因病 C. 分子病 D. 染色体病 E.先天性代谢病 4.遗传病是指______。 A．染色体畸变引起的疾病B．遗传物质改变引起的疾病C．基因缺失引起的疾病D．“三致”物质引起的疾病 E.酶缺乏引起的疾病 5.多数恶性肿瘤的发生机制都是在______的基础上发生的。 A.微生物感染 B.放射线照射 C.化学物质中毒 D.遗传物质改变 E.大量吸烟 绪论1.C 2.D 3.A 4.B 5.
基因和染色体 1.科学家还发现与蛋白质合成有关的基因序列只占整个基因组序列的______。 A.10% B.2% C.1% D.5% E.3% 2.真核生物的结构基因是______,由编码的外显子和非编码的内含子组成，二者相间排列。不同基因所含内含子数目和大小也不同。 A.复等位基因 B.多基因 C.断裂基因 D.编码序列 E.单一基因 3.每一个内含子的两端具有广泛的同源性和互补性，5′端起始的两个碱基是GT，3′端最后的两个碱基是AG，通常把这种接头形式叫做______。 A.GA-TG法则 B.G-A法则 C.T-G法则 D.G-G法则 E.GT-AG法则 4.单拷贝序列又称非重复序列。在基因组中仅有单一拷贝或少数几个拷贝，单拷贝序列的长度在______之间，其中有些是编码细胞中各种蛋白质和酶的结构基因。 A.800bp～1 000bp B.400bp～600bp C.600bp～800bp D.500bp～700bp E.1000bp～1200bp
河北省邯郸市第一中学2020届高三下学期二轮复习研四性考试试卷(四)理科综合试题
邯郸市一中2020届高三二轮复习研四考试理科综合试题 考试时间：3月2日7：40--10：10 一、选择题：本题共13个小题，每小题6分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。 1．下列有关神经调节和体液调节的叙述，正确的是 A．能进行体液调节的动物都能进行神经调节 B．动物体内能产生兴奋的细胞都是神经细胞 C．人体内具有分泌功能的细胞都能产生激素 D．高等动物的两种调节方式都存在分级调节 2．下列对某一癌症患者体内造血干细胞和癌细胞的比较，正确的是 A．造血干细胞和癌细胞的细胞周期不一定相同 B．造血干细胞和癌细胞中的基因和mR N A都相同 C．癌细胞的分裂能力和分化能力都比造血干细胞强 D．原癌基因在癌细胞中表达但在造血干细胞中不表达 3．下图表示植物细胞中的某些代谢过程，其中①～⑥代表各种物质。 下列叙述错误的是 A．光照强度是影响①②间循环速率的重要因素 B．③转化为④时光能就转化成了活跃的化学能 C．物质⑤和⑥进行跨膜运输时都不需消耗能量 D．①②的循环速率与③④的循环速率相互制约 4．下列有关酶的实验设计中，所选材料与试剂最合理的组别是 5．某二倍体水稻品系中，高镉对低镉为显性，耐盐对不耐盐为显性。科研人员将低镉不耐盐水稻和高镉耐盐水稻进行杂交，再将F1自交得到F2，F2中出现了3/16的低镉耐盐水稻。 下列说法错误的是 A．水稻体内含镉量高低与是否耐盐两对性状独立遗传 B．将F1水稻的花粉离体培养可直接获得可育低镉植株 C．F2代低镉耐盐水稻植株中只有一部分可以稳定遗传 D．F2代水稻中出现变异类型的遗传学原理是基因重组 6．紫外线对D N A分子的主要损伤方式是形成胸腺嘧啶二聚体，下图表示细胞中D N A分子发生这种损伤后的自动修复过程。下列叙述错误的是 A．胸腺嘧啶二聚体形成后可能会影响D N A的复制和转录 B．图示D N A分子损伤后的修复过程可能需要多种酶参与
引物设计的详细步骤
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm 窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 ②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小些，最好不要超过9。 ③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以
遗传育种复习题解-2007级讲解
微生物育种课后复习思考题参考答案完整版 成潇龙：有些我直接在答题上改了，也没有做标记。还有些希望你们自己去补充，说实话你们还是以考试为出发的复习，很多还是不用心。哎，理解吧。 微生物育种课后复习思考题参考答案 第一章思考题 一．名词解释 1.遗传与变异 遗传（Inheritance）指亲代的性状在子代表现的现象。（生物繁殖过程中，子代与亲代在各方面的相似现象） 变异（Variation）指同种生物世代之间或同代不同个体之间的性状的差异。（子代个体发生了改变，在某些方面不同于原来亲代的现象） 2.GMOs：遗传修饰生物体（Genetic modification organisms, GMOs），经外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。 3.表型和基因型 表型：细胞在一定环境条件下表现出的一些实际的，已表达的特性。分子的角度讲，一个微生物的表现型是它的蛋白质的总和。例如：微生物完成一个特殊化学反应的能力。 基因型：由它的遗传信息组成，它编码微生物的所有特性，基因型代表潜在的特性，并不是特性本身。分子角度讲，一个微生物的基因型是它所有基因的总和。 二、问答题 1.工业微生物菌种应具有哪些基本特征？ 非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺； 具有相对稳定的遗传性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。 2.遗传物质的化学本质是什么？简述其证明实验。 1、肺炎链球菌转化实验结论：转化因子的化学本质为DNA。 2、噬菌体感染实验结论：DNA是遗传物质 3、病毒重建实验结论：HR病毒的遗传物质是RNA 结论：生物的遗传物质的化学本质是核酸，在绝大多数生物中是DNA，在少数病毒中是RNA。 3.简述遗传物质在各种微生物中的存在状态及复制方式。 多数生物中DNA为遗传物质的存在状态：细菌核DNA（拟核）细菌质粒真核细胞染色体，少数以RNA为遗传物质的病毒中存在 遗传物质的复制方式： 1、DNA的半保留复制模型 2、DNA的二向复制模型（θ模型） 3、DNA的滚环复制模型
2019届四川省成都市高三下学期第三次诊断性检测理科综合生物试题(解析版)
2019届四川省成都市高三下学期第三次诊断性检测 理科综合生物试题（解析版） 1.下列有关神经调节和体液调节的叙述，正确的是 A. 能进行体液调节的动物都能进行神经调节 B. 动物体内能产生兴奋的细胞都是神经细胞 C. 人体内具有分泌功能的细胞都能产生激素 D. 高等动物的两种调节方式都存在分级调节 【答案】D 【解析】 【分析】 本题考查神经调节和体液调节，考查对神经调节、激素调节过程的理解。明确神经调节、激素调节的调节机制和调节过程是解答本题的关键。 【详解】单细胞动物和一些多细胞低等动物只有体液调节，没有神经调节，A项错误；动物体内的肌肉细胞或内分泌腺细胞也可以产生兴奋，B项错误；人体内具有外分泌功能的细胞如消化腺细胞不能产生激素，C项错误；高等动物的神经调节和激素调节两种调节方式都存在分级调节，D项正确。 【点睛】本题易错选C项，错因在于对分泌细胞理解不正确。具有分泌功能的细胞包括外分泌细胞和内分泌细胞，外分泌细胞有导管，分泌消化液或汗液，内分泌细胞没有导管，分泌的激素直接进入内环境。 2.下列对某一癌症患者体内造血干细胞和癌细胞的比较，正确的是 A. 造血干细胞和癌细胞的细胞周期不一定相同 B. 造血干细胞和癌细胞中的基因和mRNA都相同 C. 癌细胞的分裂能力和分化能力都比造血干细胞强 D. 原癌基因在癌细胞中表达但在造血干细胞中不表达 【答案】A 【解析】 【分析】 本题考查细胞分裂、分化与癌变，考查对细胞分化实质、癌变原因的理解。细胞分化的实质是基因的选择性表达，遗传物质并不发生改变；细胞癌变是遗传物质发生改变的结果。 【详解】细胞周期受细胞的生理状态、温度等因素的影响，造血干细胞和癌细胞的细胞周期不一定相同，A 项正确；癌细胞是原癌基因和抑癌基因突变的结果，造血干细胞和癌细胞中的基因和mRNA不完全相同，B 项错误；癌细胞可以无限增殖，但不会分化，C项错误；原癌基因主要负责调节细胞周期，控制细胞生长
遗传育种翻译二
通过连续的复制不能产生存活的子代细胞，因为含有胸腺嘧啶二聚体的链会持续产生有缺口的子链。第一组有缺口的子链当复制叉进入缺口会被打碎。但是通过互补链交换，可以形成一个完整的双链分子。 姐妹染色单体最重要的是，同源DNA片上不受任何攻击的单链片段被剪切，插入有胸腺嘧啶二聚体产生的缺口。这一遗传重组需要RecA蛋白参与。DNA pol I 合成互补链，DNA 连接酶把插入片段连接到相邻DNA上，填补缺口。供体链上由剪切产生的缺口也由DNA pol I 和DNA连接酶修复。假如每一个胸腺嘧啶二聚体都可以用这种方式修复，会形成两个完整的子链，每一个都作为下一个循环的模板合成正常的DNA分子。注意当两个胸腺嘧啶二聚体分别在相对链并且相互邻近时，这样就没有未受损的姐妹链片段可以用于另一条链重组，该系统将会失效。很多关于重组的详细信息尚未发现，所以图9-12中的模型仅仅是一个模型。 重组修复是一个很重要的机制，因为它不需要延迟复制数小时，用于切除所有的胸腺嘧啶二聚体。此外，重组修复还可以修复一些不可以由剪切修正的损伤，例如，细小的变化不能引起双螺旋变形，但却可以终止DNA合成。 重组修复也可以出现在紫外线照射的噬菌体中。假如一个不能进行剪切修复的噬菌体菌株被紫外线照射，涂布在recA上生长的数量比recA+的少。 与剪切修复相比，重组修复出现在DNA复制后，重组修复也被称为复制后修复。重组修复也叫子链缺口复制。因为只有相对的二聚体形成的缺口，而不是二聚体本身被修复。 SOS修复 我们知道紫外线是一个强大的诱变剂。而我们目前讨论的修复过程，并不是致突变的：光复活、剪切修复、重组修复都能准确的修复损伤。紫外线诱变不是紫外线线性相关的诱变作用：诱变需要高剂量的紫外线。这一发现说明当紫外线损伤超过准确的修复系统修复DNA 损伤能力时，另外一种过程可以允许细胞存活但以突变为代价。这一过程叫SOS修复，因为它是最后一种允许DNA复制的渠道，让细胞继续生存。因此好像未修复的的DNA损伤在某种程度上诱导了SOS反应。 SOS修复是一种旁路系统以复制精确度为代价允许DNA链跨过损伤片段延伸。它是一个易出错的过程，即使整个DNA链形成了，链内经常包含错误碱基。SOS修复并未被完全研究透彻，但是结果显示，编辑系统忽略DNA双螺旋变形允许跨过二聚体是聚合继续。SOS 修复主要是紫外线和一些诱变剂引起的。 SOS反应的调节 SOS反应在大范围DNA损伤后，涉及很多基因的开和闭。SOS反应是一个令人迷惑的难题，直到把RecA蛋白和噬菌体功能之间联系在一起。 回忆一下λ噬菌体有两种生活方式：烈性繁殖感染或溶源生长整合到大肠杆菌染色体上。整合的噬菌体DNA叫前噬菌体，携带前噬菌体的宿主叫溶源性细菌。前噬菌体产生一种叫cI前体的蛋白，可以阻止噬菌体裂解细胞。紫外线损伤诱导λ前噬菌体从细菌染色体的整合态到裂解状态。噬菌体在宿主细胞中复制，杀死和裂解宿主细胞，释放子代噬菌体（溶源诱导）。这一反应类似于老鼠逃离快要沉没的船：前噬菌体察觉到宿主细胞严重损伤而且快要死亡。假如宿主细胞死亡，噬菌体DNA还在宿主DNA上，噬菌体也会死掉。假如噬菌体进入裂解生长阶段，它可以复制并逃离损伤细胞，并且可以找到一个未损伤的宿主侵染。溶源诱导只发生在紫外线剂量有效引发SOS反应的情况下，人溶源菌也是SOS反应的一部分。 第二个线索来自RecA突变体自身的功能。RecA菌株对紫外线极其敏感。敏感一部分