ViiA7 荧光定量PCR系统的特点与优势

ViiA7 荧光定量PCR系统的特点与优势
ViiA7 荧光定量PCR系统的特点与优势

Applied Biosystems ViiA? 7 实时荧光定量

PCR系统特点

仪器型号:Applied Biosystems ViiA? 7 实时荧光定量 PCR 系统

仪器描述:ViiA? 7 实时荧光定量 PCR 系统将 96 孔板、384 孔板或 TaqMan? Array Card 的兼容性与全自动机器上样相结合。

制造商:Life Technologies

Life Technologies 是ViiA? 7 实时荧光定量 PCR 系统 (部件代号:4453536、4453537、4453545、4453546) 的独家制造家和供应商。

技术概述

实时荧光定量 PCR 概述

聚合酶链式反应 (PCR) 是一种功能强大的技术,可将 DNA 或 cDNA 靶点扩增达一百万倍。实时荧光定量 PCR 在有荧光染料存在的条件下扩增靶点,仪器―实时‖捕获荧光信号,测定每个循环中存在多少拷贝的 DNA。利用实时荧光定量 PCR 仪对运行过程中扩增的靶点量的监测能力,可以实现十分精确、灵敏和准确的定量检测,以测定反应中的起始拷贝数。

实时荧光定量 PCR 可呈指数型扩增 DNA,使每个扩增循环中存在的分子数倍增。荧光信号的增加与反应指数期生成的 PCR 产物的量直接成正比。将最终产量与已知标准进行比较,利用循环数和PCR 终产物的量计算遗传物质的起始量。

使用的荧光报告基因包括双链 DNA (dsDNA) 结合染料或在扩增过程中掺入扩增产物的、与 PCR 引物或探针结合的染料分子。实时荧光定量 PCR 仪通过绘制荧光与循环数曲线,生成扩增曲线,表示在整个 PCR 反应过程中积聚的产物。

实时荧光定量 PCR 应用

Applied Biosystems ViiA? 7 实时荧光定量 PCR 系统仅限研究之用,不得用于任何动物或人的治疗或诊断。

实时荧光定量 PCR 极为灵活,适用于下列研究应用领域:

基因表达

?基因分型

?拷贝数变异

?病原体检测、菌株分型和病毒载量

?突变筛查 (高分辨率熔解)

?甲基化及其它表观遗传学应用领域

?miRNA 图谱分析

?利用邻位连接分析的蛋白质分析

?环境污染物检测的质量控制

?生物燃料开发

实时荧光定量 PCR 的优点

与其它方法相比,实时荧光定量 PCR 的优点包括:

?能够实时监控 PCR 反应的进程

?能够精确测定每个循环的扩增片段数量

?较其它核酸检测方法具有更大的检测动态范围

?在单管中同时实现扩增和检测,无需 PCR 后处理

在过去的数年中,实时荧光定量 PCR 已成为 DNA 或 RNA 检测和定量的主要工具。采用上述技术,您可以实现精确的检测,其准确度低至 1.5 倍范围,动态范围达 9 个数量级。由于实时荧光定量 PCR 可提供高质量的数据,因此它常被用于确认其它核酸分析方法 (包括芯片分析) 的结果。

ViiA? 7 系统具有下列特点和优势:

仪器

1. 仪器可与 TaqMan? Array Card 兼容,该微流体设备包括 384 个反应室,以标准 384 孔的

形式排列。微流体设备带有 8 个不同的上样口,每个上样口需要 1-100ng RNA 转变为

cDNA,并连接至 48 个反应室。每个反应室需要 <2uL 的反应体积。

2. 仪器提供至少四 (4) 个用户可更换的加热模块,可容纳 96 孔、快速 96 孔体积、384 孔板

或 TaqMan? Array Card。模板更换后,无需现场服务或重新校准。

3. 仪器的用户可更换加热模块可从仪器前方进行操作,有助于最大程度地增加台面空间,且

无需工具即可更换加热模块。

4. 仪器包含一个用户可更换光源,可方便地从仪器前方更换。光源平均寿命为 2,000 小时。

5. 仪器可在 100V-240V 电压下工作,无需修改或使用特殊的插头。

6. 仪器包括加热盖组件,它可以加热样品板的顶部,并提供高效密封以防止反应混合物蒸

发。

机载计算机

7. 仪器可在独立模式下运行,无需连接计算机。

8. 仪器包括一个触摸屏界面,其中储存有实验方案,可用来快速运行仪器,且无需计算机。

9. 在仪器的触摸屏界面上,可利用 USB 接口上传实验方案或下载运行文件。

10. 仪器具有机载存储能力,最小容量为 100 个标准绝对定量运行文件,可在网络或供电中断

时提供最大的运行保护。

11. 可通过触摸屏定制仪器,包括校正日期/时间格式、时区、逗号/小数点分隔符以及服务/校

准通知设置。

性能

12. 仪器采用荧光5’ 核酸酶分析和快速化学试剂,在标准 384 孔板内完成 40 次循环的实时荧

光定量 PCR 反应只需不到 35 分钟。仪器采用标准化学试剂还可在标准升降温模式运行。

13. 仪器包括OptiFlex? 系统,其结合了 6 个激发 (450–670 nm) 和 6 个发射 (500–720 nm)

滤光片组,可在一次运行中采集多达 21 种独特的波长组合,用于进行多重分析。

14. 仪器支持至少两种均质的反应试剂——采用 TaqMan?探针的5’ 核酸酶分析和 SYBR?

Green DNA 结合染料试剂。

15. 仪器带有实时荧光定量 PCR 安装规格,能够鉴别出 5,000 至 10,000 个模板拷贝,置信度

达 99.7%。

软件

16. 仪器包括免费软件许可,可采集并分析荧光数据,适用于绝对定量、相对定量、存在/不存

在分析及等位基因分型/SNP (单核苷酸多态性) 检测。

17. 通过收集不同的 PCR 滤光片颜色与熔解曲线平台,仪器软件可允许在一次运行中同时使

用 TaqMan?和 SYBR?试剂。

18. 仪器软件包括一个基因分型优化工具,其利用实时数据帮助选择基因分型检出的最佳循环

数,节省了运行循环和时间。

19. 仪器软件提供了原始荧光数据和多组分 (根据染料类型分类) 数据,用于解决实验中的疑难

问题。

20. 利用仪器软件可实现 Applied Biosystems 7900HT 软件实验方案的转换。

21. 用户利用仪器软件可同时分析至多 150 个实验。

22. 仪器软件可通过同一网络的远程计算机控制仪器并分析仪器数据。

23. 仪器软件可一次提供 15 台仪器的状态监控和 4 台仪器的实时运行曲线。

24. 仪器软件可将附有完成的运行文件的电子邮件通知发送给用户,或者在仪器启动、停止或

逾期未校准时发送文本信息。

25. 仪器软件允许至多 10 位不同用户同时监控 1 台仪器。

26. 仪器软件包括一个ReadiApp? 按钮,可链接至常用的应用领域以快速启动运行,如拷贝

数变异、miRNA 基因表达和 SNP 基因分型。

27. 仪器软件提供了 Excel、文本和 7900 HT 模板文件的导入性能。

28. 用户利用仪器软件只需点击鼠标 3 次甚至更少,即可启动运行。

29. 仪器软件能够导入反应板的标准曲线,用于分析另一反应板的性能。

30. 仪器软件提供了适用于基因表达实验的内源性对照选择工具。

31. 仪器软件包括诸如 Box-Whisker 曲线等统计学分析工具,用于评估 Ct 分布,以及散射图

和热图,用于评估样品相关性和质量。

32. 用户可利用仪器软件预先选择需要导出的数据以及导出文件的位置。

33. 仪器软件支持命令行功能,可批量导出分析的运行文件。

34. 仪器软件允许用户保存预定义的分析设置,自动导出运行数据至他们选择的格式,包括

7900HT 软件和 RDML (实时数据标记语言,遵循 MIQE 指南) 导出格式。

35. 仪器软件包括可选的安全和审计模块,以方便遵循美国联邦法规第 21 章第 11 节的特定要

求。

36. 仪器软件包括可选的高分辨率熔解应用,用户可以指定变异簇/变异数,保存其定义的控制

和分析设置。

37. 仪器附带引物和探针设计软件。

设计

38. 仪器带有机器人手臂,能加载并卸载反应板。集成装置提供了自动化仪器操作,可操作多

达 110块 384 孔反应板、100 块 TaqMan Array 微流体芯片、50 块 96 孔反应板或 60 块快速 96 孔反应板。仪器包括应用程序接口 (API),可通过编程控制仪器。

39. 仪器符合 cUL (已经过 CAN/CSA 标准测试)、UL、CE、C-TICK、WEEE 标准。

40. 仪器是遵照 ISO 13485 标准中的质量体系要求开发制造的。

供应商服务与支持

41. 仪器自安装之日起可享受一年有限保证 (或自运输之日起 15 个月——以先到日期为准)。

经厂方培训的服务工程师负责所有维修。可享受可选的延长质保服务合约,包括下一个工作日现场维修。

42. 购买仪器的用户可享受由认证技术科学家 (现场应用专员) 提供的一天基础用户培训课程。

43. 供应商可提供进行实时荧光定量 PCR 和 SNP 基因分型所需的全部耗材,包括与荧光5’

核酸酶分析结合使用的 PCR 试剂、与 SYBR? Green I 染料分析试剂结合使用的 PCR 试

剂、荧光探针、反应板和反应板密封盖膜。PCR 试剂还提供可选的参比荧光 ROX 染料,以使孔间差异最小化。

44. 供应商提供了全面的分析设计和开发指导原则,适用于实时荧光定量 PCR 和 SNP 基因分

型分析。

45. 供应商提供电话技术支持和现场应用/销售/服务支持,帮助解决在实时荧光定量 PCR 和

SNP 基因分型过程中遇到的试剂和仪器问题。

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位:200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断,还是研究药物对基因表达水平的影响,或者监控药物和疗法的治疗效果,定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物,一方面提高了灵敏度,另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定CT值,从而根据CT值确定起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同,定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化,得到的结果是百分比;绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同,荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言,探针杂交技术在原理上更为严格,所得数据更为精确;荧光染料技术则成本更为低廉,实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同,是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正,以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因,这一点在实践中往往被轻视或忽视,需要着重强调。当然,与定性实验一样,定量PCR也要设立阴性和阳性对照,以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确? 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程,但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,PCR的效率越来越低,产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后,PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制。所以,即使是重复实验,各种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的,波动很大(图1)。

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测,如果存在DNA污染时,要用DNase I进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解,建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀,37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制: 1)称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中,向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水,放微波炉里溶化。 2)待冷却到60摄氏度左右时,加入1ml甲醛,摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。 2.取各个RNA样品4μl,加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀,加入变性胶加样孔中。3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察,照相保存。 4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带,无DNA条带污染。 四.RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介 一.实时荧光定量PCR的基本原理 理论上,PCR过程是按照2n(n代表PCR循环的次数)指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中,随着反应的进行由于体系中各成分的消耗(主要是由于聚合酶活力的衰减)使得靶序列并非按指数方式扩增,而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法(利用EB染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物(mRNA)的起始拷贝数,实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中,靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号,实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle(循环),“t”代表检测threshhold(阈值),其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数;也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数,y代表Ct值)。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响,因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量,这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度),可以看到Ct值具有很好的重复性,而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外,采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的,当实验完成后即可获得定量结果,

实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤

实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件,然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时,请输入: 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中,单击Target Name列中的一个单元格,并输入: c. (可选)单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中,单击Sample Name列中的一个单元格,并输入: c. (可选)单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. (可选)定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中,单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列,以便为该生物学平行测定组添加注释。 注:实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量pcr步骤: 荧光定量PCR 实验步骤:①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:RNA溶于40 μl DEPC

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA 沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

以下实验步骤仅供参考: 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下: RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为: 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。 2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS,pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考: 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心乙醇(75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下: RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为: 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。 2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS,pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR: 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。 原理: 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性) 2.TaqMan探针法:

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单,提供待检基因相关信息; 2.签订技术服务合同,支付预付款(30-50%); 3.设计合成定量PCR引物(或客户提供文献引物委托本公司合成); 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录; 5.PCR预实验,主要检测引物的特异性和扩增效率; 6.正式定量实验:对所有样品上机检测; 7.实验结果和数据分析,形成报告。 收费标准 优惠包干价:120元/样/基因(SYBRgreenI法,相对定量) (含RNA提取,反转录,引物合成费用,上机测试费用(3个重复);一个内参免费(内参3个重复) 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系

CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项

CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项1、开始运行仪器 1.1打开电脑 1.2打开定量PCR仪底座开关 1.3启动CFX Manager软件 2、放置样品 2.1将PCR反应体系加入到0.2ml底缘八联管,盖上管盖;或加入底缘96孔板,用光学级封膜封好。注意,必须戴一次性塑料手套,不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 3、设置程序,运行试验 3.1定量PCR软件操作基本步骤为:a.设置热循环程序文件(protocol tab)b.设置反应板文件(plate tab)。c.点击‘‘start run’’键,运行程序。 3.2热循环程序文件(protocol tab)设置指南:点击edit(编辑)或create new (创建新程序)。 3.3反应板设置文件(plate tab)设置指南:选择本次试验所需要使用的荧光染料种类;单机样品类型;如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品(standard),点击‘‘dilution series’’键可设置其标准品浓度及稀释倍数。 3.4点击‘‘start run’’键。单击open lid(打开热盖)或close lid(关闭热盖)放置样品;单击start run,保存文件,开始运行程序。 4、结果分析 4.1PCR反应结束后,软件会自动计算标准曲线和CT值等。 4.2如需进行表达量分析、等位基因分析等,在软件窗口选择相应分析功能。 4.3点击右上方的“Report”键,还可输出结果报告单。 5、关闭运行仪器 5.1实验结束后取出反应管,顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电 源,关闭电脑。注意!CFX仪器上盖部分为全自动控制,在通电状态,严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为,此类行为会导致上盖故障,危及仪器使用。

DA7600实时荧光定量PCR仪确认方案模板

确认文件 类别:确认方案编号: 部门:质量部页码:共11页,第1页 DA7600PCR扩增仪 方案与报告 版次:新订替代: 起草:年月日 审阅会签: (确认小组) 批准:年月日

目录 1.概述 (2) 2.确认目的 (2) 3.确定确认范围 (3) 4.确定确认小组成员及职责 (3) 确认小组成员及确认小组负责人 (3) 人员 (3) 评价方法: (3) 标准: (3) 5.风险评估 (4) 评估概述 (4) 评估方法 (4) 6.确认内容 (7) .安装确认 (7) 安装信息 (7) 仪器放置检查 (7) 操作规程等资料确认 (8) 运行确认 (8) 基本称重功能确认 (8) 校正功能确认 (9) 性能确认 (9) 准确度 (9) 天平重现性检查: (10) 四角偏差检查: (11) 7确认计划安排 (11) 9.确认结果评定与结论 (11) 10.拟订日常监测程序及确认周期 (12)

1.概述 DA7600实时荧光定量PCR仪,是中山大学达安基因公司推出的具有全自动、实时监测、定量分析的DNA荧光检测系统。结合半导体致冷器实现PCR扩增过程,并通过高灵敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时监测,实现同时对样品的扩增和检测。友好的全中文计算机界面,可满足不同PCR实验的需求。其反应速度及准确性、操作实用性和使用灵活性均有较好的提高,能满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求,是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。它主要有一台DA7600和PC计算机及显示器组成。 2.确认目的 通过用HCV荧光PCR检测试剂盒来确认DA7600实时荧光定量PCR仪的扩增和检测体系精密度、线性、准确度等,验证仪器能否正常准确运行,给出可靠的分析结果,以及48孔孔间差异是否在允许范围内。 3.确定确认范围 本方案适用于DA7600实时荧光定量PCR仪运行确认及性能确认。 4.确定确认小组成员及职责 确认小组成员及确认小组负责人 列出参加DA7600确认的所有人员名单,评价培训情况是否符合操作的要求。 评价方法: 查阅培训档案,确认是否对有关操作者进行了相关培训,包括:

免费实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR实验操作步骤 以下实验步骤仅供参考: 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心乙醇(75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数×40 μg/ml。具体计算如下: RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为: 35 μl ×0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。 2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS,pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:

荧光定量PCR流程和操作原理(收集整理)

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断,还是研究药物对基因表达水平的影响,或者监控药物和疗法的治疗效果,定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物,一方面提高了灵敏度,另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定CT值,从而根据CT值确定起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同,定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化,得到的结果是百分比;绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同,荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言,探针杂交技术在原理上更为严格,所得数据更为精确;荧光染料技术则成本更为低廉,实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同,是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正,以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因,这一点在实践中往往被轻视或忽视,需要着重强调。当然,与定性实验一样,定量PCR也要设立阴性和阳性对照,以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1为什么终点定量不准确? 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程,但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,PCR的效率越来越低,产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后,PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制。所以,即使是重复实验,各种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的,波动很大(图1)。

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