荧光定量pcr的实验技巧
荧光定量PCR问题疑难解答（一）
两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：
模板提取方法需要改进
3. 样品稀释不准确：
这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度
A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?
A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作
A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮
A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增
A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。
由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。
Q：SG的稳定性如何？
A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和T aq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：
a) SG 浓度b) 引物浓度c) MgCl2浓度d) 温度和反应次数
推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。
Q：荧光定量污染解决办法
A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。
1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；
2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；
3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；
4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；
5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；
6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。
Q：荧光定量real-timePCR重复性问题
A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重复性。
如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。
Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊
A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值减小3.32Cycles。
Q：荧光阈值高，怎么改进？
A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。要调整一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中止循环可以设置为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。
Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系
A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。
Q：real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？
A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
Q：正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？
A：如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。
如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。
如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。
Q：real time PCR无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？
A：我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。
如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。
Q：最佳荧光采集温度
A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。
如果采用TaqMan探针法，由于T aqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可
以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。
如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。
如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。
Q：标准曲线的讨论
A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。而且第一二个梯度没有分开啊。标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。
Q：定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化
A：因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。
做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般情况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！
线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章
评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。
荧光定量PCR问题疑难解答（二）
Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?
A：如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。
Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?
A：我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：
1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！
2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；
3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；
建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！
Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？
A：和我以前做得没消除背景的曲线挺相像。很可能是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！探针设计的问题！还有反应液体试剂酶离子调整。
Q：标准曲线检测限
A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边缘效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。由于定量原理是通过已知浓度的标准品和未知样本之间的比较来进行的，所以各孔位的反应参数可比性决定了定量的准确性。在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差经过多个循环后被放大，最终影响定量结果的准确性。所以ABI仪器只能区分5000个拷贝和10000个拷贝的差异，而且必须用ABI的原装试剂才能达到此效果，如果将模板再稀释，就无法区分这2倍浓度差异了。
你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反应孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做标准曲线。
虽然现在的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设置一切都是最优的情况下才可能做出来，而且一般还有比例。像一般低拷贝检测Ct值不准确的情况还是很正常的，不需要郁闷的说，大家都是这样。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，所以你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，另外，当Ct值大于30的时候结果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会大于30。
Q：溶解曲线3个峰
A：如果出现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，比如提高退火温度，降低引物浓度等。但如果非特异性的峰离目标产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。可以先优化条件，如果没有用的话就试试改变引物。
引物二聚体的几个特征是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，另外是溶解温度基本上低于80度。如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。可以跑个电泳看看。
样本出现双峰，也可以按照上面的判断看看是否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。
可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。
基本上采用染料法的确容易出现引物二聚体，尤其是30个循环之后。如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。
Q：
A：你的实验结果其实很好，是初始模板浓度设置错了。
1. 以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差异为1的时候扩增效率为100%，从标准曲线上来看，你的6个模板Ct差异（标准曲线横轴）还都在1以上一点，已经很好；
2. 你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应该在0.3左右，从图中看，标准曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设置时初始模板的拷贝数是
按照5倍梯度设置的。你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一个标准曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。2倍梯度区分的很好！
Q：只要Ct值大于30都是阴性吗？一开始不用设定吗？
A：看你做什么检测了，还要与对照品比对才能定性分析。不过，一般Ct值大于30结果置信度降低，需要多次确认。
常规修饰基团分子量5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
荧光定量PCR问题疑难解答（三）
Q：溶解曲线出现三个峰，以为是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证实却为一条带，为什么会出现这种结果？
A：我也曾经出现过这个问题，但是我是出现两个峰，后来跑电泳证实是引物二聚体，<100bp的地方隐约出现一个引物二聚体的条带，你跑电泳没有其他条带可能是电泳的灵敏度不够吧，还有引物产生二聚体也不一定只产生一种结构的二聚体啊，可能会产生其他结构的二聚体啊，建议你可以继续设计引物再试试，或者提高退火温度看看！
你的单一条带是不是很宽啊？照图上看来你的非特异性的产物和你的目的产物差不多大。非特异性扩增的条带的Tm值和你的产物的还是有点接近。而且不一定是跑胶都能看到非特异性扩增的。我以前做完后跑胶都没有目的条带，但是扩增曲线还是不错，但是荧光值都比较低。实时定量还是很敏感的。
建议提高温度，如果没有目的条带，就试着调一下镁离子浓度。
Q：最近作Real-time PCR有几个问题请教：
1. 产物可以进行电泳检测吗？
2. 为什么阴性产物进行二次扩增也有较强的荧光信号（据Ct值可判为阳性）？且电泳似乎也有较亮的条带，无法与阳性产物区别。
3.在Ct值无法判断阴性或阳性的情况下（接近或略高于判定阴性值时，有扩增曲线，但Ct 值较大如37、38）如何下结论？
A：1. 荧光定量的结果可以进行电泳检测。
2. 如果阴性有扩增，说明PCR体系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很难消除。
3. 结论根据原来定的标准下，比如原来设定ct>35为阴性，那当ct为36时就不要特意调整标准。确定其为阴性就可以了。
4. 阳性产物做模板ct较低，其原因是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。所以，模板浓度越高，ct越低。
A：1. 产物是可以用来电泳的，不过由于定量PCR借助于荧光的作用灵敏度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；
2. 产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，原因很简单，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高灵敏度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，还有很多是一时想不到的；
3. 如果你是用标准的检测试剂盒，你只需要按说明书来就操作就可以，判断结果同样，如果你还想探究其中的阴性可能漏检的问题，你应该用其他方法，而不能用这个试剂盒了。
Q：通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18~30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时定量PCR，所以也想向各位前辈请教一下有关Ct 值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18~25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12~14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18~30之间呢。
A：没必要吧。一般ct超过30是不好，但要是三个重复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀，内参ct为10~14都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，不过内参ct太低，低于10也是不太好，结果可能会有偏差。
Q：real-time pcr结果可用来发文章的要求有哪些？
A：不用，但是在文章必须说明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把你的实验方法说明白就可以了。简单的一个表示图，就可以发表了。不过REAL-TIME PCR 想用的话最
好放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。
Q：不知道为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20以下产物检测很亮，而普通用mix 酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的原因吗？另外我的NTC荧光在30多个循环的时候都有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。求大家帮帮忙吧！
A：1. 一些公司荧光定量试剂盒的酶是比普通T ag酶要好，主要是可以防止引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。
2. 也可能是你荧光定量的体系比你普通的PCR体系要优化，比如有些公司荧光定量mix 中的Mg离子浓度要高于普通的PCR体系。
3. 可能是跑胶的问题。看看你的MARKER还和以前一样亮吗？
做荧光定量的短片段特别容易污染。可能是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到恰好高过阴性对照。
Q：请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？不知道要怎么稀释比较好呢？
A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。
Q：本人检测的目的基因共有5个处理，每个处理做两次重复，现在的问题每个处理内重复性非常差，有的Ct值差异达到了10，不知道是怎么回事？
A：换了一个退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，现在有一对引物两个温度都还好。基本上能够达到要求了。另外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差异挺大的，因为之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一个，结果差异很大。经验教训啊！
Q：荧光量开始很高A：根据TAKARA的资料说，这是因为摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。但是这张图也能用的，你调整一下基线范围，把背景荧光压下去，这样以来图就漂亮了就能分析了。
Q：刚做了一次real time PCR，结果解离曲线中出现了负值
A：这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来，出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，可能要改变反映条件或者改变引物。荧光定量PCR问题疑难解答（一）
两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：
模板提取方法需要改进
3. 样品稀释不准确：
这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度
A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?
A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作
A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮
A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增
A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。
由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。
Q：SG的稳定性如何？
A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和T aq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：
a) SG 浓度b) 引物浓度c) MgCl2浓度d) 温度和反应次数
推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。
Q：荧光定量污染解决办法
A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。
1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；
2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；
3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；
4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；
5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；
6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。
Q：荧光定量real-timePCR重复性问题
A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重复性。
如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。
Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊
A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值减小3.32Cycles。
Q：荧光阈值高，怎么改进？
A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。要调整一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线
的中止循环可以设置为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。
Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系
A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。
Q：real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？
A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
Q：正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？
A：如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。
如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。
如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。
Q：real time PCR无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？
A：我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。
如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。
Q：最佳荧光采集温度
A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。
如果采用TaqMan探针法，由于T aqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。
如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。
如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。
Q：标准曲线的讨论
A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。而且第一二个梯度没有分开啊。标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。
Q：定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化
A：因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。
做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般情况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！
线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章
评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。
荧光定量PCR问题疑难解答（二）
Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?
A：如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。
Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?
A：我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：
1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！
2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；
3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；
建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！
Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？
A：和我以前做得没消除背景的曲线挺相像。很可能是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！探针设计的问题！还有反应液体试剂酶离子调整。
Q：标准曲线检测限
A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边缘效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。由于定量原理是通过已知浓度的标准品和未知样本之间的比较来进行的，所以各孔位的反应参数可比性决定了定量的准确性。在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差经过多个循环后被放大，最终影响定量结果的准确性。所以ABI仪器只能区分5000个拷贝和10000个拷贝的差异，而且必须用ABI的原装试剂才能达到此效果，如果将模板再稀释，就无法区分这2倍浓度差异了。
你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反应孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做标准曲线。
虽然现在的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设置一切都是最优的情况下才可能做出来，而且一般还有比例。像一般低拷贝检测Ct值不准确的情况还是很正常的，不需要郁闷的说，大家都是这样。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，所以你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，另外，当Ct值大于30的时候结果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会大于30。
Q：溶解曲线3个峰
A：如果出现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，比如提高退火温度，降低引物浓度等。但如果非特异性的峰离目标产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。可以先优化条件，如果没有用的话就试试改变引物。
引物二聚体的几个特征是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，另外是溶解温度基本上低于80度。如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。可以跑个电泳看看。
样本出现双峰，也可以按照上面的判断看看是否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。
可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。
基本上采用染料法的确容易出现引物二聚体，尤其是30个循环之后。如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。
Q：
A：你的实验结果其实很好，是初始模板浓度设置错了。
1. 以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差异为1的时候扩增效率为100%，从标准曲线上来看，你的6个模板Ct差异（标准曲线横轴）还都在1以上一点，已经很好；
2. 你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应该在0.3左右，从图中看，标准曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设置时初始模板的拷贝数是
按照5倍梯度设置的。你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一个标准曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。2倍梯度区分的很好！
Q：只要Ct值大于30都是阴性吗？一开始不用设定吗？
A：看你做什么检测了，还要与对照品比对才能定性分析。不过，一般Ct值大于30结果置信度降低，需要多次确认。
常规修饰基团分子量5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
荧光定量PCR问题疑难解答（三）
Q：溶解曲线出现三个峰，以为是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证实却为一条带，为什么会出现这种结果？
A：我也曾经出现过这个问题，但是我是出现两个峰，后来跑电泳证实是引物二聚体，<100bp的地方隐约出现一个引物二聚体的条带，你跑电泳没有其他条带可能是电泳的灵敏度不够吧，还有引物产生二聚体也不一定只产生一种结构的二聚体啊，可能会产生其他结构的二聚体啊，建议你可以继续设计引物再试试，或者提高退火温度看看！
你的单一条带是不是很宽啊？照图上看来你的非特异性的产物和你的目的产物差不多大。非特异性扩增的条带的Tm值和你的产物的还是有点接近。而且不一定是跑胶都能看到非特异性扩增的。我以前做完后跑胶都没有目的条带，但是扩增曲线还是不错，但是荧光值都比较低。实时定量还是很敏感的。
建议提高温度，如果没有目的条带，就试着调一下镁离子浓度。
Q：最近作Real-time PCR有几个问题请教：
1. 产物可以进行电泳检测吗？
2. 为什么阴性产物进行二次扩增也有较强的荧光信号（据Ct值可判为阳性）？且电泳似乎也有较亮的条带，无法与阳性产物区别。
3.在Ct值无法判断阴性或阳性的情况下（接近或略高于判定阴性值时，有扩增曲线，但Ct 值较大如37、38）如何下结论？
A：1. 荧光定量的结果可以进行电泳检测。
2. 如果阴性有扩增，说明PCR体系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很难消除。
3. 结论根据原来定的标准下，比如原来设定ct>35为阴性，那当ct为36时就不要特意调整标准。确定其为阴性就可以了。
4. 阳性产物做模板ct较低，其原因是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。所以，模板浓度越高，ct越低。
A：1. 产物是可以用来电泳的，不过由于定量PCR借助于荧光的作用灵敏度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；
2. 产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，原因很简单，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高灵敏度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，还有很多是一时想不到的；
3. 如果你是用标准的检测试剂盒，你只需要按说明书来就操作就可以，判断结果同样，如果你还想探究其中的阴性可能漏检的问题，你应该用其他方法，而不能用这个试剂盒了。
Q：通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18~30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时定量PCR，所以也想向各位前辈请教一下有关Ct 值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18~25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12~14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18~30之间呢。
A：没必要吧。一般ct超过30是不好，但要是三个重复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀，内参ct为10~14都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，不过内参ct太低，低于10也是不太好，结果可能会有偏差。
Q：real-time pcr结果可用来发文章的要求有哪些？
A：不用，但是在文章必须说明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把你的实验方法说明白就可以了。简单的一个表示图，就可以发表了。不过REAL-TIME PCR 想用的话最好放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。
Q：不知道为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20以下产物检测很亮，而普通用mix 酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的原因吗？另外我的NTC荧光在30多
个循环的时候都有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。求大家帮帮忙吧！
A：1. 一些公司荧光定量试剂盒的酶是比普通T ag酶要好，主要是可以防止引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。
2. 也可能是你荧光定量的体系比你普通的PCR体系要优化，比如有些公司荧光定量mix 中的Mg离子浓度要高于普通的PCR体系。
3. 可能是跑胶的问题。看看你的MARKER还和以前一样亮吗？
做荧光定量的短片段特别容易污染。可能是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到恰好高过阴性对照。
Q：请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？不知道要怎么稀释比较好呢？
A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。
Q：本人检测的目的基因共有5个处理，每个处理做两次重复，现在的问题每个处理内重复性非常差，有的Ct值差异达到了10，不知道是怎么回事？
A：换了一个退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，现在有一对引物两个温度都还好。基本上能够达到要求了。另外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差异挺大的，因为之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一个，结果差异很大。经验教训啊！
Q：荧光量开始很高A：根据TAKARA的资料说，这是因为摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。但是这张图也能用的，你调整一下基线范围，把背景荧光压下去，这样以来图就漂亮了就能分析了。
Q：刚做了一次real time PCR，结果解离曲线中出现了负值
A：这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来，出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，可能要改变反映条件或者改变引物。
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR原理和实验
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
实时荧光定量PCR全方位解析
实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧
荧光定量PCR实验指南(一)
荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从https://www.360docs.net/doc/b09383162.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定
比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：
（3）Ct值： CT值的重现性：
5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR操作步骤
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对定量方法实际操作 （三种常用方法） 本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看对照组目的 基因平均Ct 对照组看家 — 待检样品目 ——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例：
荧光定量PCR全攻略
荧光定量PCR完全攻略 1、什么是定量PCR？ 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 2、定量PCR定量的理论依据是什么？ 特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果：Y=X×2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。 3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？ PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。 PCR扩增通式：① T n=T0（1+E）n ② T n=Tn-1（1+E）n 注：[0 实时荧光定量PCR： 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 原理： 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性） 2.TaqMan探针法： 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)； 3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录； 5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。 收费标准 优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量） （含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系 实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项1、开始运行仪器 1.1打开电脑 1.2打开定量PCR仪底座开关 1.3启动CFX Manager软件 2、放置样品 2.1将PCR反应体系加入到0.2ml底缘八联管，盖上管盖；或加入底缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须戴一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 3、设置程序，运行试验 3.1定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（protocol tab）b.设置反应板文件（plate tab）。c.点击‘‘start run’’键，运行程序。 3.2热循环程序文件（protocol tab）设置指南：点击edit（编辑）或create new （创建新程序）。 3.3反应板设置文件（plate tab）设置指南：选择本次试验所需要使用的荧光染料种类；单机样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（standard），点击‘‘dilution series’’键可设置其标准品浓度及稀释倍数。 3.4点击‘‘start run’’键。单击open lid（打开热盖）或close lid（关闭热盖）放置样品；单击start run，保存文件，开始运行程序。 4、结果分析 4.1PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和CT值等。 4.2如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。 4.3点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。 5、关闭运行仪器 5.1实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电 源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。 荧光定量PCR详细流程和问题解析 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案， 确认文件 类别：确认方案编号： 部门：质量部页码：共11页，第1页 DA7600PCR扩增仪 方案与报告 版次：新订替代： 起草：年月日 审阅会签： （确认小组） 批准：年月日 目录 1.概述 (2) 2.确认目的 (2) 3.确定确认范围 (3) 4.确定确认小组成员及职责 (3) 确认小组成员及确认小组负责人 (3) 人员 (3) 评价方法： (3) 标准： (3) 5.风险评估 (4) 评估概述 (4) 评估方法 (4) 6.确认内容 (7) .安装确认 (7) 安装信息 (7) 仪器放置检查 (7) 操作规程等资料确认 (8) 运行确认 (8) 基本称重功能确认 (8) 校正功能确认 (9) 性能确认 (9) 准确度 (9) 天平重现性检查： (10) 四角偏差检查： (11) 7确认计划安排 (11) 9.确认结果评定与结论 (11) 10.拟订日常监测程序及确认周期 (12) 1.概述 DA7600实时荧光定量PCR仪，是中山大学达安基因公司推出的具有全自动、实时监测、定量分析的DNA荧光检测系统。结合半导体致冷器实现PCR扩增过程，并通过高灵敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时监测，实现同时对样品的扩增和检测。友好的全中文计算机界面，可满足不同PCR实验的需求。其反应速度及准确性、操作实用性和使用灵活性均有较好的提高，能满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求，是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。它主要有一台DA7600和PC计算机及显示器组成。 2.确认目的 通过用HCV荧光PCR检测试剂盒来确认DA7600实时荧光定量PCR仪的扩增和检测体系精密度、线性、准确度等，验证仪器能否正常准确运行，给出可靠的分析结果，以及48孔孔间差异是否在允许范围内。 3.确定确认范围 本方案适用于DA7600实时荧光定量PCR仪运行确认及性能确认。 4.确定确认小组成员及职责 确认小组成员及确认小组负责人 列出参加DA7600确认的所有人员名单，评价培训情况是否符合操作的要求。 评价方法： 查阅培训档案，确认是否对有关操作者进行了相关培训，包括： 前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。 荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR 样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法 选择单通道实验还是多通道实验？ 这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。实时荧光定量pcr步骤
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