siRNA解答

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吉玛公司提供的siRNA是双链的还是单链的?

吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。

吉玛公司RNA寡核苷酸使用什么纯化方法?

吉玛公司运用国际上通用的HPLC纯化,如果特殊需要可以进行PAGE纯化。

合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少?

目前RNA寡核苷酸的最大长度是40碱基。

我们需要提供什么信息用于siRNA的合成?你们可以帮助免费设计吗?

您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物,或者您也可以提供相应地基因的GeneID 或者Accession Number,由我们公司技术人员为您免费设计。

如何选择siRNA的悬垂组成?

悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。

针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效?

一般siRNA都具有物种特异性,很少与其他物种有相同的靶位点,所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。然而,也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效,

这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。

你们提供的siRNA是怎样装运的?如果在常温下放置了一个星期,还有效吗?

吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的,在常温下运输。这些冻干的样品在室温下能稳定保存2-4个星期,所以放置一个星期不会影响其沉默效果。但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷

冻箱中。

在体外实验中,需要多少量的siRNA?

我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经

足够了。

用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率,我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗?增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。高浓度的siRNA将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率来自于合理的设计,在100nM 甚至更低的浓度都可能有75%的沉默效率。另外,低的转染效率会导致低的沉默效率,建议您更进一步优化siRNA的导入条件。

定量RNA的公式是什么?

研究者可以用Beer法则定量RNA:吸光度(260nm)=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。为了便于理解,等式变为:浓度=(吸光度,260nm)/[(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)]。当使用一个标准的10mm

比色皿时,在公式中路径长度这个变量等于1。

6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有多少ug的siRNA?

首先计算含有多少nmol的siRNA:

a. 等式: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L);

b. 单位换算: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol);

c. 答案: ? nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量(13,300 g/mol)把nmol变为ug:

a. 等式: ? ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol);

b. 单位换算: ? ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g);

c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。

我需要浓度为20uM的样品,如何计算重悬siRNA缓冲液的量?

样品浓度的计算如下:(siRNA的量,nmol)/(重悬体积,uL)=样品浓度,umol/L。在解答前应先统一单位,确保单位可以抵消。例如:您购买了20nmol的siRNA,想溶解为50uM的样品。可按以下方法计算重悬缓冲液体积:a. 等式: (20 nmol)/ ? uL = 50 umol/L;b. 解答未知量: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol);

c. 单位换算: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L);

d.答案: ? uL = 400 uL。因此,应该使用400uL缓冲液去重悬20nmol的siRNA,溶解后为50uM的样品。

一定需要阴性对照吗?

是,阴性对照是RNA干扰实验中不可缺少的。由于在超过200 nM的浓度下,siRNA有可能会导致非特异性的压力反应,在实验体系中必需设置阴性对照。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的RNAi的结果。由于siRNA的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照,研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由RNAi引起的基因特异性沉默。

常用的阴性对照有哪些类型?

常用的阴性对照大体分为两种,一种是使用通用阴性对照序列,该序列已经被上千篇文章使用;另一类是使用和靶基因siRNA打乱序列的siRNA作为阴性对照,这样的阴性对照和通用序列相比较,一方面是按照定制产品价格合成的,另一方面,由于打乱序列是没有经过验证的序列,有可能会产生off-target现象。因此,除非有非常特殊的要求,最好使用通用序列作为阴性对照。

在阴性对照体系中和实验体系中观察到同样的实验结果,这是什么原因?

这个结果充分说明了设置阴性对照的必要性。该结果表明您所观察到的表型不是序列特异性knockdown产生的表型,您需要降低siRNA的工作浓度。

为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要?

阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。通常最好的阳性对照是内在的对照。

你们能提供预先合成的siRNA对照么?

可以。吉玛能提供许多预先合成的用于RNA干扰实验的对照双链。

用于对照的siRNA的最佳浓度是多少?

阳性对照和阴性对照的siRNA的浓度都应该与基因特异性的siRNA的浓度相同。

不同工作浓度下1OD siRNA可以使用多少次

工作浓度 1 OD siRNA可以使用孔数(孔)

96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板100mm dish

5nM 5000 2500 1000 500 250 50

10nM 2500 1200 500 250 125 25

20nM 1250 625 250 125 60 12

50nM 500 250 100 50 25 5

100nM 250 125 50 25 12 2

150nM 160 80 30 15 8 1

200nM 120 60 25 12 6 1

300nM 80 40 16 8 4 -

400nM 60 30 12 6 3 -

在siRNA 上进行标记的最佳位点在哪里?

反义链的5'端标记会影响siRNA的沉默活性,所以不推荐标记这个位点。在其他三个末端进行标记对沉默活性几乎没有影响。有研究表明正义链的5'端标记是最有效的化学合成位点。

荧光标记的siRNA是不是可以作为良好的对照?如何检测荧光标记的siRNA?

已经有为数不少的实验室研究过荧光标记的siRNA的荧光检测结果和knockdown效率之间的正相关关系。荧光标记双链是最常用的优化转染条件的方法。可以用流式细胞仪或者荧光共聚焦显微镜检测标记的siRNA。

荧光素的最大吸收率和发射率各在哪个波段?

荧光素在495nm处有最大吸收率,在520nm处有最大发射率。

如何筛选转染试剂?

好的转染试剂有以下特点:1、对siRNA有较高的转染率;2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。

转染过程中发现大量细胞死亡,我应该如何处理?

如果出现细胞大量死亡,意味着您的转染条件仍然需要优化:

转染条件的优化一般包括以下几个方面:

1. 调整转染试剂的浓度;

2. 在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液,

3.调整细胞的生长状态;一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性;

4.调整转染试剂和siRNA的比例;

如果同一管转染试剂在不同实验中对细胞的毒性有差异,一般说来应该是实验过程本身带来的差异;

如果已经做了以上几项工作,转染效率仍然得不到提高,建议您更换一种转染试剂。

如何将siRNA导入到细胞内?

使用什么样的转染方法,很大程度上取决于您使用的细胞系:

1.贴壁的、易转染的细胞,我们推荐使用RNAi-mate;

2.悬浮的或原代的细胞,我们推荐使用电击转化方法;

3.电击转化效率仍然很低的细胞,需要选择载体系统。

上海吉玛除提供化学合成的siRNA以外,还提供完整的载体系统,请参阅产品资料。

我的课题主要是研究细胞凋亡相关基因,我手上有一些新基因需要使用RNA干扰进行深入研究,我该如何选择对照系统?

用RNAi进行pathway研究,是RNAi主要应用之一。在这样的课题中,对照系统的选择尤其重要。已经发表的和已经验证的siRNA为RNA干扰研究提供了系统性对照。用RNAi进行细胞凋亡相关基因的研究,以往已经有众多的文献报道,可以查阅上海吉玛网站www.吉玛公司.com。

我刚刚开始接触RNA干扰技术,从文献上看,不同细胞应该选用不同的转染试剂,不同的研究目的,应该使用不同的siRNA,我的经费有限,如何有效确定我的研究体系?

在开始RNA干扰研究之初,需要确定以下几个方面:

使用化学合成的siRNA还是使用载体构建shRNA?我们推荐您使用化学合成的方法来筛选有效的目的片段,然后把您筛选出来的目的片段插入到载体,进行抗性筛选,得到稳定表达的细胞株,再做长期研究。

反义核酸和RNAi有何差异?

反义核酸和RNAi从作用原理到使用的范围都有很大差异。这里只能做一个简单的介绍:从原理上说,反义核酸是一段与靶基因配对的单链DNA或类似DNA的片段与靶基因结合,结果阻止靶基因的转录或是翻译,以往的研究表明在反义核酸的研究中,序列的有效性和有效序列的非特异性往往有比较高的正相关性,这

就在一定程度上限制了反义核酸的应用。

RNAi的作用机理是双链的RNA进入细胞内,导致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以选择在高度特异针对靶基因的位置,也就为RNAi作为药物研究提供了高效、低副作用的空间。自从RNAi技术问世以来,国外很多专业从事反义核酸研究的公司都纷纷转向RNAi研究, ISIS是一个非常就有代表性的例子。他们认为,如果使用反义核酸可以进行的研究,以及反义核酸可以涉及的研究领域,RNAi均可以毫不示弱的开

展,并且应该会得到更加令人满意的结果。

我使用合成的双链DNA克隆载体,但是测序结果不正确,是DNA合成的问题,还是其他问题?

首先,质量良好的、并且是退火状态良好的dsDNA是克隆成功的关键因素。一般情况下,需要挑不止一个克隆测序(通常是2个以上),如果两个克隆的序列都是错误的,并且错误的碱基是相同的,那么基本可以确定是DNA oligo合成的问题. 如果两个克隆的不同碱基发生错误,有可能是合成片段本身的问题,也有可能是克隆过程造成的问题,可以再多挑1~2个克隆测序确证。大多数情况下,两个阳性克隆中,一般至少会有一个克隆是正确的,这种个别碱基在个别分子中的错误是合成和克隆过程9共同造成的,但一般发

生的几率较低。

我计划使用RT-PCR检测基因knockdown结果,之前应该注意哪些问题?

我们推荐RT-PCR的引物应该设计在target位置的两侧,而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割,切割导致靶mRNA的降解,由于切割和降解可能具有不同的时间点,因此,设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。

另外,RT-PCR结果会因为靶基因mRNA降解时间不同、细胞内靶基因mRNA丰度不同而导致假阴性结果,特别对于丰度较高的基因,推荐使用的检测方式包括定量PCR、Northern检测、western检测等。这些方法

会更加真实的反映RNAi的结果。

开始体内实验前需要注意什么问题?

体内实验设计包含动物模型的选择、给药途径、剂量和给药次数等等。siRNA使用的数量及浓度主要取决于给药靶点的性质,诸如肿瘤的类型,组织的类型,靶基因表达水平,动物模型个体大小等等,针对不同

的研究模型,最好先查阅相关资料。

在体内研究中,最好的给药途径是什么?给药频率是多少?

寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用ALZET微小泵持续给药。大剂量给药时要慎重,因为已有研究表明:一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关,快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死,所以给药时要注意观察。很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。任何给药方式都需要优化,以确保最佳的导入方式和动物的健康。一般拿静脉注射来说,每天注射一到两次,连续注射一到两周。

上海吉玛合成的siRNA是否可以用于动物水平的实验?

上海吉玛的siRNA经过严格HPLC纯化,已经被用户通过局部注射用于小鼠的体内实验,并且得到满意的实

验结果。

小鼠体内实验需要多少siRNA?

迄今为止还没有明确的siRNA体内实验使用量的计算方式,在实验前最好先从文献中查询是否已经有相关的文章发表。对于常规实验,一般使用100 μL的注射体积,浓度为10 to 500 μM。原先用antisense的研究表明,当剂量大于20 mg/kg/day (416 mM)时,会观察到明显的毒性。最好针对您的实验绘制剂量反应

曲线。

常规情况下,给药剂量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作为优化起点。需要注意的是,这个剂量只是一个预实验的起点,最后的给药剂量取决于动物模型、靶基因、靶组织和给药方式

等因素

沉默效果不理想,应该如何处理?

最常见的影响沉默效果的两个原因是:转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA 或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求,可能是因为siRNA序列

设计的效果不理想。

为什么使用载体导入shRNA?

在哺乳动物细胞中,RNAi可以通过直接导入特异阻断所选择基因表达的分子而诱导,导致产生基因功能缺失表型。这些分子可以通过化学合成、体外方法制备或者细胞内DNA模板产生。前两种方法只能用于瞬时阻断,可能很难导入难以转染的、不分裂的或者原代细胞类型。通过载体导入pol III 启动子表达的短的发夹RNA(shRNA)扩展了RNAi实验的选择,包括稳定和可诱导表达以及病毒导入。

为什么使用pol III型启动子?

使用pol III型启动子是为了有效表达shRNA。这些pol III型启动子包含了表达RNA上游所有的必要的元件,而且在一个短的多聚胸苷区内终止。一旦shRNA被表达,它被转移出细胞核,在细胞质中被Dicer

加工成siRNA。Dicer优先识别由 pol III型启动子产生的shRNA,因为它们不带有5’或者3’两侧连接的序列。siRNA进入RISC复合体中,在哺乳动物细胞中产生RNAi效应。

H1启动子和U6启动子有什么差别?

上海吉玛的supersilencing shRNA 载体分别使用Pol III依赖H1或者U6的启动子。尽管H1和U6是polⅢ 型启动子,然而可能根据使用细胞系的不同,效率有些小的差别。

是否可以插入到真核表达质粒载体中?

可以,这些载体都是真核表达载体,根据国外的经验,质粒载体的knockdown作用一般仅持续一周左右,一周后被down的RNA水平即恢复原有水平,其机制尚未阐明。推荐使用逆转录病毒载体达到稳定转染的效

果。

一般设计多少bp的siRNA,以及转录的终止子?

因为人工合成siRNA价格太高,现在经常采用RNAi expression vector,抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III启动子时转录终止码为5'-TTTTT-3',而使用Pol II启动子则为polyA。其实这两种终止码都不能完全避免通读(readthrough)现象的发生。现在RNAi多用前者,是因为其较短,不形成复杂的空间结构;

后者因为较长,形成的空间结构可能会对抑制序列发卡结构的形成构成空间阻碍或产生遮挡效应。

如何使用Pol III启动子制备RNAi表达载体

目前发表的RNAi表达载体大多采用3型Pol III启动子,如human/mouse U6启动子等。其中人U6启动子有几个明显的特点:1.具有TATA box,位于-30~-25bp,被Pol III转录;2.在转录起点上游-66~47bp处存在PSE(proximal sequence element),该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点;3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element);4.启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号;

5.PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率;

6.+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点,在使用U6启动子构建RNAi表达载体时,U6启动子的长度最好在300bp左右,尽量不改变PSE和DSE的间距,同时保留TATA box和+1位的G,在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

如有兴趣可以利用同尾酶设计poly-RNAi表达载体,从而可以观察同时knockdown两个或多个基因表达后产生的效应。若是条件允许,可以对U6启动子进行shuffling,筛选具有特殊用途的突变的Pol III启动

子。

为什么RNAi表达载体的克隆有时无法测序?

可能原因是stem的长度刚好和primer相当,所以primer退火时hairpin结构也形成,从而影响测序。分析一下发现它与stem的长度及序列有关。冷泉港推荐改变sense strand上几个碱基,使其在DNA水平不

互补,但RNA却能利用G-U互补形成hairpin。

human u6 promoter 表达框,是如何设计的?

human U6 promoter表达框包括human U6 promoter、终止码TTTTT和中间自行设计的抑制序列或抑制序列的发卡结构。从人基因组中可以扩增出U6 promoter,后面的序列全部自己设计。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM,检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性,实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例,选取50nM的siRNA工作浓度,介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂,请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天,按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中,使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致,使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔,避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等,调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品(每个培养孔),按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: (1)配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释,轻轻混匀。(*siRNA的用量计算参照表1) (2)配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀,取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释,轻轻混匀,室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 (3)孵育完成后,将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物,在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊,属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中,轻轻混匀。 注意:转染前无需更换新鲜培养基,直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要,也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理,如加药等,可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意:加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基,但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大,可根据细胞的状态,在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

siRNA说明书

产品以冻干粉的形式,常温运输。收到产品后,请于-20 C?-80 'C保存,冻干粉可以稳定保存一年。 使用前请瞬时离心,用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20,配制成20gM储存液,分装保存,避免反复冻 融(尽量不超过5次)。 表120 gM储存液的配置参考 使用前须知 为避免外界因素(包括酶,极端pH或者温度条件等)导致产品降解,所有操作请严格遵循RNA操作规则。 实验过程中,产品最好于冰上放置,使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。 细胞实验方法 为了降低细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验可靠性和可重复性,一般建议: a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔; b. 接种细胞时,每孔接种的细胞数量尽量保持一致,并且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度: siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM,转染后检测时 间为24?72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化,优化的范围建议为5~100nM。 2. 转染步骤: 以Iipofectamine2000(简称Iipo2000)转染siRNA于24孔板,转染浓度为50nM为例,其他规格容器转染 请参考表2。 1)转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,每孔中加入不含抗生素的培养基,使转染时的细胞 密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意: 转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细胞活力,降低细胞的转染效率。 2)对于每个转染样品,请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液: a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I (v1)稀释g I20 gM siRNA储存液,轻轻混匀,室温孵育5min ; b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I (v1)稀释1 g Ilipo2000,轻轻混匀并室温孵育5min ; c. 将a与b轻轻混匀,室温孵育20min(溶液可能会有浑浊,但不会影响转染)。 注意:稀释好的Iipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低,应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。另在混合试剂时,请勿剧烈吹打或振荡,手指轻弹管壁即可,过度用力可能会破坏脂质体的结构, 甚至影响siRNA-lipo2000 混合物的形成。 3)将siRNA-Iipo2000混合液加入含有细胞的400 gl培养基(v2)的培养孔中,轻轻混匀; 4)(可选)培养4?6h后,将孔中含siRNA-Iipo2000混合液的培养基移去,更换新鲜培养基; 5)(可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理);

锐博siRNA产品说明书

siRNA使用说明(2009-08) 名称: 常规化学合成siRNA。 产品简介: 常规化学合成siRNA为21-25nt,带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA(3'端悬垂通常为dTdT或者UU,也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂)。 产品剂量经过严格测算,以摩尔数标明。产品剂型为冻干粉,即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理,只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。 保存和使用: 保存: 液体剂型,siRNA的贮存浓度一般为20μM,-20℃或-70℃保存半年以上; 冻干粉剂型,-20℃或-70℃保存一年以上。开盖前,请先稍稍离心,将粉末收集管底,再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water,配制成20μM的液体剂型。 例如:20nmolsiRNA冻干粉,需要加入1ml水溶解(其他剂量可以按照比例计算加水量)。 注意:(1)液体剂型产品,应避免反复冻融(尽量不要超过5次),建议溶解后的产品分装保存。(2)如果近期不做实验,产品需要长期放置,最好以冻干粉形式保存。 使用: 产品使用时(转染过程),siRNA最好冰上放置,使用完毕,请于-20℃或-70℃小心保存; 整个实验过程,要求无RNA酶环境,枪头、EP管都要经DEPC处理; 特别提示:荧光标记siRNA要求避光。 使用方法: 1. siRNA的转染浓度:推荐的siRNA转染浓度是50nM,客户可根据实验具体情况优化转染浓度,优化的范围可以是10~150nM。 (siRNA及转染试剂的建议用量,请参照“实验指导”)。 2. 使用lipofectamine2000(Invitrogen)转染siRNA的步骤(仅供参考): (1) 转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样, 因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),请使用无抗生素的培养基。 注意:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细胞活力,从而降低细胞的转染效率。而细胞密度过低则可能达不到生长的要求,也会因此影响转染效率。 (2)对于每个转染样品,按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液(试剂的用量和体积,请参照“实验指导”): a. 稀释转染试剂lipofectamine2000(以下称lipo2000):使用前,将lipo2000转染试剂轻轻摇匀,然后取适量,用不含血清 的优化培养基(Opti- MEMⅠ)稀释,轻轻混和,室温孵育5min; b. 稀释siRNA:用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA,轻轻混和; c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后,将之与上述(b)稀释好的siRNA轻轻混和,室温培养20min以形成siRNA-lipo2000 混和物,溶液可能会有浑浊,不过不会影响转染。 注意:稀释好的lipo2000,如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低,应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。 (3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中,轻轻摇晃,使之混和; (4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间(24~96h)。沉默效率的检测一般建议的时间为24~72h。 可选操作(并非必要的操作):转染操作完成,经过37℃培养4~6h后,可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去,更换新鲜的生长培养基,这样也不会影响转染的效率。 注意:如果转染时使用的是不含血清的培养基(即血清饥饿的条件下进行转染),4~6h后必须换成完全培养基(含血清、含抗生素),以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测:siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解,因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。 一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用RT-PCR(半定量)或Real-time PCR(定量)。 4. 蛋白水平的检测:蛋白水平的检测一般需要借助抗体(针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体)或报告基因系统检 测,检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。一般说来,检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响,一般从48h开始检测,在36、48、72、96h,甚至更长时间之后多点采样。

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin:siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22

Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA),随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

jetPRIME转染试剂说明

Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.360docs.net/doc/b812088794.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11)

siRNA转染常见问题解答

siRNA转染常见问题解答 SiRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。其中,化学转染技术是目前最为常用的方法,由于电转的方法对细胞损伤比较大,一般不建议选择电转。 针对最常见的化学转染技术,有几种常见的问题以及解决方法。 一、哪种转染试剂效果好? 在选择转染试剂时,一般要考虑的是结合特定的细胞株,而不是被导入细胞中的物质。选择细胞毒性小,转染效率高的转染试剂。脂质体试剂的毒性较大,建议选择非脂质体的转染试剂,如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。 二、转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件? 转染后细胞死亡,原因也是多样的,如脂质体毒性,转染浓度过高,转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生,这种情况下就需要适当优化转染条件;在优化转染条件时需要考虑以下因素:转染试剂和细胞特有的自身条件。例如:siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。一般说,转染试剂毒性小,转染时所需的细胞密度就小,如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度,而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。如果经优化后细胞死亡仍很多,应及时考虑更换转染试剂。 三、如何优化siRNA与转染试剂的比例? SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化,一般选择24孔板进行优化,比 较节省各种试剂。可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平,如30nM, 50nM,80nM,100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合,从中选择转染效率最高的组合用于接下 来的实验。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话,siRNA的最低终浓度 不要低于10nM,一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。这里需要说明的是,以

lip2000转染说明书

4. 哺乳动物细胞siRNA转染 4.1 转染方法: 将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种:磷酸钙共沉淀;电穿孔法;DEAE-葡聚糖和polybrene;机械法;阳离子脂质体试剂。目前用的最多的是阳离子脂质体法。 4.1.1 磷酸钙共沉淀 将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 4.1.2 电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异,据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般,成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高)的毒性。 4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 4.1.4 机械法 转染技术也包括使用机械的方法,比如显微注射和基因枪(biolistic particle)。显微注射使用一根细针头将DNA,RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 4.1.5 阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的(平均大小约100-400nm)单层脂质体。这些脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称,一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。

RFect小核酸转染试剂说明(单核细胞 转染)

RFect 小核酸转染试剂 货 号:11011: 0.5ml 11012: 1.0ml 储存条件:-20℃ 11013: 1.5ml 产品特点 应 用 产品介绍 RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ,转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞,如一般细胞株、肿瘤细胞株等。目前,无论国外还是国内,转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI),这两种成分都具有很大的细胞毒性,并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料,毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸转染试剂相比,RFect 的细胞转染阳性率一般在90%以上,Lamin A/C 基因抑制效率在95%以上,而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一般不超过70%,Lamin A/C 基因抑制效率不超过75%。RFect 细胞毒性很低,转染细胞死亡率不到10%,而其它品牌试剂的转染细胞死亡率一般在30%以上。血清对转染效果没有影响,不必刻意添加或更换培养液。有关RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利,并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。 操作步骤:本说明书适用于24孔培养板的转染实验,其他规格的培养板的用量参照下面表格,表格给出的是每孔的用量与体积。 A. 细胞接种:转染前一天接种细胞,每孔 500 μl 培养基(不可加抗生素),使细胞在转染时密度在30-50% 。 B. siRNA-RFect 混合物准备: 1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。 2. 2μl RFect 用50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀,室温孵育5min 。注意:确保在25 min 内执行第三步操作,不要过于延迟。 3. 孵育5min 后,将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合(总体积100μl )。轻轻混匀,室温孵育20 min 。 C. 将混合物加到培养的细胞内(完全培养基培养): 1. 将100μl 混合物加入培养孔内,培养孔内含有0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板,混匀。 2. 37°C 培养18-72h ,检测基因抑制效果。如果需要,细胞培养4-6h 时可以更换培养基,但不是必须。孵育时间的长短,取决于细胞类型、 所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。 转染实验要点: ● 转染过程不可添加抗生素,否则会导致细胞死亡; ● 首次实验siRNA 的用量可稍大(一般10 nM ) ,后续实验根据实验结果修改。 RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels Culture vessel Surface area/well (cm 2) Vol. of growth medium (μl) Vol. of dilution medium (μl) siRNA Amount (pmol) RFect (μl) 96-well 0.3 100 2 x 10 1.2 0.4 48-well 0.8 250 2 x 25 3 1 24-well 2 500 2 x 50 6 2 12-well 4 1000 2 x 100 12 4 ◎卓越的细胞转染性能:细胞转染阳性率高达90%以上,基因敲除效果明显,A549细胞Lamin A/C 基因敲除效率在95%以上 ◎极低的细胞毒性:转染细胞死亡率不到10%,大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响 ◎转染细胞范围广,绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染 ◎200bp 内的小分子DNA 转染

转染试剂使用注意事项.doc

转染试剂使用注意事项 1.细胞密度:转染DNA(质粒)时,细胞密度为80-100%,转染RNA(siRNA 或miRNA)时,细胞密度为60-80%,具体细胞密度必须结合考虑核酸种类、转染试剂种类和细胞生长密度极限; 2.DNA用量:0.5-1ug/孔(以24孔板为例),具体用量根据转染效率检测实验 确定; 3.RNA用量:10-30 pmol/孔(以24孔板为例),具体用量根据转染效率检测实 验确定; 4.转染试剂的用量:转染试剂说明书推荐了一个使用范围,具体用量根据转染 效率检测实验确定; 5.根据转染效率检测实验确定核酸的用量及转染试剂的用量(核酸与转染试剂 的比例关系),转染效率检测实验一般在24孔板中进行,其他格式的培养器皿请根据底面积的比例(表1)进行计算; 6.转染试剂使用前才从4℃中取出,取用前,先短暂离心(转速达到3000RPM 时即可停止),然后放在涡旋振荡器上点动混匀三次,每次持续1秒,混匀后短暂离心(转速达到3000RPM时即可停止),上述措施是为了混匀转染试剂,保证使用效果,使用后立即放回4℃保存; 7.核酸和转染试剂分别用Opti-MEM(这是专用的转染稀释培养基,如果没有 Opti-MEM,可以用细胞对应的基础培养基代替)稀释,稀释的核酸可以通过弹匀,吹打均匀,颠倒混匀或涡旋点动混匀(三次,每次持续1秒),稀释的转染试剂可以通过弹匀,颠倒混匀或涡旋点动混匀(三次,每次持续1秒),不可使用吹打均匀;混匀后均需短暂离心; 8.把稀释的核酸和稀释的转染试剂复合混匀时,应该把稀释的核酸加入稀释的 转染试剂中(顺序不可调转);加入后立即进行(不要耽搁)弹匀或颠倒混匀(稀释的核酸和稀释的转染试剂一旦复合,转染复合物的形成立即启动,如果不及时混匀,所形成的转染复合物的效率就会很低),先不进行短暂离心,待所有的管子复合完毕后,在一起进行涡旋点动混匀三次,每次持续1秒,然后短暂离心; 9.转染复合物孵育形成时尽量避光室温或37℃放置;

siRNA说明书

使用前须知 为避免外界因素(包括酶,极端pH或者温度条件等)导致产品降解,所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中,产品最好于冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。 细胞实验方法 为了降低细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验可靠性和可重复性,一般建议: a.转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔; b.接种细胞时,每孔接种的细胞数量尽量保持一致,并且细胞在各孔的表面平均分布。 1.转染浓度: siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM,转染后检测时间为24~72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化,优化的范围建议为5~100nM。 2.转染步骤: 以lipofectamine2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板,转染浓度为50nM为例,其他规格容器转染请参考表2。 1)转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,每孔中加入不含抗生素的培养基,使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细胞活力,降低细胞的转染效率。 2)对于每个转染样品,请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液: a.稀释siRNA:用50μl不含血清培养基Opti-MEMⅠ(v1)稀释μl20μM的siRNA储存液,轻轻混匀,室温孵育5min; b.稀释lipo2000:用50μl不含血清培养基Opti-MEMⅠ(v1)稀释1μllipo2000,轻轻混匀并室温孵育5min; c.将a与b轻轻混匀,室温孵育20min(溶液可能会有浑浊,但不会影响转染)。 注意:稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低,应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。另在混合试剂时,请勿剧烈吹打或振荡,手指轻弹管壁即可,过度用力可能会破坏脂质体的结构,甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。 3)将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400μl培养基(v2)的培养孔中,轻轻混匀; 4)(可选)培养4~6h后,将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去,更换新鲜培养基; 5)(可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理);

说明RFectSP悬浮细胞小核酸转染试剂(THP-1 转染)

RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂说明 货 号:BIOG-11024: 0.5ml BIOG-11025: 1.0ml 储存条件:-20℃ BIOG-11026: 1.5ml 产品特点 产品介绍 RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂是我公司研发团队在RFect PM 原代细胞小核酸转染试剂的基础上加以改进研发成功的专门用于悬浮细胞小核酸转染的试剂。RFect SP 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ,可转染绝大多数悬浮细胞。目前,无论国外还是国内,悬浮细胞的核酸转染都是个热点难题,市场还缺乏真正有效的商品化的悬浮细胞小核酸转染试剂。RFect SP 能够高效转染绝大多数悬浮细胞,获得比较理想的基因敲除效果。对于大多数悬浮细胞,RFect SP 的细胞转染阳性率都在75%以上,而转染细胞死亡率不到10%。RFect SP 的使用也极其简便,先将sRNA 与RFect SP 室温混合,再将siRNA-RFect SP 混合物直接加入含培养基的细胞,血清对转染效果没有影响,不必刻意添加或更换培养液。有关RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利,并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。 操作步骤:本说明书适用于24孔培养板的转染实验,其他规格的培养板的用量参照下面表格,表格给出的是每孔的用量与体积。 A. 细胞接种:转染前一天接种细胞,每孔 500 μl 培养基(不可加抗生素),使细胞在转染时密度在30-40% 。 B. siRNA-RFect SP 混合物准备: 1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。 2. 2μl RFect SP 用50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀,室温孵育5min 。注意:确保在25 min 内执行第三步操作,不要过于延迟。 3. 孵育5min 后,将siRNA 稀释液与RFect MN 稀释液混合(总体积100μl )。轻轻混匀,室温孵育20 min 。 C. 将混合物加到培养的细胞内(完全培养基培养): 1. 将100μl 混合物加入培养孔内,培养孔内含有0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板5min ,混匀。 2. 37°C 培养48-72h ,检测基因抑制效果。如果需要,细胞培养4-6h 时可以更换培养基,但不是必须。孵育时间的长短,取决于细胞类型、 所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。 转染实验优化: 为了提高转染效率,最好对转染条件进行优化,特别是首次使用。例如:24孔培养板,调整 siRNA 与RFect SP 试剂的用量。siRNA 用量在6-60 pmol (final concentration 10- 100 nM)之间调整,RFect SP 试剂用量在1.0 - 3.0μl 之间调整。 转染实验要点 ● 转染过程不可添加抗生素,否则会导致细胞死亡; ● 首次实验siRNA 的用量设置在终浓度10nM 、30nM 、50nM 、100 nM 进行摸索 ,后续实验根据实验结果修改。 储存和运输 蓝冰运输,4°C 保存,长期不用于-20°C 储存,避免反复冻融 有效期 -20℃保存条件下,有效期为1年 质量控制 本产品经严格的质量检验证明,无生物污染 注意: 本产品仅用于科研实验 RFect SP Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels Culture vessel Surface area/well (cm 2) V ol. of growth medium (μl) V ol. of dilution medium (μl) siRNA Amount (pmol) RFect MN (μl) 96-well 0.3 100 2 x 10 1.2 0.4 48-well 0.8 250 2 x 25 3 1 24-well 2 500 2 x 50 6 2 12-well 4 1000 2 x 100 12 4 6-well 10 2500 2 x 250 30 10 ◎卓越的悬浮细胞转染性能:细胞转染阳性率一般在75%以上,基因敲除效率在80%以上; ◎极低的细胞毒性:转染细胞死亡率不到10%,大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响; ◎转染细胞范围广,绝大多数悬浮细胞都能获得比较理想的转染结果。

软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择

软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因,就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA),抑制或封闭该致病基因的表达,从而达到治疗疾病的目的。siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域,也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外,siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域,进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。 siRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。其中,化学转染技术是目前最为常用的方法,由于电转的方法对细胞损伤比较大,一般不建议选择电转。化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择,目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。如何选择合适的转染试剂,一般可从以下几个方面考虑: 一、对siRNA有较高的转染效率。转染效率的确定,常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平,因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞,还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来,发挥抑制基因表达的作用。通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题:1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果;2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞,但不能充分释放,导致基因抑制效率并不高。因而,判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平,仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判,影响实验的进展。目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等,其中,Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌,RFect转染试剂虽在国内生产,但实际上是在美国研发成功,拥有国际发明专利。就转染效率而言,RFect与RNAiMAX对绝大多数贴壁细胞的基因抑制效率都比较高,RFect在A549细胞中对LaminA/C的基因抑制效率可达95%,RNAiMAX在A549细胞中对LaminA/C的基因抑制效率也能到90%,与之相比,Lipo2000的抑制效率只有70%左右。显然,从转染效率上说,RFect与

siRNA产品使用说明

siRNA产品使用说明RN:R10043.5 产品简介 常规化学合成siRNA为21~25nt的双链小分子RNA,即用型。 运输保存 产品以冻干粉的形式,常温运输。收到产品后,请于-20℃~-80℃保存,冻干粉可以稳定保存一年。 使用前瞬时离心,用RNase-free H O或灭菌ddH2O,配制成20μM储存液,分装保存,避免反复冻融(不超过5次)。 2 表1 20μM储存液的配置参考 siRNA(nmol) 0.25 0.5 1 2 5 20 溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注:如需进行高通量筛选试验,可选择siRNA Library。 使用前须知 为避免外界因素(包括酶,极端pH或者温度条件等)导致产品降解,所有操作请严格遵循RNA操作规则。实 验过程中,产品最好于冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。 细胞实验方法: 为了降低细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验的可靠性和可重复性,一般建议: 1)转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔; 2)接种细胞时,每孔接种的细胞数量尽量保持一致,且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度: siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。锐博生物推荐的siRNA初始转染浓度为50nM,转染后检测时间为24~72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化,优化的范围建议为5~100nM。 2. 转染步骤: 以ribo FECT? CP Reagent 转染 siRNA于24孔板,转染浓度为50nM为例,其他规格容器的试剂用量请参考表2。1)接种细胞 a.贴壁细胞:以Hela细胞为例,接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基(v1)的24孔板培养孔中,使转染时的细胞密度能够达到30~50%。 b.悬浮细胞:以THP1细胞为例,接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基(v1)的24孔板培养孔中。 注:1)不同细胞生长速度不同,接种细胞的数量,细胞密度需要依据细胞类型,培养时间,实验目的而定;2)每孔接种的细胞数量应尽量相同,使细 胞均匀分布。 2)转染步骤 对于每个转染样品,请按以下步骤准备: a. 稀释siRNA:用30μl 1X ribo FECT?CP Buffer(v2)稀释1.25μl 20μM siRNA储存液(v3),轻轻混匀。 b. 混合液制备:加入3μl ribo FECT?CP Reagent(v4),轻轻吹打混匀,室温孵育0~15min。

RFect小核酸转染试剂说明(单核细胞 转染)

RFect 小核酸转染试剂 货 号:11011: 0.5ml 11012: 1.0ml 储存条件:-20℃ 11013: 1.5ml 产品特点 应 用 产品介绍 RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ,转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞,如一般细胞株、肿瘤细胞株等。目前,无论国外还是国内,转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI),这两种成分都具有很大的细胞毒性,并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料,毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸转染试剂相比,RFect 的细胞转染阳性率一般在90%以上,Lamin A/C 基因抑制效率在95%以上,而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一般不超过70%,Lamin A/C 基因抑制效率不超过75%。RFect 细胞毒性很低,转染细胞死亡率不到10%,而其它品牌试剂的转染细胞死亡率一般在30%以上。血清对转染效果没有影响,不必刻意添加或更换培养液。有关RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利,并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。 操作步骤:本说明书适用于24孔培养板的转染实验,其他规格的培养板的用量参照下面表格,表格给出的是每孔的用量与体积。 A. 细胞接种:转染前一天接种细胞,每孔 500 μl 培养基(不可加抗生素),使细胞在转染时密度在30-50% 。 B. siRNA-RFect 混合物准备: 1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。 2. 2μl RFect 用50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀,室温孵育5min 。注意:确保在25 min 内执行第三步操作,不要过于延迟。 3. 孵育5min 后,将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合(总体积100μl )。轻轻混匀,室温孵育20 min 。 C. 将混合物加到培养的细胞内(完全培养基培养): 1. 将100μl 混合物加入培养孔内,培养孔内含有0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板,混匀。 2. 37°C 培养18-72h ,检测基因抑制效果。如果需要,细胞培养4-6h 时可以更换培养基,但不是必须。孵育时间的长短,取决于细胞类型、 所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。 转染实验要点: ● 转染过程不可添加抗生素,否则会导致细胞死亡; ● 首次实验siRNA 的用量可稍大(一般10 nM ) ,后续实验根据实验结果修改。 转染实验优化: 为了提高转染效率,最好对转染条件进行优化,特别是首次使用。例如:24孔培养板,调整 siRNA 与RFect 试剂的用量。siRNA 用量在0.6-30 pmol(final concentration 1- 50 nM)之间调整,RFect 试剂用量在1.0 - 3.0μl 之间调整。客户可按照习惯用量进行预实验,如实验结果不理想,可适当调整并摸索转染试剂用量。 储存和运输 蓝冰运输,4°C 保存,长期不用于-20°C 储存,避免反复冻融 有效期 -20℃保存条件下,有效期为1年 质量控制 本产品经严格的质量检验证明,无生物污染 注意:本产品仅用于科研实验 RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels Culture vessel Surface area/well (cm 2) Vol. of growth medium (μl) Vol. of dilution medium (μl) siRNA Amount (pmol) RFect (μl) 96-well 0.3 100 2 x 10 1.2 0.4 48-well 0.8 250 2 x 25 3 1 24-well 2 500 2 x 50 6 2 12-well 4 1000 2 x 100 12 4 6-well 10 2500 2 x 250 30 10 ◎卓越的细胞转染性能:细胞转染阳性率高达90%以上,基因敲除效果明显,A549细胞Lamin A/C 基因敲除效率在95%以上 ◎极低的细胞毒性:转染细胞死亡率不到10%,大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响 ◎转染细胞范围广,绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染 ◎200bp 内的小分子DNA 转染

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