23对ISO6358_2等温容器放气法的评说和建议(下载)
恒温扩增技术综述
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 关键词：恒温扩增；PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA 原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA 可用于非
等温滴定量热法
等温滴定量热法(ITC)的简易操作流程： ①样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。 a.实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使 用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴 定误差； b.样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA) 的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再 次确认所配样品的浓度是否符合要求； c.在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及 DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。 ②仪器的清洗。 a.在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左 右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变； b.样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml 左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净； c.注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清 洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA的小试管，步骤同注射器的 清洗。 ③设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为 了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。
等温滴定量热法应用
Example 2：Isothermal Titration Calorimetry for AIDS Drug Development 艾滋病药物的等温滴定量热法 人们付出了大量努力，试图利用药物帮助艾滋病受害者减少艾滋病流行所造成病毒感染。热力学通过热力学解释实验热-滴定数据为此作出了贡献。如图2-1所示，在艾滋病毒感染人体细胞后，产生一系列艾滋病毒的复制步骤。受感染的细胞表达蛋白和蛋白酶；蛋白酶的作用在于蛋白酶切割聚蛋白，裂解的蛋白重新组装得到一个新的艾滋病病毒。 图2-1 HIV蛋白酶在病毒复制过程中合成新的病毒 为了防止形成新的病毒，可通过引入药物使使HIV蛋白酶失活。这种药物叫做蛋白酶抑制剂，可阻止多聚蛋白的分裂，如图2 – 2所示。 图２-２通过一直HIV蛋白酶从而组织新病毒的生成 蛋白酶和抑制剂的关系可以用传统的锁钥机制描述，如图2 – 3所示。抑制剂必须有正确的形状才能进入艾滋病毒蛋白酶的活性位点，其中，抑制剂是“钥匙”，必须保证适合蛋白酶这把“锁”。
然而，因为突变，艾滋病毒蛋白酶的活性位点可以以不同的形式存在，如图2 - 3所示；原株的活性位（锁）用“十”字表示，突变株活性位点（锁）用六边形表示。我们需要寻找一种同时适合这两种形状的“锁”的药物（钥匙），不仅可以和原株蛋白酶的活性位点结合也与突变株蛋白酶的活性位点结合。热力学可以帮助识别最佳候选药物。 图２-３传统“锁-匙”机制 图2-4列出两种候选药物1和2。药物2比1具有更好的适应性，同药物1相比的，它具有不对称的功能；甲苯基团的称性比叔丁基弱。此外，药物2更灵活，因为它有两个可旋转的键，而药物1只有一个。不对称和灵活性为药物提供了额外的构象，可以适应一个艾滋病毒突变位点。 图２-４两种候选药物１和２ 为定量衡量药物的效果，Ｏhtaka和Freire利用等温滴定量热（ITC）的热力学分析数据得到所需结果。 用A表示艾滋病毒蛋白酶，B表示抑制剂（药品）。我们定义一个解离常数Kd和它的倒数，缔合常数Ka，下标d表示分离，ａ表示缔合。 其中，[]代表在水溶液中物质的浓度。对于好的药物,我们希望Kd很小或者Ka很大。在A + B ----AB的反应中，A(蛋白酶)和B(抑制剂)的结合由标准焓和标准熵决定。上o标表示标准状态。
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例 1．LAMP引物的设计： LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F 3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因 的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基 因的B3c区域互补。 如图所示：
2．扩增原理 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c 结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C 所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
等温滴定量热法的实验操作
Video Article Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity Michael R. Duff,1, Jordan Grubbs1, Elizabeth E. Howell1 1Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee Correspondence to: Elizabeth E. Howell at lzh@https://www.360docs.net/doc/c82272153.html, URL: https://www.360docs.net/doc/c82272153.html,/video/2796 DOI: doi:10.3791/2796 Keywords: Molecular Biology, Issue 55, Isothermal titration calorimetry, thermodynamics, binding affinity, enthalpy, entropy, free energy Date Published: 9/7/2011 Citation: Duff,, M.R., Grubbs, J., Howell, E.E. Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity. J. Vis. Exp. (55), e2796, doi:10.3791/2796 (2011). Abstract Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given. Video Link The video component of this article can be found at https://www.360docs.net/doc/c82272153.html,/video/2796/ Protocol Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well established technique that can determine all the thermodynamic parameters (affinity, enthalpy and stoichiometry) of a binding interaction in one experiment.1 ITC works by titrating one reactant into a second reactant under isothermal conditions. The signal measured is the heat released or absorbed upon interaction (binding) of the two reactants. A series of injections are performed and the heat signal will approach zero as the limiting reactant becomes saturated. Fitting of the isotherm gives the thermodynamic parameters. Several reviews are available that describe the instrumentation as well as the math of data collection and analysis. 2,3 While other calorimeters are available (most notably the ITC200 with small volumes), here we describe a general protocol for the VP-ITC manufactured by MicroCal (now part of GE Healthcare). 1. Preparing Samples 1.In order to prepare the macromolecule and ligand in buffer, some potential issues need to be addressed. Accurate fits require proper concentrations of the macromolecule, the species that typically goes in the sample cell of the ITC, and ligand, the species in the injection syringe. Because some proteins aggregate at the high concentrations needed for the species in the injection syringe, most often the protein is loaded into the sample cell. The optimal macromolecule concentration is determined from "c", the product of the predicted affinity of the system, which can be estimated using orthogonal methods prior to using ITC, and the total macromolecule concentration, where c = K a*[M]. Optimal values of c range from 10-1000, 1 though it is possible to get accurate data for weak-binding systems under specific experimental conditions with c-values below the lower limit.4 Thus, the macromolecule concentration must be determined with this range of c values in mind (i.e., for a K a of 106 M-1, macromolecule concentrations of 10 to 1000 μM should be used). Prior knowledge of the binding affinity of the system can help minimize the protein used for ITC through better design of the ITC experiment. The concentration of the ligand should be large enough (7-25 fold more concentrated than the K d for the weakest ligand binding site) so that saturation occurs within the first third to half of the titration. Accurate fitting of the data also requires saturation of the signal. For systems with higher binding affinity, a lower ligand concentration should be used to avoid saturation too early in the titration, which will give inaccurate fits. Once the heat of dilution control (i.e. titration of ligand into buffer) has been subtracted from the titration, the enthalpy at saturation should approach zero. 2.Because small molecule impurities can give rise to artifactual signals in the ITC measurements, it is best, if possible, that the macromolecule and ligand be exhaustively dialyzed against buffer. Alternatively, column chromatography, desalting spin columns, or buffer exchange centrifugal filters (for example, Centricons) can be used to change the buffer of the macromolecule. If the ligand is a small molecule, it can be prepared using the dialysis buffer after the macromolecule has been dialyzed or by dialyzing against dialysis membranes with cutoffs suitable for small molecules (i.e. 100-500 Da for a Spectra/Por Float-A-Lyzer). Differences in the buffer composition between the ligand and macromolecule solutions can lead to signal artifacts from the heat of the dilution of impurities in the samples. After preparation, check to make sure the pH of the buffer, macromolecule and ligand match (± 0.05 pH units) as artifacts in the enthalpy can arise due to buffer protonation effects.5 Make sure to prepare enough of each species. For triplicate experiments and a dilution control, the amount of material needed will depend upon the ITC used. But, for most ITC instruments that have approximate 2 ml volume sample cells, at least 6-7 ml of
结构化学实验-itc等温量热滴定
一、实验目的： 1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用 2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作 3.简要分析实验结果。 二、实验原理： 在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。 MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。从而获得亲和力以及相关热力学数据。 通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线： 图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。 决定曲线形状的主要参数是C值： C = 滴定池中的蛋白浓度/ K D = [M]t/ KD × N
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介 等温滴定量热法在生命科学研究中应用 申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！ 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。 ITC的应用范围 蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；…… 加样体积：（实际体积） cell：1.43 ml，syringe：300 μl 准备样品体积（最少量） cell：2 ml，syringe：500 μl
环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸.
文章编号:1001-764X(201105-378-03 ·研究生园地·环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸* 沈会平1,张耀祺1,杨坚2,石磊1,陈涛3,李国周4,赵红波5,莫自耀5(1．华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;2．迪澳生物科技有限公司,广州510663;3．广东省结核病防治研究所,广州510630;4．东莞市慢性病防治院,广东东莞 523008;5．广州医学院呼吸疾病国家重点实验室,广州510230 摘要:目的建立一种快速准确的检测结核分枝杆菌(MTB核酸的环介导等温扩增(LAMP方法。方法以重复插入序列IS6110为目的基因,设计LAMP引物,特异检测MTB核酸。用本法与痰涂片抗酸染色镜检法、实时荧光PCR法对100例可疑患者痰标本进行对比检查。结果LAMP法特异性强,仅扩增MTB复合群核酸;灵敏度高,检测限达100fg;而实时荧光PCR 检测限为1pg。对100例疑似结核病患者痰液标本检测,涂片抗酸染色法、LAMP法、实时荧光PCR法的阳性率分别为28%、39%和38%。结论本研究建立的LAMP方法检测MTB核酸特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为临床快速检测MTB的新方法。 关键词:结核分枝杆菌;环介导等温扩增法;IS6110基因;实时浊度仪 中图分类号:R378．91文献标志码:A Rapid detection for Mycobacterium tuberculosis by loop-mediated isothermal amplification SHEN Hui-ping1,ZHANG Yao-qi1,YANG Jian2,SHI Lei1,CHEN Tao3,LI Guo-zhou4,ZHAO Hong-bo5,MO Zi-yao5(1．College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou510640,Guangdong;2．Diao Bio-Technology Co．Ltd,Guangzhou510663,Guangdong;3．Guangdong Research Institute for Mycobacterium tuberculosis Control,Guangzhou510630, Guangdong;4．Dongguan Hospital for Chronic
核酸环介导等温扩增技术
作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院(蔡哲钧、冯杰雄);310006杭州,浙江大学医学院(朱圣禾)?综述? 核酸环介导等温扩增技术 蔡哲钧综述 冯杰雄 朱圣禾审校 【摘要】 介绍环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景。环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可检测乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、水痘2带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒、结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。 【关键词】 核酸类; 基因扩增 上世纪90年代以来,出现了几种新的核酸扩增方法:核酸等温扩增法(nucleic acid sequence2based amplification,NAS2BA)、自序列复制法(self2sus2 tained sequence replication,3SR)和链置换扩增法(st rand displacement amplification,SDA)等。Noto2 mi等[1]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(loop2mediated isot hermal amplification,LAM P),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAM P是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。现将该项技术的研究进展作一综述。 L AM P法的原理 该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在15～60min扩增109～1010倍;特异性高,所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的[2]。 1.引物的设计:基于靶基因3′端的F3c、F2c和F1c区以及5′端的B1、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP引物:上游内部引物,由F2区组成,F2区与靶基因3′端的F2c区域互补,与靶基因5′端的F1c区域序列相同。F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。B IP引物:下游内部引物,由B2区组成,B2区与靶基因3′端的B2c区域互补,与靶基因5′端的B1c区域序列相同。 B3引物:下游外部引物,由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。 2.扩增原理:DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下,以FIP引物F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补,以3′末端为起点,通过链置换型DNA聚合酶的作用,一边置换先头FIP引物合成的DNA链,一边合成自身DNA,如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA 链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链,这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,于是发生自我碱基配对,形成环状结构。同时,BIP引物同该单链杂交结合,以B IP引物的3′端为起点,合成互补链,在此过程中环状结构被打开。接着,类似于F3,B3引物从B IP引物外侧插入,进行碱基配对,以3′端为起点,在聚合酶的作用下,合成新的互补链。通过上述两过程,形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列,自然发生自我碱基配对,形成环状结构,于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAM P法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成L AM P法基因扩增循环的起点结构。LAM P 法基因扩增循环:首先在哑铃状结构中,以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。与此同时,FIP引物F2与环上单链F2c杂交,启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样,在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c,B IP引物上的B2与其杂交,启动新一轮扩增。经过相同的过程,又形成环状结构。通过此过程,结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构[2]。 3.L AM P扩增产物的检测:(1)荧光定量检测:利用S Y BR GreenⅠ荧光染料只与双链DNA小沟结合,当它与DNA双链结合时,发出较原先强800～
等温滴定量热法在生命科学研究中应用
等温滴定量热法在生命科学研究中应用 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0. 4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。 ITC的用途 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。 ITC的应用范围 蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RN A相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；…… 加样体积：（实际体积） cell：1.43 ml，syringe：300 μl 准备样品体积（最少量） cell：2 ml，syringe：500 μl 样品浓度cell：几十μM到几mM syringe：几百μM到几十mM 测量Kb范围102-1012 M-1 滴定实验前恒温30-60 min 等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hr 微量热技术(Microcalorimetry)(2008-05-27 19:58:14)
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用 液剂中蛋白药物的稳定的一个重要因素是适当的辅料的选择，适宜的辅料浓度能够在延长药物保质期的同时确保患者的最高的用药安全。尽管过去十年间的文献报道了维持稳定性的一般准则，但是在存储期间辅料如何提升蛋白药物的稳定性，其机制尚未完全明晰。为能合理优化蛋白制剂，掌握有关蛋白-辅料相互作用机理的知识十分重要。 通过微量热技术来研究来探索蛋白-辅料的相互作用，因而被越来越多的应用于生物制剂的研发和优化。通过使用等温滴定量热仪（ITC）和差示扫描量热仪（DSC）等技术，评估与相互作用有关的热力学参数，例如辅料-蛋白的结合，辅料参与下蛋白质伸展等，揭示研发最优制剂所需的重要机理信息。 这里我们列举两个ITC和DSC是怎样辅助蛋白制剂研发的例子。在第一个例子中，使用ITC揭示了聚山梨酯80（常用表面活性剂，通过降低蛋白表面吸附和聚集以稳定蛋白性质）与蛋白X（ProX）之间的相互作用。使用单位点模型拟合ITC数据计算得出结合亲和常数（K A）=1430±260 M-1，结合焓（△H）=-6.3±1.1 kcal/mol，每个ProX 分子结合位点数（n）=2.6±0.3。另外一个例子中，使用DSC和ITC产生的数据集显示在抗菌防腐剂，苯酚存在的条件下，ProX在pH5.7时结构最稳定。因而在上述两个研究中，来自于GE Healthcare生命科学部的等温滴定量热仪ITC200 和差示扫描量热仪VP-Capillary DSC在探寻制备ProX最佳制剂方法方面提供了非常重要的信息。 由于蛋白质分子内在的不稳定性，包括物理不稳定性（伸展、聚集、吸附）和化学降解性（氧化、脱酰胺、断裂），以基于蛋白质的治疗发展面临着巨大的挑战。蛋白的不稳定可以导致蛋白活性降低甚至可能产生潜在的免疫原性。为增加蛋白的稳定性，可以尝试改变蛋白所在溶剂的性质，包括选择缓冲液系统，调节pH值，添加辅料/添加剂，即研发最佳剂型。 选择适当的赋形剂并优化赋形剂浓度是蛋白药物的溶剂稳定性的一个重要因素，可以增加用药的安全性并延长保质期。因而蛋白药物制剂研发的一个重要环节是赋形剂的选择，需满足以下条件，合适的溶解度，无毒，可维持蛋白结构的完整，保证较长的保质期，以及保持产品的生物活性。这样的辅料包括氨基酸、盐、金属、表面活性剂、糖，多羟基化合物和聚合物。可作为稳定剂，表面活性剂，抗菌防腐剂或抗氧化剂。赋形剂的稳定作用通常是蛋白特异性并呈现浓度依赖性。
连续等温滴定量热法加速和改善结合实验的新方法
Continuous isothermal Titration Calorimetry - ciTC - a new way to speed up and improve binding experiments Natalia Markova Dan Hallen Biovitrum AB, Stockholm, Sweden inTroDuCTion Microcalorimetric instruments and methods are now essential tools for the general understanding of binding thermodynamics of biological macromolecules and specific bio-logical systems. Provided that the enthalpy of binding is of appropriate magnitude, it is possible to determine affinities, K D , in the order of 10 nM (K=l08 M -1) for 1:1 complexes. One of the most important issues with ITC is the time needed to obtain a full binding iso -therm. ITC inherently suffers from the relatively small number of binding experiments that are possible to perform per day. The focus has so far been on improving calorimetric response time of the instruments by various means, like assigning instrumental time con -stants and applying Tian’s equation to dynamically correct the raw calorimetric signal from a fast step-wise titration 1. Notably, nothing has so far been done to improve the experimen -tal procedure. At the moment 2-3 h is needed to complete an ITC binding experiment. The number of data points that can be obtained, 20-30 points, limits the range of equilibrium constants that can be resolved from the data. For ITC this range is 1 ≤ KC M ≤ 1000, 2,3 where K is the equilibrium constant and C M is the concentration of the reactant in the ves -sel. In this Application Note we show the possibility to shorten the tim e of an ITC experi -ment by slow continuous titration into the calorimetric vessel, cITC. We have applied the methodology to systems that have been suggested as calibra -tion and test reactions for titration calorimetry 4, the binding of Ba 2+ to 18-crown-6 and the binding of 2’CMP to RNAse A. ExPErimEnTal Aqueous solutions of BaCl 2 and 18-crown-6 were prepared at 49.7 mM and 3.1 mM respectively. RNAse A from bovine pancreas (EC 3.1.2.7.5), was dialyzed overnight at 4°C against 1000-fold excess of the buffer (20 mM KAc, 20 mM KCl, pH 5.5), The concen -tration of RNAse A was 23μM and 2’CMP was 291 μM. We used a Thermometric 2277 TAM equipped with a titration unit with a 1 ml stainless steel vessel and a golden propel -ler stirrer. The stirring speed was adjusted to 60 rpm. A 250-μl Hamilton syringe mounted onto a pump (Thermometric 6120 Lund Pump) was used for the injections. The tip of the injection needle was positioned 1 mm above the upper part of the propeller stirrer. In the experiments 900 μl of reactant solution (18-crown-6 or RNAse A) was loaded in the vessel and stirred al 60 rpm. A non-stirred titration unit charged with 900 μl of water was used on the reference side of the microcalorimeter. With the help of the highly flexible injection system from Thermometric the injection rate was optimized to0.135 μl/s. In the analysis of a cITC experiment we use the thermal power, P, which is related to the enthalpy of binding, ΔH, for a 1:1 binding through: P= ?H ––––––– ?V i ( 1 )