流式细胞术彩色图谱
第一章流式细胞仪的结构和原理
第1节流式细胞术发展史
纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15 种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。
流式细胞术的发展简史：
1930年 Caspersson 和 Thorell 开始致力于细胞的计数；
1934年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞数量；
1936年 Caspersson等引入显微光度术；
1940年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；
1947年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；
1949年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；
1950年 Caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：1953年 Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；
1953年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；
1954年 Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器；
1959年B型Coulter计数器问世；
1965年 Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对细胞分类；
1967年 Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法；
1969年Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM(即现在的National Flow Cytometry Resource Labs),发明第一台荧光检测细胞计；
1972年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号；
1975年Kochler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。
从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入21 世纪，流式细胞术作为一门生
物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。
第2节流式细胞仪结构和工作原理
流式细胞仪（Flow cytometry ,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各项相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。
流式细胞仪分为三大类：
一类为台式机，临床型，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，见图1-2-1。
图1-2-1 临床型台式流式细胞仪
（左：BD FACSCalibur—2L，4F；右：Coulter EPICS XL/XL-MCL—1L，4F
中：Partec，cyFlow—1L,3F）
第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图1-2-2、1-2-3。
图1-2-2 大型科研型流式细胞仪
（左：BD，FACSDiVa—14F，four-sorting；右：Coulter EPICS ALTRA—4L,8F；
中：Partec，CyFlow SPACE―2L，6F）
第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。
图1-2-3 目前最新型流式细胞仪
（左上：partec，CyFlow ML―FSC,2xSSC,FL1~FL13；右上：Coulter，Cytomics TM FC 500 左下：FACSAria，FSC，SSC，FL1-FL13；右下：BD，BD LSR，4L，10F）
（一）流式细胞仪的结构
FCM的结构一般分为5部分：
③光学系统；④1-2-4。
图1-2-4 流式细胞仪的光路结构
1、流动室与液流驱动系统
流动室（Flow Chamber 或 Flow Cell）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。
流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息，见图1-2-5。
图1-2-5 FCM的流动室和液流系统
细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)PV（勿略高度的变化），可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。
从图1-2-5可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样
本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流经光照射区的细胞数就增加。
这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图1-2-5），中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（Hi）时，处在样品流不同位置的细胞或颗粒，受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测量误差。当在测量分辨率要求高时（如DNA分析）应选取用低速（Low）。
2、激光光源与光束成形系统
目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光（light amplification by stimulated emission of radiation , Laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。
激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机FCM的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作任何调节，所以使用者操作十分方便。
3、光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器（见图1-2-6）。
在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片（long-pass filter, LP）、短通滤片（short-pass filtr, SP）及带通滤片（band-pass filter, BP）。
（1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500μm以上的光通过，而500μm以下的光吸收或返回。
（2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。如SP500滤片，将允许500μm以下的光通过，而500μm以上的光吸收或返回。
（3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500表示其允许通过波长范围为475μm-525μm。
图1-2-6 流式细胞仪的光学系统
4、信号检测与分析系统
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。
（1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（side scatter,SSC）
，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数（见图1-2-7）。
①前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
②侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90o方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
图1-2-7 流式细胞仪的散射光图
（
2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量(图1-2-8)。
图1-2-8 激光的作用原理
前向角散射
激光
激光
荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的波长。目前台式机FCM
①荧光信号的线性测量与对数测量
荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT），PMT将光信号转换成电信号。有些厂家不采用PMT，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降低，最高速度不可能超过3 300个细胞/秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此高档仪器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器，如果原来输出是1，当输入增大到原来的十倍时，输出为2；当输入增大到原来的100倍时，输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。
②荧光信号的面积和宽度
所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA含量测量时，采用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。
荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2M期细胞相等，这样得到的测量数据G2M期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。
③光谱重叠的校正
当细胞携带两种荧光素（如PE和FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种荧光间相互干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保光源程序间互不干扰。因此可以避免有第1激光（488nm）激发出的FL1、FL2、FL3和第2 激光（635nm）激发出的FL4间的补偿。当然，FL1、FL2和FL3是来自同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。
5、FCM测量数据的存贮、显示和分析
目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队（list mode）方式。因为目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4个，采用list mode方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000个细胞，所占容量为4×10000个（字或双字）。同时当只检测1个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4的空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直
方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
（1）单参数直方图：
细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogram）来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图1-2-9。
图1-2-9 DNA含量直方图和抗原表达直方图
左图较低道数处细胞峰为G1期细胞，道数为G1期细胞两倍的是G2M期细胞，二者之间是S期细胞。右图100-101（M1）为阴性细胞，而101以上（M2）为阳性细胞。
（2）双参数数据的显示
双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图（dot plot）,等高线图（contour plot）,二维密度图（density plot）。在二维图中，X坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为FSC和SSC组成的点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据。右下图是通过设‘门’分析（gating analysis）得到的FL1和FL2散点图，设‘门’可以是单参数设‘门’，也可以是双参数设‘门’，通过设”门”可以调出其它参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图1-2-10(左)就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图，设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体，再调出免疫荧光的散点图图1-2-10（右）。
散射光图双色标记荧光图
图1-2-10 双参数免疫荧光点阵图
（二）流式细胞仪的主要技术指标
1、荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，一般现在FCM均可达到600个荧光分子。
2、仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV（coeffeient of variation）值来表示：
CV=d/m×100%(d-是分布的标准误差，m-是分布的平均值)
如果一群含量完全相等样本，用FCM来测量，理想的情况下，CV=0，用FCM测量曲线表示为图1-2-11（左），但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的误差，样本在进入流动室时照射光的微弱变化，再加上仪器本身的误差等，实际得到的曲线为图1-2-11（右）。
图1-2-11 仪器分辨率的显示—CV值
CV值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小。一般的FCM在最佳状态时CV 值<2%。CD值的计算，除采用以上计算公式外，还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽，m代表峰顶部的荧光道数；它们与CV值的的关系式如下：
CV=半高峰宽/m×0.4236×100%
上述公式是建立在正态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形，故采用半高峰宽所计算得到的CV值要明显小于前公式得到的CV值，这在实际工作中应引起注意。
3、前向角散射光检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2-0.5μm左右。
4、FCM分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间（dead time）。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达3 000个/s-6 000个/s，大型机已达每秒几万个细胞。
5、FCM分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选速度为300个/s，大型机的FCM最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低；反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或舍的决定。因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。图1-2-12为两种细胞分选原理示意图。
图1-2-12 细胞分选示意图
（左：通道式分选；右：电荷式分选）
(三) 流式细胞仪补偿设置
众所周知，流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算机统计处理变为可读数据。
现在流式细胞上常用的荧光素有：
激发波长发射波长
FITC 488nm 525nm
PE 488nm 575nm
PE-TR 488nm 615nm
PE-Cy5.5 488nm 667nm
PE-Cy7 488nm 767nm
（以上五种荧光染料可在Coulter XL或BD Calibur或Partec,PAS,Cyflow，Cytomation,Moflo 机型上使用）
APC 633nm 660nm
APC-Cy 633nm 767nm
(以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如Coulter,Altra或BD Calibur或Partec Cyflow ML或Cytomation, Moflow)
以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为FTIC，PE的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布，FITC受激后多数将光源转变为525nm左右的光；PE多数将其转变为575nm左右的光。故在流式细胞仪中对FITC检测525nm附近的光，对PE则检测575nm
左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。
图1-2-13 受激光照射后FITC和PE分子发射光谱互相干扰图
根据上图中FITC和PE发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时，PE荧光探测器便会误检由FITC发射的575左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入PE荧光信号中，从而引起错误。同样PE受激后也会发出小部分525nm左右的光，进入FITC荧光探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。
现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC、PE等荧光分子性状十分相近，其发射光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以百分比后的数值。如图：
图1-2-14 FITC无PE荧光检测补偿调节示意图
图1-2-15 PE无FITC荧光检测补偿调节示意图
其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做FITC、PE、PE-Cy5三色荧光分析原则上需要调节的补偿有：FITC-%PE，PE-%FITC，PE-Cy5-%FITC，PE-Cy5-%PE，FITC-% PE-Cy5，
PE-% PE-Cy5六组补偿，即有23种组合。
由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以525nm或其他波长的光信号可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿过程中的百分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0。由此补偿的百分比数值将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。
要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。如现进行FITC、PE双色分析，先准备该试剂的阴性对照管：
A：IgGFITC/IgGPE，通过调节电压，使阴性群体落在FTIC及PE双阴性区。（注：在进行调补偿时，必须将原补偿全部归零）
图1-2-16 PE和FITC分子的阴性对照
阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。当荧光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号），和特异性结合信号。所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围。
B： FITC
图1-2-17 未调补偿的双参数直方图
上图为未调补偿的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只含有PE标记的IgG阴性对照（如同A管一样），所以仍将没有何任信号出现。但实际情况并不如此，在PE坐标上出现了阳性信号。这个信号就是由于FITC荧光漏入PE探测器中而引起的。此时就要取一合适百分比与FITC信号相乘后去抵消PE中的信号。（此时电压已通过阴性对照设定，绝对不可变动！）
通过调节补偿参数如下图：
图1-2-18 A管FITC荧光信号补偿的调节
打个比方，通过A管已将FITC、PE的荧光信号设为零；此时检测FITC标记抗体与PE 阴性对照，FITC信号假设为1000，漏入PE的信号为200。在补偿调节1号位时，补偿数字为5%，通过计算得出PE信号：200-1000x5%=150；此时1号位的补偿不足。同理2号位的补为15%，此时PE信号为：200-1000x15%=50；补偿仍显不足。3号位的补偿为20%，PE信号为：200-1000x20%=0，补偿调节良好。4号位补偿为30%，PE信号为：200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头，PE的信号会比原来的本底还低。补偿调节不足或过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出现。
当将FITC漏入PE的信号恰好全部减除时，即PE信号与原来本底相同时，此时的补偿便是正确的；即FITC单阳性细胞的PE的平均荧光强度与双阴性细胞PE荧光强度一致。
图1-2-19 FITC/PE双阴和FITC单阳荧光示意图
对于FITC阳性细胞，通过调节补偿需将PE中的信号恢复至与其本底一至。由上图可知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过A管调节电压确定阴性范围。其次，在检测FITC标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将PE
的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿。
同理，如检测C管：FITC阴性对照/PE标记抗体，可将PE漏入FITC中荧光去除。但前提条件是在C管中要存在FITC/PE双阴性细胞和PE单阳性细胞。
图1-2-20 FITC/PE双阴和PE单阳荧光示意图
在流式细胞上，当PE单阳性细胞的FITC平均荧光强度与双阴性细胞的FITC平均荧光强度一致时，补偿便调节完毕。
在做多色分析时，必须做荧光之间的补偿。方法如上，先准备各种标记的荧光阴性对照，调节确定合适的放大电压。逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。
在日常工作中，我们可以用CD4/CD8，或CD3/CD4/CD8多色抗体来调节荧光补偿。现将其原理及方法解释如下。
在人外周血中，存在有T、B、NK等白细胞。当加入CD3-PE-Cy5/CD4-FITC/CD8-PE 三色荧光抗体时，会出现以下几种情况：
CD3-/CD4-/CD8-细胞群：如B细胞
CD3+/CD4-/CD8-细胞群：如NK细胞
CD3+/CD4+/CD8-细胞群：如辅助型T细胞
CD3+/CD4-/CD8+细胞群：如杀伤型T细胞
由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调节补偿的基本要求。已知不存在CD3-/CD4+和CD3-/CD8+阳性细胞，又已知PE-Cy5对于PE和FITC的干扰很小，所以不用考虑CD3-PE-Cy5荧光对CD4-FITC、CD8-PE荧光的干扰（不会有假阳性存在）。补偿调节如下：
图1-2-21 CD3-PE-CY5、CD4-FITC和CD8-PE荧光相互干扰的补偿
在许多实验中，会用到某一标记物进行设”门”情况。此时最终观察的单参数结果而非双参数，所以往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清楚地理解补偿的形成及调节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设”门”的实验方案。
第二章流式细胞术样品制备及分析技术
第1节样本单细胞悬液的制备方法
一、新鲜实体组织样本的制备
FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。现在已有专门的样本制备仪（见图2-1-1），但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
图2-1-1 流式细胞术自动细胞分离器（BD，Medmachine）
（一） 酶消化法
1、作用原理：
对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2、注意事项：
①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的pH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
3、方法学程序
（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；
（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；
（3）一般消化20-30 min（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；
（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞碎片；
（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。
（二）机械法
机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。1、剪碎法：
（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；
（3）加入10ml生理盐水；
（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
（5）离心沉淀1000 rpm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800 rpm）短时离心沉淀去除细胞碎片；
（6）以300目尼龙网滤去细胞团块；
（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。
2、网搓法
（1）将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；
（2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
（3）收集细胞悬液，500-800 rpm离心沉淀2min；
（4）固定细胞或低温保存备用。
3、研磨法
（1）先将组织剪成1-2 mm3大小组织块；
（2）放入组织研磨器中加入1-2 ml生理盐水；
（3）转动研棒，研至匀浆；
（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 rpm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀；
（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。
（三）化学处理法
1、作用原理
化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
2、试剂的配制
（1） 0.2%EDTA配制：称EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4℃保存；
（2）胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0.2g 加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。
3、实验方法
（1）将组织切成薄片，置入试管中；
（2）首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；
（3）再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒温水浴振荡器内30min；
（4）用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000 rpm，5min。再以生理盐水洗2-3次；
（5）细胞固定或低温保存备用。
以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。
（四）注意事项
1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织
坏死以及细胞自溶，影响FCM测定结果；
2、根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的
不稳定；
3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方
面对酶消化法的影响。
4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞
瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；
往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；
5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺
癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca2+、Mg2+存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。
二、组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备
正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。
1、取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；
2、另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新
鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取3块以上；
3、在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；
4、先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细
胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS 液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；
5、细胞加固定液或低温保存，备用。
三、石蜡包埋组织样本的制备
石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。
1、实验方法：
（1）把石蜡包埋组织切成40-50um厚的组织片3-5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中；
（2）加入二甲苯5-8ml, 在室温下脱蜡1-2 天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；
（3）水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10 min，去乙醇，加入蒸馏水3-5 ml，10 min 后弃之；
（4）消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，在消化期间，每隔10min 用振荡器振荡1次；
（5）消化30 min 后，立即加生理盐水终止消化；
（6）经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2次消化；
（7）收集细胞悬液，离心沉淀1500 rpm ,再以生理盐水漂洗1-2 次，离心沉淀500-800 rpm 去碎片；
（8）保存细胞备用。
2、注意事项
（1）一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1遍应在12小时左右，第2遍为30min左右。检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净；反，则蜡尚未脱净；
（2） 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；
（3） 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。（4）消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用尖吸管吹打成悬液状；
（5）消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在300目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。
四、外周血单个核细胞样本的制备
血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。它是流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多见。
1、外周血细胞样本制备方法的选择
一般检测细胞大分子成分——DNA、RNA、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细胞表面标志检测可采用溶红细胞法。
2、单个核细胞样品制备程序
（1）取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 ml ,混匀；
（2）将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；
（3）离心2000rpm,30min,室温18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4 层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；
（4）用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍，每次均以1500 rpm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；
（5） 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。
五、骨髓细胞单细胞悬液的制备
1、制备方法
（1）无菌抽取骨髓液0.5 ml；
（2）将骨髓标本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中；
（3）再加入PBS液稀释至10ml；
（4）用吸管吸取5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；（5）在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；（6）吸取有核细胞层，加入到10 ml PBS液中，混匀；
（7）以1000 rpm 离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。
2、注意事项
（1）抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中；
（2）在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在300 ul 左右，这样有利于洗去多余的分层液；
（3） 溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现，立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。
六、培养细胞的单细胞悬液的制备
1、培养细胞的特征
一般细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细胞团块或连接成片。如果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响FCM结果，进而导致实验失败。所以，制备合格的培养细胞单细胞悬液十分重要。
2、培养细胞样品的制备程序：
（1）将培养细胞用0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根据室温情况而定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加PBS液；
（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；
（3）短时低速离心，即800-1000 rpm，5 min；
（4）弃上清，加pH 7.4的PBS液5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 min ；重复2- 3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；
（5）加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。
七、脱落细胞样品单细胞悬液的制备
在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。
流式细胞术原理及功能介绍
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞术临床应用
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞术临床应用
流式细胞术得临床应用 一、在肿瘤学中得应用 这就是FCM在临床医学中应用最早得一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞得DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA与RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到得与DNA结合得PI得荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量得多少。由于细胞周期各时相得DNA含量不同，通常正常细胞得G1 / GO 期具有二倍体细胞得DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞得DNA含量((4 N)，而S期得DNA含量介于二倍体与四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期与G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相得百分率，DNA含量直接代表细胞得倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变得漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常得体细胞均具有比较稳定得DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能得癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量得异常改变，FCM可精确定量DNA含量得改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中得一个有价值得标志，能对癌前病变得性质及发展趋势作出估价，有助于癌变得早期诊断。有资料证实，癌前病变得癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度得加重，DNA非整倍体出现率增高，这就是癌变得一个重要标志。 2、在肿瘤得诊断、预后判断与治疗中得作用 FCM在肿瘤诊断中得重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰得存在可为肿瘤诊断提供有力得依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后得判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变得复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤得预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图得变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要得意义。临床医师可以根据细胞周期各时相得分布情况，依据化疗药物对细胞动力学得干扰理论，设计最佳得治疗方案，从DNA直方图直接地瞧到瘤细胞得杀伤变化，及时选用有效得药物，对瘤细胞达到最大得杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡与多药耐药基因得研究中得作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡得早期阶段，胞浆膜磷脂得不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异得Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不就是细胞凋亡特有得，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡得早期细胞膜就是完整得，而细胞坏死时细胞膜得完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整得活细胞与早期凋亡细胞就是拒染得，而对膜完整性被破坏得晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死与
流式细胞术胞内因子检测的关键控制因素
前言 由于胞内分析步骤复杂，涉及变异因素多，可能会出现结果不稳定，较难重复等问题。 我们提出这些分析关键因素，希望能帮助大家排除实验过程中一些问题，这些控制因素不仅适用 于细胞因子分析，也可扩展到其他细胞生物学研究领域，如胞内信号传导，凋亡等。 1、刺激与收获细胞 许多胞内与胞外蛋白的表达的调控都与细胞激活有关，细胞因子更为突出，因为通常情况 下，未刺激的白细胞不表达细胞因子或表达量极微无法检测，研究者必须采用体外激活以刺激细 胞因子的表达。多克隆激活剂可以诱导多种细胞因子分泌细胞，这些细胞经荧光染色可在流式细 胞仪上定群检出。使用蛋白转运抑制剂至关重要因为它有助于细胞因子聚集，提高检出率。每个 研究者都应根据实验系统慎重选择激活方法（刺激剂类型、反应时间曲线等）。 ●蛋白转运抑制剂的选择 蛋白转运抑制剂可以通过增强胞内细胞因子聚集因而使胞内染色信号增强。常用蛋白转运抑制剂有两种： Monensin , 一种离子载体，可以破坏跨膜离子梯度。 Brefeldin A ，一种真菌代谢物，可以干扰囊泡自粗面内质网至高尔基体的转运。 研究者应依据研究目的选择适宜的蛋白转运抑制剂。 2、 Fc受体阻断 使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色。在小鼠可以应用纯化的抗小鼠 CD16/32（Clone2.4G2）直接作用于FcγII/III受体。在大鼠可以用纯化的抗大鼠CD32 直接作用 于Fcγ受体。在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。 3、细胞表面荧光染色 特异的荧光标记抗体与细胞孵育标记细胞表面抗原,最好用含NaN 3及蛋白（FBS或BSA）的 染色缓冲液稀释抗体。可按 PBS+1%FBS+0.1%NaN 3 pH7.4，配制洗涤缓冲液。 4、细胞固定及通透 细胞胞内染色前必须固定通透，细胞通透同时或之前必须固定以保持细胞结构的完整性。 固定剂主要成分为多聚甲醛，通透剂主要成分为皂素。这是两个比较重要的试剂，实验中最好设 置阳性对照以验证这两个试剂的有效性。 5、荧光结合抗体胞内染色 胞内抗原染色取决于正确选用及确认与固定通透过程相容的特异性单抗，这些可供选择 的单抗有多种形式，FITC，PE，APC，为研究者进行多色分析提供可能。每一抗体都经过特殊测 试确保其对胞内抗原染色最佳适于流式细胞分析。胞内染色的质量极大程度取决于每个荧光标记 抗体的最适反应浓度，应尽量选择预先滴定好的抗体以减少实验操作时间，保证细胞因子的有效 检测。 ●荧光素的选择
流式细胞术的原理及临床应用
流式细胞术的原理及临床应用 马洪星1 张春斌2 汪晶冰1 庞玉军1 张丽岩2 (1.黑龙江省大庆油田总医院检验科,163001 2.黑龙江省佳木斯大学基础医学院生物教研室)中图分类号: R331 文献标识码:A 文章编号:1006-9534(2003)04-0145-02 流式细胞术(flow cytometry)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术,它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以同时测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域内发挥着重要作用[1]。 一、流式细胞仪检测的原理[2,3] 流式细胞仪主要包括以下几个组成部分:激光系统、流动系统、信号处理及放大的系统、计算机系统。当待测标本被制成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力是不同的,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理、就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。 二、流式细胞仪在免疫学中的应用[4] (1)淋巴细胞亚群分析:淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群。各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群(包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+)区分开来,并计算出CD4+/CD8+的比例,可通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态,指导治疗。 (2)感染及其疗效观察:由于T淋巴细胞在人体的免疫系统中承担着重要功能,因此当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态和程度。当病毒感染发生时(如乙型肝炎.EB病毒和巨细胞病毒)CD8+细胞增多,对CD8+T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。 (3)流式细胞仪可以对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、、CD25+持续增加提示已开始发生排异,CD4/CD8持续下降,表明有感染发生,当其比值小于012时必须停用免疫抑制剂。 (4)免疫性疾病分析:SL E患者的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度,活动或非活动性伴有多系统疾病,但无肾脏损害的患者可出现CD4/CD8T比值增高,伴有严重肾脏损害的SL E患者可出现低CD4+。高CD8+的现象。 (5)利用流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿(PHA),根据血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)所连接的蛋白,如DFA(CD55)与MIRI(CD59),来确诊此病,比传统的血清溶血试验具有更高的特异性与敏感性。 (6)HLA群体分析:FCM运用HLA-B27特异性单克隆抗体检测抗原,其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高,有助于强直性脊柱炎的辅助诊断。 (7)AIDS中的应用:用于CD4+细胞的绝对计数(CD4+阳性细胞是HIV病毒特异侵染细胞),另外还可以监测病程和治疗过程中患者的免疫状态,估计预后。 三、FCM在细胞生物学中的应用 (1)细胞周期分析 在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DAN异倍体。 (2)可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是p H值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内p H值测定。 四、FCM在肿瘤中的应用 (1)肿瘤诊断 DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志。细胞的增值能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍体分析。辅助肿瘤诊断,包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面[5]。 (2)肿瘤预后估计 异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道,在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中,异倍体和/或较高的S期比率都是不良的预后标志。同样地,在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中,亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上,用流式细胞仪监测肿瘤
流式细胞术及其应用_百替生物
流式细胞术及其应用 作者：贾宇臣 第一部分流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点
FACSCalibur 临床型（台式机） 特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢，主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa 科研型（大型机） 特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria 科研型 特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析 流式细胞仪检测范围
临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 -光学系统 激光光源 光收集系统 -液流系统 流动室 液流驱动系统 -电子系统 光电转换 数据处理系统 -细胞分选系统 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
流式细胞术的临床应用
一、诊断性指标
如图1所示，图（左）白血病细胞成为一个单一的群体，很难区分原始或病态的白血病细胞和成熟的细胞。但是通过CD45和（SSC）设门法之后（图右），看到图（左）无法区分细胞被分成了五群。在这五群中，成熟细胞CD45表达的荧光比较强。A门里是淋巴细胞，B门里是单核细胞，C门里就是粒细胞群，D门里是原始细胞，一般CD45表达较弱。一些细胞碎片、红细胞和转移来的瘤细胞，由于不表达CD45，可能位于D门、D门偏下或者E门的位置。CD45结合侧向散射光之后能把白血病细胞找出来，减少了其它细胞的干扰。对D门里的白血病细胞做进一步的分型，就能准确看到白血病细胞群免疫分型的表达情况。 图1 3.白血病的特异性标志 免疫表型分析主要是根据细胞的特异表面标志，把白细胞分成T细胞、B细胞和原始细胞。 T淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD3、抗TCRαβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8 、CD10和CD7；B淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD79a、CD22、CD19 、CD10和CD20；髓系白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有CD16、CD56和CD57；红白血病一般表达的分化抗原有GlyA和CD36；巨核细胞白血病一般表达的分化抗原有CD41、CD42和CD61；一系列非特异标志在不同的白血病中可能都有表达，尤其是表达在早期的造血干组细胞上，一般表达的分化抗原有CD34和HLA-DR。 其中，对T淋巴细胞白血病来讲比较特异的是胞浆内的CD3，当胞浆内CD3出现阳性的时候，高度怀疑是T淋巴细胞白血病。对于B淋巴细胞白血病来讲，胞浆内的CD79a和CD19是比较特异的，cCD79a最具特异性。cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。cMPO是髓系特异标志。 如图2所示为B-ALL的表达图。白血病免疫分型采用的是CD45和侧向散射光的设门方案，通过CD35和侧向散射光设门可以准确地找到一群CD45表达较弱的白血病细胞，也就是D门里的细胞。把D门的细胞再做进一步的分型，发现表达CD19、CD10和HLA-DR。这是B淋巴细胞白血病的表型分析。
流式细胞术临床检测项目操作流程
临床检测项目操作流程 1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定 3：CD55／CD59测定 4：血小板抗体测定 5：红细胞抗体测定 6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定 8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 9：XL操作步骤 淋巴细胞亚群测定 (CD系列) 方法 流式细胞仪(BD) 原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。 标本采集与处理 受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。 抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血 要求： 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS
稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 4．溶血样本不能用。 试剂 品牌规格贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃ 2：全血溶血试剂 A：甲酸70ML 室温 B：碳酸钠等32ML 室温 C：多聚甲醛14ML 室温 3：鞘液 20L 室温 4：清洗液 5L 室温 5：荧光微球 10ML 2-8℃ 质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 样本制备： 1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟。 4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)。 5) 上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样。 操作性能 精密度批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)
流式细胞术及其应用教程
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限
流式细胞术简介
流式细胞术简介 一、流式细胞术发展简史 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； ②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。 流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。 近20年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FCM的应用领域和使用效果。 二、流式细胞计的基本结构和工作原理 流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理 1a 4b 2c 3d 样品荧光标记的影响因素不包括（）b 抗体使用原则有（）c 以下不属于流式细胞术特点的是（）c 流式细胞术分选指标不包括（）d 流式细胞仪的组成部分包括（）d 流式细胞仪检测荧光信号的特征是（）b 流式细胞仪种类包括（）b 流式细胞仪细胞分选系统的分选方式有（）b 流式细胞仪光收集系统的滤光片种类不包括（）d 流式细胞术研究的对象为（）a 流式细胞术的临床应用 2a 1b 3c 4d 白血病和淋巴瘤免疫表型分析的设门方案为（）c 用来监测肿瘤发生发展和判断预后的指标是（）a 髓系特异标志是（）d 所谓的Ⅲ型细胞就是CD59表达（）d 判断血小板活化状态的指标是（）c 巨核细胞白血病一般表达的分化抗原不包括（）d 可以评价贫血治疗前后和移植前后红细胞生成情况的是（）d 用来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）及鉴别其他贫血的重要的指标是（）c 当HIV感染病情凶险的时候，CD4+的T细胞通常低于（）个/mm3 a 对T淋巴细胞白血病比较特异的是（）b
流式细胞术在细胞凋亡检测中应用 2a 2c 6d 流式细胞术的应用技术分为：细胞表面分子或抗原的检测、细胞内分子或抗原的检测和（）检测 d 下述说法中，错误的是（）a 有关CBA在临床应用中的说法，错误的是（）c CBA的标本不能是（）a 利用细胞膜结构改变检测凋亡细胞时，采用的染料为（）d 新型细胞凋亡常用的染料是（）d 通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数:（），和细胞周期当中其它时相的百分率 d 下列有关CBA的原理的说法中，错误的是（）d 进行细胞因子检测时，应用（）进行处理 c 有关细胞内分子或抗原分析的说法中错误的是（）d 流式细胞术质量控制 1a 3b 2c 4d 关于免疫荧光染色制备样本的保存说法错误的是（）b 荧光信号脉冲面积和宽度散点图的应用不包括（）c 关于直标抗体的说法错误的是（）c 理论上是理想的对照的是（）a 性能指标的评价顺序是（）d 关于细胞内免疫荧光染色说法错误的是（）d 关于组织标本制备的说法错误的是（）b 关于分析和报告参数说法错误的是（）d 细胞量与抗体量需要达到最适比例，待测靶细胞的最佳浓度是（）b 关于精密度及其校准微球（）d