实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】
1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；
2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】
在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。
【试剂与器材】
（一）试剂（(全班分两大组，每组配一份，如1－5组一份，6－10组一份)
（1）30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于100 mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光贮存（1）。
（2）3mol/L Tris-buffer,pH8.9：Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH?O 至100 mL）
（3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 6.05g Tris base 溶于40mL ddH?O中，加1mol/L HCl 48mL, 加水补至100mL.
（4）5×Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3):（配1L）
Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。
（5）10% SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。
（6）TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20 mL (全班共用)，4℃保存。
（7）10% AP（过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装至1.5mL 离心管中，－20℃保
存待用（2）。
（8）样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液。
* 先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g ，加入50 ml重蒸水，再加入约3 ml 1mol/L HCL,调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100 ml
*按下表配制样品溶解液：
*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。
*或配制2 X SDS样品缓冲液：
100mmol/L Tris-HCl (pH6.8)
200mmol/L DTT
4% SDS
0.2% 溴酚蓝
20% 甘油
必要时加入少量（1%）巯基乙醇。
（9）考马斯亮蓝染色液(3)：0.05 g考马斯亮蓝R250溶于25 mL异丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O 至110 mL，用滤纸过滤除去不溶物。
（10）0.1%溴酚蓝指示剂（全班共用）
（11）脱色液：75 mL冰乙酸+ 50 mL甲醇+ 875 mL H2O（若只配500 mL，各物质减半）
（二）器材
①电泳仪②垂直板电泳槽，电泳板
③微量进样器（50μL）④染色/脱色摇床。
【操作方法】
1.胶板模型的安装：在干净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条（有些型号的电泳板已有固定的隔板），然后将另一块玻璃板压上，用夹子夹紧（或装在制板模型中），在两块板之间滴上热融的10 ％琼脂糖凝胶封边（4）。
2.分离胶的制备[10 ml，可供两块板( 11cm x10 cm)使用]
用手轻摇混匀, 小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（～2.5cm）,轻轻
在顶层加入几毫升去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。
刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25℃室温）。
3.浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备各种体积的浓缩胶溶液：
混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。
4.在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100℃）中加热3分钟，马上插入冰上冷却待用。
5.浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，小心地拔出梳子，用移液器冲洗梳孔，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。
6.按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度而定，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。
本实验系统中需要分离鉴定的是纯化的GFP蛋白，点样样品和次序包括：
蛋白Marker
pUC18细菌总蛋白
pGFP未诱导总蛋白
pGFP加Glu及IPTG诱导总蛋白
pGFP加IPTG诱导破菌后上清总蛋白
层析时的穿流峰（杂蛋白）
层析时的洗涤峰I
层析时的洗涤峰II
GFP对照
7.电泳：开始时电压为5～8V/cm（约100V）凝胶，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压增到10～12V/cm（约180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。8.剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。
9.固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2小时。
10.脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液3-4次，约4-8小时或过夜。
11.将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中。
【注意事项与提示】
（1)丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。
（2）过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的10％过硫酸铵要分装冷藏。
（3）考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染色: 每分子含有两个SO3H 基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。检测灵敏度约为0.2－0.5ug。也可用银染色：将蛋白带上的硝酸银还原成金属银、以使银颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级，但步骤较复杂。
（4）制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的麻烦，还可以同时制备多块凝胶。
（5）AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。
（6）加热使蛋白质充分变性。
（7）用移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋白样品的沉降。
（8）两玻璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。
（9）总量一般不超过20μl，如果点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样品溶解液。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。
（10）电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。
（11）电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致，不能在凹形板双耳处撬，也不能用死力弄坏玻璃板。（12）考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。
（13）脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。
【实验安排】
本实验试剂配制和电泳可在一天内完成，各小组要在上午配好试剂并做好胶，中午或下午即可开始电泳。
【实验报告要求与思考题】
1．就实验中出现的各种问题进行分析讨论。
2．在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?
3．在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用。
4．根据下式计算标准蛋白和待测样品的电泳迁移率，然后以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，其分子量的对数为纵坐标作标准曲线图，根据标准曲线图准确计算待测蛋白的分子量。粗略估计待测蛋白分子量的方法是直接根据凝胶上的分子量标准进行估算。
5．为什么样品电泳前要高温加热？
6．进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？
蛋白质的盐析与透析
蛋白质的盐析与透析 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液。 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。 附：胶棉半透膜的制备 市售5%的胶棉液，加入干燥的150mL锥形瓶中，将锥形瓶横斜不断转动，使瓶的内壁和瓶口都均匀沾有胶棉液。倒出多余的胶棉液，然后倒置约1min使乙醚、乙醇不断蒸发，直到干燥。逐步剥离瓶口的薄膜，沿瓶壁薄膜夹缝注入蒸馏水，使薄膜逐步跟瓶壁胶离，轻轻取出，浸入蒸馏水中备用。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
蛋白质的盐析与透析
蛋白质的分离纯化 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液，双缩脲试剂 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。
盐析法
盐析法综述 摘要：沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种，盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 关键词:沉淀法；盐析；原理；方法评价；蛋白质盐析 沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 对沉淀形式的要求 （1）沉淀的溶解度要小，以保证被测组分能沉淀完全。 （2）沉淀要纯净，不应带入沉淀剂和其他杂质。 （3）沉淀易于过滤和洗涤，以便于操作和提高沉淀的纯度。 （4）沉淀易于转化为称量形式。 盐析法 胶体的盐析 胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低，形成沉底析出的
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
蛋白酶的盐析沉淀实验报告
蛋白酶的盐析沉淀实验报告 班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉 实验目的： 1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素； 2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义； 3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法； 4.学习酶活力的计算方法。 实验原理： 盐析法 在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。 原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜； ②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。 盐析效果： 二价离子 > 一价离子 离子半径小 > 离子半径大 阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN- 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示： 式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度 β—常数，与温度和pH 有关 Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算： 式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定 福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。 蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算 K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为 108.53 680 D .O N K 10 4 ???=酶活力I K S log s -β=2 i i z c 2 1I ∑=
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盐析法沉淀蛋白质的原理 1 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
⑵中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯 度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。 ⑶盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
盐析
盐析 主要内容： 1.盐析原理 2.盐析的优缺点 3.盐析实验步骤 4.分段盐析 5.盐析曲线的制作 6.盐析注意事项 7.盐析的影响因素 8.盐析法应用 9.盐析常见问题分析 盐析原理 一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如：加浓（NH 4）2SO 4使蛋白质凝聚的过程。 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 盐析的优缺点 1. 成本低，不需要特别昂贵的设备。2. 操作简单、安全。3. 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。4.效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化。 盐析实验步骤 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20℃时饱和溶液为754克/升；0℃时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH 常在4.5-5.5之间，当用其他pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。表1几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） 饱和硫酸铵法 1.取x ml 血清加x ml 生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml 饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。 ℃ 20℃80℃100℃（NH 4）2SO 470.675.4 95.3103Na 2SO 4 4.918.9 43.342.2NaH 2PO 4 1.67.893.8101
蛋白质的盐析
蛋白质的盐析 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-
蛋白质的盐析（验证型） 一、实验目的 了解在工业化生产过程中使用（NH4）2SO4的情况，及（NH4）2SO4使用时的注意事项。 二、实验原理 用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有（NH4）2SO4、NaCl 等。高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。 三、器材与试剂 1、发酵溶液 2、10%的三氯醋酸溶液 3、饱和（NH4）2SO4溶液 4、（NH4）2SO4粉末 四、实验步骤 （1）取发酵溶液5ml，加饱和（NH4）2SO4溶液1ml2ml3ml4ml5ml，混匀，静止数分钟，即有白色沉淀析出，应为何物？过滤至清，除去沉淀，滤液备用。取少量沉淀，加H2O看是否复溶？ （2）取滤液0.5ml，加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物？然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测，检测时必须在倒入比色皿以后10秒内读取（为什么？）。（在进行检测时应注意将721分光光度计调整到OD600；在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范围是T值15%以上到70%以下）。 （3）另外，取滤液2.5ml于小烧杯中，加（NH4）2SO4粉末，随加随搅拌，直至（NH4）2SO4不能溶解为止，有白色沉淀产生，应为何物？然后过滤至清，除去沉淀，过滤备用。 （4）将（1）-（3）做的滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和（NH4）2SO4溶液的点。然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测。并且作出曲线。 （5）对大量的发酵液进行处理，在滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。 （6）盐析曲线的制作方法：如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。 五、盐析注意事项： 1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60℃烘干后再称量，这样更准确。 3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。
实验四 蛋白质纯化 盐析沉淀法
实验四蛋白质纯化盐析沉淀法 【实验目的】 采用硫酸铵盐析法将日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白从大肠杆菌BL21（DE3）pGEX-NS53细胞裂解液中分离出来，使学生学习掌握制备细胞裂解液的技术和采用盐析法从中分离目的蛋白质的技术。 【实验原理】 用盐析法从成分复杂的蛋白质溶液（如细胞裂解液）中提取目的蛋白质是一种传统的目前仍被广泛使用的蛋白质分离纯化技术。此种技术的工作原理如下：蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。上述现象是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。 盐析的一般操作步骤是，选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25%饱和度的硫酸铵）使部分杂质呈“盐析”状态从溶液中沉淀出来，经离心法去除。而目的蛋白质呈盐溶状态，存在于上清中。增加盐浓度（如25-60%饱和度的NH4SO4）使目的蛋白质呈盐析状态，而从溶液中分离出来。 在盐析时，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示：S lg = -Ks×I S0 式中的S为蛋白质在离子强度为I的溶解度，S0蛋白质在纯水（离强度为0）中的溶解度；K S为盐析常数。离子强度I可用下式表示： I=1/2∑Z2 式中，M-溶液中各种离子克分子浓度 Z-各种离子所带的电荷数 在温度恒定时，S0对于某一种蛋白质在某一溶液中的溶解度是一个常数，lgS0也为一常数，以β代替，故式（1）可以改写为： lgS= Ks×I （3） β值主要与蛋白质的结构，盐离子的平均半径以及盐离子的电荷数有关，也受溶液中的氢离子浓度（PH值）和温度影响。一般来说，蛋白质在某一盐溶液中的盐析系数--K S越大，盐析效果越好。
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析 还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？ 蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼； 绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀； 还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长…… 幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。 -------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一 我是超级蜘蛛精 看我有劲儿不？ 冲啊，我是美国队长 而我是一只冷静的科研小蜗牛 这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。 硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度
增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的
结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。 各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。 （1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液； 例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH 到7.0。 （2）沉淀蛋白 将样品离心，去除沉淀，保留上清液并测量体积；一边搅拌一边慢慢的加入硫酸
盐析法沉淀蛋白质的原理
“盐析沉淀蛋白质的原理实际上就是通过降低蛋白质的溶解度，从而使得蛋白质凝聚，最终从溶液中析出。蛋白质的沉淀其实就是将蛋白质分子聚集，使得它从溶液中析出的一种现象。” 各种蛋白纯化分离大集合！ 一、沉淀法 1、盐析 实验原理：中和蛋白质表面电荷并破坏水化膜。 蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH -NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1~100 nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。当大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO42- 和NH4+）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之"失水"，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。 2、等电点沉淀法： 实验原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相
互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。 注意点：不同的蛋白质，具有不同的等电点。同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。 3、有机溶剂沉淀法 实验原理：加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。 影响因素：(一)有机溶剂的选择(二)温度的控制(三)pH值(四)离子强度 用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解，以达到降低有机溶剂的浓度的目的。此法在血液制品的制备过程中较多使用。
《蛋白质盐析实验条件的探究》
蛋白质盐析实验条件的探究 黄秋静 广西师范大学化学与药学学院桂林 摘要对影响蛋白质盐析的实验条件进行了探究。认为其中三个主要影响因素为：鸡蛋清溶液的浓度、盐溶液种类、酸的加入顺序，最终总结得出蛋白质盐析实验的适宜条件。 关键字蛋白质盐析实验条件 Inquiry experiment conditions of protein salting out Huang-Qiujing School of chemistry and pharmacy, Guangxi Normal University.Guilin,China Abstract:The experimental conditions affecting protein salting out of the research. The three main factors: the egg white solution concentration, salt solution type, acid addition order, finally summarizes suitable conditions of protein salting out experiment. Key word：protein salting out experiment condition 1 引言 在蛋白质溶液中加入一定浓度的强电解质盐，如(NH 4) 2 SO 4 等，蛋白质从溶 液中析出，这种作用称为盐析【1】。蛋白质盐析是高中阶段的重要演示实验，但实际操作中常常不能出现沉淀。盐析作用的实质是高浓度的强电解质破坏蛋白质分子表面的水化膜，同时电解质离子中和了蛋白质所带的电荷，蛋白质的稳定因素被消除，使蛋白质分子相互碰撞而凝聚沉淀【2】。蛋白质的溶解性受所带电荷和溶液离子强度的影响，而蛋白质所带电荷与溶液的pH有关，溶液离子强度与强电解质的无机盐自身性质有关。因此本文通过改变影响蛋白质溶解性的三个主要因素：鸡蛋清溶液的浓度、盐溶液种类、酸的加入顺序等进行蛋白质盐析实验的探究，以期寻找盐析实验的最佳反应条件。 2 实验内容及结果讨论 2．1 鸡蛋清溶液浓度对盐析的影响 表1 相同盐溶液在不同浓度的鸡蛋清溶液中的盐析
盐析法沉淀蛋白质的原理
一、盐析法的定义： 盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。盐析法主要用于蛋白质的分离纯化。常作盐析的无机盐有硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 简单来说，盐析法就是指在有机大分子或一些有机高分子的溶液中加入无机盐如氯化钠,利用相似相溶原理,使有机物析出的过程.在制乙酸乙酯时用饱和碳酸钠溶液接收,更有利于乙酸乙酯的析出,制肥皂时加氯化钠,肥皂更易析出,在蛋白质溶液中加硫酸铵,使蛋白质析出,都是利用盐析的原理。 二、盐析法的原理： 盐析法的原理是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。 蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。
总之，盐析和变性都会让蛋白质沉淀，但是盐析的条件控制好就不会使蛋白质失去活性，除去溶液中的中性盐就可以重新溶解。蛋白质变性的那就失去了生物活性，三维结构被破坏，某些情况下可以通过复性再次恢复活性，但是目前能够复性的蛋白质是非常少的，条件要求也各不相同。关于盐析和变性的原理，一般情况下我们认为盐析剥夺了蛋白质的水化层并且破坏了它的表面电荷平衡，变性的情况就比较多了，总的来说是让蛋白质本身精巧的结构被破坏，从而让蛋白质失去活性。
盐析法除蛋白质
盐析法除蛋白质 盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水 中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 1 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。λ ②操作简单、安全。λ ③对许多生物活性物质具有稳定作用。λ ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理λ 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图4”所示。λ ⑵中性盐的选择λ 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：λ 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：λ 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）λ 0℃20℃80℃100 ℃λ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2λ
蛋白盐析实验步骤及注意事项
蛋白盐析实验步骤及注意事项 一、实验步骤： 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20度时饱和溶液为754克/升；0度时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 表1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） 饱和硫酸铵法： 1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。 2.4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。 3.置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。 4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 二、注意事项： 1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。 3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。
蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤
蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤 一、注意事项： 1. 盐析的成败决定于溶液的 pH 值与离子强度，溶液 pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 2. 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内 60 摄氏度烘干后再称量，这样更准确。 3. 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 4. 盐析后最好搅拌 40 分钟到一个小时而且再在冰浴中 放置一段时间。3.5 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者 G-25， G-50 处理。 6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。 二、实验步骤： 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它 的优点是温度系数小而溶解度大 (20 度时饱和 溶液为 754 克/ 升;0 度时饱和溶解度为 706 克/ 升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来; 另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常
在 4.5-5.5 之间，当用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 表 1 几种盐在不同温度下的溶解度（克 /100 毫升水） o c 20 C 80 C 100 C （NH4）2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6
蛋白质的盐析
蛋白质的盐析（验证型） 一、实验目的 了解在工业化生产过程中使用（NH4）2SO4的情况，及（NH4）2SO4使用时的注意事项。 二、实验原理 用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有（NH4）2SO4、NaCl等。高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。 三、器材与试剂 1、发酵溶液 2、10%的三氯醋酸溶液 3、饱和（NH4）2SO4溶液 4、（NH4）2SO4粉末 四、实验步骤 （1）取发酵溶液5ml，加饱和（NH4）2SO4溶液1ml 2ml 3ml 4ml 5ml，混匀，静止数分钟，即有白色沉淀析出，应为何物？过滤至清，除去沉淀，滤液备用。取少量沉淀，加H2O看是否复溶？ （2）取滤液0.5ml，加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物？然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测，检测时必须在倒入比色皿以后10秒内读取（为什么？）。（在进行检测时应注意将721分光光度计调整到OD600；在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范围是T值15%以上到70%以下）。 （3）另外，取滤液2.5ml于小烧杯中，加（NH4）2SO4粉末，随加随搅拌，直至（NH4）2SO4不能溶解为止，有白色沉淀产生，应为何物？然后过滤至清，除去沉淀，过滤备用。 （4）将（1）-（3）做的滤液中加10% 三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和（NH4）SO4溶液的点。然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测。并且作出曲线。 2 （5）对大量的发酵液进行处理，在滤液中加10% 三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。 （6）盐析曲线的制作方法：如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH 值，分6～10 次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10 个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。 五、盐析注意事项： 1.盐析的成败决定于溶液的pH 值与离子强度，溶液pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60℃烘干后再称量，这样更准确。 3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 4.盐析后最好搅拌40 分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质，并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和a淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离［3］。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等［6］通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度 梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法 一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果，纯度鉴定证明产品为分子量 约为32 kDa成分是多糖：蛋白质（88 ：12）、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白［1］
盐析法沉淀蛋白质的原理
盐析法沉淀蛋白质的原理 蛋白质的分离纯化工作较为复杂，从细胞中提取的蛋白质或从含有蛋白质的溶液中经过沉淀、梯度离心、盐析等方法得到的蛋白质经常含有杂质。要去除这些杂质，同时又要保持蛋白质的生物学活性，如酶的催化活性，就需要根据不同的蛋白质制定出相应的策略，采用不同的方法。今天重点介绍下盐析法沉淀蛋白质。 盐析法原理 用水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷，增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒，水膜和电荷一旦被除去，蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。 向蛋白质溶液中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）后，蛋白质便从溶液中沉淀析出，这种沉淀作用称为蛋白质盐析。其过程是一个可逆过程，当除去引起蛋白质沉淀因素后，被盐析的蛋白质仍可重新溶于水中，其天然性质不发生变化。 用不同浓度的盐可将不同种类蛋白质从混合溶液中分别沉淀的过程，称为蛋白质的分级盐析。例如蛋清溶液中的球蛋白可被半饱和的硫酸铵溶液沉淀提取，饱和的硫酸铵溶液可使清蛋白沉淀析出。盐析法沉淀出的蛋白并没有失活，所以盐析法常被用于分离和提取各种蛋白质及酶制剂。 影响盐析的因素 （1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。
（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。 （3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 （4）蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。